1、混匀。 3.5 试验步骤 3.5.1 称样 称取原料、 配合饲料、 浓缩饲料1g 2g, 精确至0. 0 0 1g, 置于1 0 0m L棕色锥形瓶中。 3.5.2 试样溶液的制备 3.5.2.1 水解: 加入盐酸溶液(3.2.1)6 5m L于锥形瓶中, 加塞后置于沸水浴加热3 0m i n 或于高压釜 ( 3.3.2)中加热3 0m i n , 开始加热5m i n 1 0m i n内不时摇动锥形瓶, 以防结块。 3.5.2.2 酶解: 冷却锥形瓶至5 0以下, 加5m L淀粉酶悬浮液(3.2.4) , 摇匀。该溶液 p H 约为4. 0 4.5,将锥形瓶至于电热恒温箱(3.3.4) 中4
2、 55 0保温3h, 取出冷却, 用盐酸溶液(3.2.1) 调整 p H 至3. 5, 转移至1 0 0m L棕色容量瓶中, 用水定容至1 0 0m L, 摇匀。 3.5.2.3 过滤: 将全部试液通过无灰滤纸过滤, 弃去初滤液5m L, 收集滤液作为试样溶液。 3.5.3 试样溶液的纯化 3.5.3.1 制备吸附柱: 称取1.5g活化人造沸石(3.2.1 2) 置于5 0m L小烧杯中, 加入3%冰乙酸溶液 ( 3.2.1 0)浸泡, 溶液液面没过沸石即可。将脱脂棉置于吸附分离柱(3.3.5) 底部, 用玻璃棒轻压。然后将 乙酸浸泡的沸石全部洗入柱中( 勿使吸附柱脱水) , 过柱流速控制在1
3、m L/m i n为宜。再用1 0m L近沸 的水洗柱1次。 3.5.3.2 吸取2 5m L试样溶液(3.5.2.3) , 慢慢加入制备好的吸附柱中, 弃去滤液, 用每份5m L近沸的 水洗柱3次, 弃去洗液。同时做平行样。 3.5.3.3 用2 5m L6 07 0酸性氯化钾溶液(3.2.6) 分3次连续加入吸附柱, 收集洗脱液于2 5m L 容量瓶中, 冷却后用酸性氯化钾溶液定容, 混匀。 3.5.3.4 同时用2 5m L维生素B1标准工作液(3.2.1 3.3) 。重复3.5.3.13.5.3.3操作, 作为外标。 3.5.4 氧化与萃取 警示 以下操作避光进行。 3.5.4.1 于
4、2只具塞离心管(3.3.6) 中各吸入5m L洗脱液(3.5.3.3) , 分别标记为A、B。 3.5.4.2 在B管加入3m L氢氧化钠溶液(3.2.7) , 再向A管中加3m L碱性铁氰化钾溶液(3.2.9) , 轻轻 旋摇。依次立即向A管加入1 5m L正丁醇(3. 2.1 5) 加塞, 剧烈振摇1 5s, 再向B管加入1 5m L正丁醇 加塞, 共同振摇9 0s, 静置分层。 3.5.4.3 用注射器(3.3.8) 吸去下层水相, 向各反应管加入约2g无水硫酸钠, 旋摇, 待测。 3.5.4.4 同时将5m L作为外标的洗脱液(3.5.3.4) , 置入另2只具塞离心管, 分别标记为C
5、、D, 按 3.5.4.13.5.4.3操作。 3.5.5 测定 3.5.5.1 用硫酸奎宁工作液(3.2.1 4.2) 调整荧光仪, 使其固定于一定数值, 作为仪器工作的固定条件。 3.5.5.2 于激发波长3 6 5n m, 发射波长4 3 5n m处测定A管、B管、C管、D管中萃取液的荧光强度。 3.6 试验数据处理 本方法测定的维生素B 1以硝酸硫胺素计, 如需要以盐酸硫胺素计, 按1m g盐酸硫胺素含1.0 3m g 硝酸硫胺素换算。 3 G B/T1 4 7 0 02 0 1 8 订单号：0100180613021369 防伪编号：2018-0613-0910-5447-5475
6、购买单位: YTFMT YTFMT 专用 试样中维生素B 1含量按式(1) 计算: wi=T 1-T2 T3-T4 V 2 V1 V 0 m (1) 式中: wi 试样中维生素B1的含量, 单位为毫克每千克( m g / k g ) ; T1 A管试液的荧光强度; T2 B管试液空白的荧光强度; T3 C管标准溶液的荧光强度; T4 D管标准溶液空白的荧光强度; 维生素B 1标准工作液浓度, 单位为微克每毫升(g /m L) ; V0 提取液总体积, 单位为毫升(m L) ; V1 分取溶液过柱的体积, 单位为毫升(m L) ; V2 酸性氯化钾洗脱液体积, 单位为毫升(m L) ; m 试样
7、质量, 单位为克( g) 。 测定结果用平行测定的算术平均值表示, 保留三位有效数字。 3.7 重复性 对于维生素B 1含量低于5m g / k g 的饲料, 在重复性条件下, 获得的2次独立测定结果与其算术平 均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的1 5%; 对于维生素B 1含量大于5m g / k g 而小于5 0m g/ k g 的饲料, 在重复性条件下, 获得的2次独立测 定结果与其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的1 0%; 对于维生素B 1含量大于5 0m g / k g 的饲料, 在重复性条件下, 获得的2次独立测定结果与其算术 平均值的差值不大于这两个测定值算术平
8、均值的5%。 4 方法2: 高效液相色谱法 4.1 原理 试样经酸性提取液超声提取后, 将过滤离心后的试液注入高效液相色谱仪反相色谱系统中进行分 离, 用紫外( 或二极管矩阵检测器) 检测, 外标法计算维生素B 1的含量。 4.2 试剂或溶液 除特殊说明外, 所用试剂均分析纯, 色谱用水符合G B/T6 6 8 2中一级用水规定。 4.2.1 氯化铵: 优级纯。 4.2.2 庚烷磺酸钠(P I C B7) : 优级纯。 4.2.3 冰乙酸: 优级纯。 4.2.4 三乙胺:色谱纯。 4.2.5 甲醇:色谱纯。 4.2.6 酸性乙醇溶液:2 0%, 制备见3.2.1 1。 4.2.7 二水合乙二胺
9、四乙酸二钠(E D T A) : 优级纯。 4.2.8 维生素预混合饲料提取液 : 称取5 0m gE D T A(4. 2.7) 于10 0 0m L容量瓶中, 加入约10 0 0m L去离子水, 同时加入2 5m L冰 乙酸( 4.2.3) 、 约1 0m L三乙胺(4.2.4) , 超声使固体溶解, 调节溶液p H34, 过0.4 5m滤膜, 取 8 0 0m L该溶液, 与2 0 0m L甲醇混合既得。 4 G B/T1 4 7 0 02 0 1 8 订单号：0100180613021369 防伪编号：2018-0613-0910-5447-5475 购买单位: YTFMT YTFMT
10、 专用 4.2.9 复合预混合饲料提取液: 称取1 0 7g氯化铵(4. 2.1) 溶解于10 0 0 m L水中, 用2 m o l /L盐酸调节溶液 p H 为34。取 9 0 0m L氯化铵溶液与1 0 0m L甲醇混合既得。 4.2.1 0 流动相: 称取庚烷磺酸钠( 4.2.2)1.1g、5 0m gE D T A于10 0 0m L容量瓶中, 加入约10 0 0m L水, 同时加入 2 5m L冰乙酸(4.2.3) 、 约1 0m L三乙胺(4.2.4) , 超声使固体溶解, p H 计调节溶液 p H 为3. 7, 过 0.4 5m滤膜, 取8 0 0m L该溶液, 与2 0 0
11、m L甲醇(4.2.5) 混合既得。 4.2.1 1 维生素B1标准溶液 4.2.1 1.1 维生素B1标准贮备液: 制备过程同3.2.1 3.1。 4.2.1 1.2 维生素B1标准工作液A: 准确吸取1m L维生素B1标准贮备液(4.2.1 1.1) 于5 0m L棕色容 量瓶中, 用流动相( 4.2.1 0) 定容至刻度, 该标准工作液浓度为2 0g/m L, 该溶液存于28冰箱可 以使用4 8h。 4.2.1 1.3 维生素B1标准工作液B: 准确吸取5m L维生素B1标准工作液A(4.2.1 1.2) 于5 0m L棕色容 量瓶中, 用流动相( 4.2.1 0) 定容至刻度, 该标准
12、工作液浓度2.0g/m L, 该溶液使用前稀释制备。 4.3 仪器设备 4.3.1 实验室常用玻璃器皿。 4.3.2 p H计( 带温控, 精准至0.0 1) 。 4.3.3 超声波提取器。 4.3.4 针头过滤器备0.4 5m( 或0.2m) 滤膜。 4.3.5 高效液相色谱仪带紫外或二极管矩阵检测器。 4.4 样品 按照G B/T1 4 6 9 9. 1抽取有代表性的饲料样品, 用四分法缩减取样。按G B/T2 0 1 9 5制备试样, 充 分混匀。 4.5 试验步骤 警示 避免强光照射。 4.5.1 提取 4.5.1.1 维生素预混合饲料的提取 称取试样0. 2 5g 0.5g( 精确到0.0 0 01g) , 置于1 0 0m L棕色容量瓶中, 加入提取液(4.2.8) 约 7 0m L,边加边摇匀, 置于超声水浴中超声提取1 5m i n, 期间摇动2次, 冷却, 用提取液定容至刻度, 摇 匀。取少量溶液于离心机上80 0 0r/m i n离心5m i n, 上清液过0. 4 5m微孔滤膜, 上H P L C测定。 4.5.1.2 复合预混合饲料的提取 称取试样约3. 0g( 精确到 0.0 0 1g) , 置于1 0 0m L棕色容量瓶中, 加入提取液(4.2.
