1、ICS 11.020 C 62 DB32 江苏省地方标准 DB 32/T 3762.102020 新型冠状病毒检测技术规范 第 10 部分：微量血清中和试验 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 10: Serum microneutralization test 2020 - 07 - 29 发布 2020 - 07 - 30 实施 江苏省市场监督管理局 发 布 DB32/T 3762.102020 I 前 言 DB32/T 3762新型冠状病毒检测技术规范目前分为以下部分： 第1部分：生物样本采集、运输和保存； 第2部
2、分：病毒分离与鉴定； 第3部分：核酸荧光PCR检测程序； 第4部分：重组酶介导等温扩增程序； 第5部分：血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序； 第6部分：血清IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测程序； 第7部分：空气样本检测与评估； 第8部分：物体表面检测与评估； 第9部分：医务人员职业暴露检测与评估； 第10部分：微量血清中和试验； 第11部分：全基因组高通量测序。 本部分为DB32/T 3762 的第10部分。 本部分按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本部分由江苏省卫生健康委员会提出。 本部分由江苏省卫生标准化技术委员会归口。 本部分起草单位： 江苏省疾病预防控制中心
3、、 南京医科大学、 苏州第五人民医院、 苏州大学附二院、 昆山市疾病预防控制中心。 本部分主要起草人：葛以跃、崔仑标、迟莹、郭喜玲、陈银、朱宝立、程军平、钱志远、罗晓明、 沈欢喜。 DB32/T 3762.102020 1 新型冠状病毒检测技术规范 第 10 部分：微量血清中和试验 1 范围 本部分规定了新型冠状病毒微量血清中和试验环境与设施、设备与耗材、试剂与材料、操作步骤、 结果判定和清场与消毒。 本部分适用于新型冠状病毒实验室微量血清中和试验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新
4、版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国国家卫生健康委员会 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 微量血清中和试验 serum microneutralization test 将病原体及其产物（毒素）与免疫血清相混合，在体内或体外检测其致病力的试验，用以检查动物 的免疫状态，测定抗原滴度，以及病原鉴定等。 3.2 细胞病变效应 cytopathic effect，CPE 病毒在宿主细胞内大量增殖， 导致细胞病变甚至死亡的现象。 大多数病毒感染敏感细胞培养都能引 起其显微镜下表现的改变， 如细胞聚集成团肿大圆缩脱落及细胞融合成为多核细
5、胞， 细胞内出现包涵体， 乃至细胞裂解等。 3.3 半数组织培养感染剂量 median tissue culture infective dose (TCID50) 能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡所需的病毒量，用以表征病毒的滴度。 4 环境与设施 4.1 实验室资质及级别要求 DB32/T 3762.102020 2 应符合新型冠状病毒实验室生物安全指南的要求，病毒培养包括病毒的分离、培养、滴定、 中和试验等实验操作应当在生物安全三级实验室（BSL-3）的生物安全柜内进行。实验室开展相关活动 前，应当报经国家卫生健康委批准，取得开展相应活动的资质。 4.2 操作人员资质及防护要求
6、实验操作人员应经过生物安全培训并取得BSL-3实验活动上岗证，在身体健康状态良好的情况下经 实验室主任批准后方可开展活动。操作人员应根据新型冠状病毒实验室生物安全指南要求，按照 BSL-3个人防护的要求进行防护。 5 设备与耗材 5.1 设备 生物安全柜、离心机、倒置显微镜、涡旋器、冰箱、CO2培养箱等。 5.2 耗材 N95及以上防护口罩、医用无纺布帽、护目镜、连体防护服、一次性PE手套、一次性手术衣、乳胶 手套、防水靴套、微量移液器及各种配套带滤芯Tip头、一次性平皿、离心管、96孔细胞培养板等。 6 试剂与材料 6.1 试剂 6.1.1 Hanks 溶液（每毫升含青霉素、链霉素各 200
7、0 单位） 6.1.2 DMEM 培养液（含 10%胎牛血清）。 6.1.3 DMEM 维持液（含 2%胎牛血清）。 6.1.4 消化液 （0.25%胰酶和 0.025% EDTA-Na2混合液）。 6.2 材料 6.2.1 已滴定的新型冠状病毒悬液。 6.2.2 阳性对照血清、阴性对照血清（正常血清）及待检血清。 6.2.3 非洲绿猴肾传代细胞（VERO-E6）、人呼吸道上皮细胞、人肝癌细胞（Huh7）或其它敏感细胞。 7 试验技术要点 7.1 确定实验室质量控制标准的新型冠状病毒病毒株滴度，应至少有三次独立的滴度水平测定结果， 三次实验结果的滴度波动不应超过+/-0.5。 7.2 中和抗体
8、滴度的判定是以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，因此设置对照实验十 分重要。 7.3 采用固定病毒稀释血清的方法进行微量中和试验。 8 操作步骤 8.1 实验前准备 DB32/T 3762.102020 3 8.1.1 将实验所需细胞置 37 5% CO2培养箱培养至单层，在进入 BSL-3 接种病毒前，弃掉细胞培养 液，用 Hanks 溶液洗 3 次。 8.1.2 配备消毒液：75%乙醇、有效氯 5500 mg/L 的含氯消毒液。 8.1.3 将细胞、病毒、血清、试剂和耗材一次性带入 BSL-3 核心区。 8.2 血清稀释 8.2.1 血清的处理：将待测血清、阳性对照血清及阴性对照
9、血清 56 水浴灭活 30 min，为防止管盖 崩开，要用封口膜封管口。待冷却后移至生物安全柜内进行稀释。 8.2.2 在生物安全柜里，将待测血清、阳性对照血清及阴性对照血清用 DMEM 维持液做倍比稀释， 使其稀释度分别为 1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128，每管量为 0.5 ml。每一稀释度必须更 换吸头，吹打混匀。 8.3 病毒稀释 在生物安全柜里，用 DMEM 维持液稀释病毒至 100TCID50/0.1ml。 8.4 血清与病毒结合 8.4.1 在上述各稀释的血清管内加 0.5 ml 病毒稀释液（100TCID50/0.1ml ），充分混匀，拧紧管盖， 用封口膜
10、封口后置 37水浴 1 h。 8.4.2 病毒对照为 0.5 ml 病毒稀释液（100TCID50/0.1ml ）加 0.5 ml 的维持液，同样用封口膜封口后 置 37水浴 1 h。 8.4.3 正常细胞对照不加病毒，仅含 DMEM 维持液。 8.5 接种细胞 8.5.1 弃去细胞培养孔中的 Hanks 液。 8.5.2 将每个稀释度的血清病毒混合物接种到单层细胞上，每一稀释度接种 4 孔，每孔 0.2 ml。 8.5.3 将接种好样品的 96 孔培养板置 37 5% CO2培养箱中培养。 8.6 结果观察 每24 h在倒置显微镜下观察细胞形态变化（CPE），并记录结果，观察5 d7 d，以
11、0%25%细胞 CPE变化为“+”，26%50%细胞CPE变化为“+”，51%75%细胞CPE变化为“+”，76%100%细胞 CPE变化为“+”，正常细胞形态为“-”。以病毒对照出现“+”时，结束试验。 9 结果判定 9.1 质控要求质控要求 正常细胞对照孔应该有完整的细胞单层，病毒对照孔应出现“+”的CPE变化；能够阻止产 生CPE的阳性对照血清可以中和病毒的感染性，故阳性对照血清孔应无CPE，与正常细胞对照孔相同； 阴性对照血清孔的CPE情况应与病毒对照孔相同。 9.2 50%血清中和终点的计算血清中和终点的计算 50%血清中和终点为能保护50%细胞不产生病变的血清最高稀释度，即为中和终
12、点，可按 Reed-Muench法计算结果，参见表1。 DB32/T 3762.102020 4 表1 某新型冠状病毒病人恢复期血清 50%血清中和终点的计算 血清稀释度 细胞病变管数 /总管数 细胞 病变分布 累计 阳性 比例 阳性率（%） （+）管）管 （-）管）管 （+） （-） 1:4 （10-0.6) 1:8 (10-0.9) 1:16 (10-1.2) 1:32 (10-1.5) 1:64 (10-1.8) 1:128 (10-2.1) 0/4 0/4 0/4 1/4 3/4 4/4 0 0 0 1 3 4 4 4 4 3 1 0 0 0 0 1 4 8 16 12 8 4 1 0
13、 0/16 0/12 0/8 1/5 4/5 8/8 0 0 0 20 80 100 注1：计算公式为：lg50%血清中和终点=b+d c, b为小于50%阳性率血清稀释度的对数，d为距离比例，c为稀释系数 的对数，其中d=（50小于50%的阳性率）/（大于50的阳性率小于50%的阳性率）。 注2：本例中：d= (5020)/(8020)0.5，lg50%血清中和终点=-1.5+0.5 (-0.3)=-1.65，-1.65的反对数为1:45，既1:45 的血清可保护50%细胞不产生病变。 10 清场与消毒 10.1 操作结束后，及时清理生物安全柜内的物品，用 75乙醇擦拭外表面后，移出生物安全柜。 10.2 将实验过程产生的所有污染材料经 121，30 min 高压消毒灭菌处理。 10.3 用新鲜配制的有效氯 5500 mg/L 的含氯消毒液擦拭工作台面、生物安全柜内壁及台面，不要擦拭 顶棚，作用后用清水擦拭以除去残余消毒液，关
