1、118猪业科学 SWINE INDUSTRY SCIENCE 2023年40卷第7期地方猪种INDIGENOUS BREEDS东北野猪 IFN OMEGA-2 基因的克隆测序和遗传多样性分析王文涛 1，张冬杰 1，何鑫淼 1，龚林明 2，亓美玉 1，张海峰 1，何海娟 1，吴赛辉 1，冯艳忠 1，陈赫书 1，田 明 1，刘自广 1，李忠秋 1，李 淼 1，刘 娣 1*（1.黑龙江省农业科学院畜牧研究所，黑龙江 哈尔滨 150086；2.伊春宝宇农业科技有限公司，黑龙江 伊春 153000）干扰素 OMEGA-2（IFN-2）基因属于 型干扰素，在结构、来源方面为型，根据前期研究发现猪的 IFN
2、-2 基因位于1 号染色体，处于其染色体长臂的 187329341187329913 位置，赵光伟研究团队针对荣昌猪 IFN 基因研究中发现 IFN-基因具有良好的抗原性，能够增强荣昌猪的免疫力，与 Xin Zhao 研究团队研究结果相似，推测其具备在提高机体免疫调节能力、抵御病毒侵染过程中发挥重要作用。本 研 究 针 对 东 北 野 猪 IFN OMEGA-2 基因进行克隆测序，并与民猪、大白猪基因序列进行比对，同时进行遗传多样性分析。1 材料与方法1.1 试验材料采集黑龙江省小兴安岭地区东北野猪耳组织样品 23 个，采集后液氮保存，运输至黑龙江省农业科学院畜牧研究所种养结合重点实验室。1.
3、2 试验方法 1.2.1 DNA 提取选取 50 100 mg 东北野猪样品，采用常规提取 DNA 酚抽提法进行 DNA 提取，提取后检测 DNA质量，使用分光光度计检测时，基金项目：国家现代农业产业技术体系(CARS-36)作者简介：王文涛（1981），男，副研究员，博士，研究方向为猪遗传育种与繁殖，E-mail:*通信作者：刘娣（1963），女，研究员，博士，研究方向为猪遗传育种与繁殖，E-mail:OD260/280应在1.701.90范围内，采用 1%琼脂糖凝胶电泳法检测时，条带显示效果应满足无拖尾，且整齐清晰等条件。1.2.2 引物设计引物设计参照 NCBI（NM_001166322
4、）-猪 IFN OMEGA-2 基因序列，上游引物序列（5-3）：CAA GGT TCC CTC AGA CAC CCA TC；下 游 引 物 序列（5-3）：TTA CTC AAA TTA TTT CAA TAA GTT C，总 计 扩 增731 bp。1.2.3 PCR 反应体系根据预试验结果，确定 PCR 反应体系，包括浓度 50 ng L-1 的样品 DNA 添加量为 1 L，上游引物添加量为 1 L、下游引物添加量为 1 L，上下游引物浓度为10 pmol L-1，10 PCR 缓冲液添加量为 2 L，rTaq DNA 聚合酶添加量为 1 L，dNTPs 添加量为2 L，ddH2O
5、添加量为 11 L，全部 PCR 反应体系 20 L。根据预试验结果，确定反应条件，为 95条件下反应持续时间为 5 min，共计反应循环总次数为30 次，95 条件下反应持续时间为 30 s，然后在 50的退火温度条件下，持续时间 30 s，72持续时间 60 s，反应循环结束后，继续在72条件下反应持续时间 10 min，16 条件下反应持续时间 30 min，反应结束。1.2.4 克隆测序PCR 扩增结束后，将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为 1%，收集 731 bp 长度的目的片段，进行胶回收工作，连接、转化，提取阳性克隆质粒，1%琼脂糖凝胶电泳检验后，送至公司测序。
6、1.2.5 遗传多样性分析根据测序公司返回的目的序列，使用 DNAMAN 软件，拼接比对，整理后序列使用 NASP 5.10，统计分析 SNP 位点、单倍型多样性等信息。2 结果分析2.1 PCR 扩增针对 IFN-2 基因，使用上述反应体系，进行 PCR 扩增，结果图 1。图1 猪 IFN-2 基因 PCR 扩增1192023年40卷第7期 SWINE INDUSTRY SCIENCE 猪业科学地方猪种INDIGENOUS BREEDS2.2 克隆测序获得东北野猪 IFN-2 基因序列长度为 731 bp，图 2 中灰色区域为该基因 CDS 序列，长度为531bp，共计编码 177 个氨基酸
7、，各碱基平均含量为腺嘌呤 24.2%、胸腺嘧啶 24.2%、胞嘧啶 24.6%、鸟嘌 呤 27.0%，A+T 碱 基 平 均 含 量48.4%，C+G 碱基平均含量 51.6%，各碱基含量未出现明显偏倚，在变异位点分析方面，发现于 38 bp、172 bp、173 bp 和 190 bp 处 存 在4 个简约信息位点，保守区间为191 531 bp，5-UTR 为 100 bp，3-UTR 为 100 bp，见图 2。2.3 遗传多样性分析针对东北野猪 IFN-2 序列单倍型分析发现，含有 4 种单倍型，单倍型多样性指数达到 0.697，平均核苷酸差异指数达到 1.454 55，核苷酸多样性指
8、数达到 0.002 74。中性检测分析发现 Tajima s D 值达 到 0.345 15、Fu s Fs 值 达 到1.108 04，其值皆为正值，并且差异不显著，说明本研究中东北野猪整体种群呈现较为稳定状态。3 讨论与小结在前期对野猪全基因组的研究中发现，长期驯化过程中，野猪的神经、免疫、消化等性能的关联基因受到了极大程度的选择，本研究开展的 IFN OMEGA-2 基因与动物机体免疫应答相关，获得东北野猪了 IFN OMEGA-2 基因序列长度为 731 bp，其中 CDS 序列长度为531 bp，同时获得 CDS 区域各碱基平均含量，中性检测分析发现东北野猪整体种群呈现较为稳定状态，为今后东北野猪抗病性能的研究提供理论支持，将在下一步研究中继续开展东北野猪受选择基因筛选、验证工作。（收稿日期：2023-04-30）图2 东北野猪 IFN OMEGA-2 基因序列广告
