1、培养基制备与灭菌 目标要求目标要求基本原理基本原理试验器材试验器材基本步骤基本步骤第1页目标要求掌握培养基配制原理及方法掌握培养基配制原理及方法学习高压蒸汽灭菌基本原理及方法学习高压蒸汽灭菌基本原理及方法学习干热灭菌操作技术学习干热灭菌操作技术第2页 基本原理（一）（一）培养基配制：培养基配制：培养基培养基是人工配制适合微生是人工配制适合微生物生长繁殖或积累代谢产物营养基质。不物生长繁殖或积累代谢产物营养基质。不一样种类培养基中，普通应含有碳源、氮一样种类培养基中，普通应含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水六大营源、能源、无机盐、生长因子和水六大营养要素。养要素。第3页 因为微生物营养类
2、型复杂，不一样微生物对营养物质因为微生物营养类型复杂，不一样微生物对营养物质需求也不一样，所以，微生物培养基种类繁多。比如按培需求也不一样，所以，微生物培养基种类繁多。比如按培养微生物不一样可分为牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌）、养微生物不一样可分为牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌）、高氏一号合成培养基（培养放线菌）和马丁氏培养基（培高氏一号合成培养基（培养放线菌）和马丁氏培养基（培养真菌）等；按物理状态不一样可分为固体培养基、半固养真菌）等；按物理状态不一样可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基等。配制固体培养基时需加入体培养基和液体培养基等。配制固体培养基时需加入1.5%2.0%琼脂作凝固剂
3、。琼脂作凝固剂。不一样微生物对培养基不一样微生物对培养基 pH要求不一样，霉菌和酵母菌培要求不一样，霉菌和酵母菌培养基养基 pH普通是偏酸性，而细菌和放线菌培养基普通是偏酸性，而细菌和放线菌培养基 pH普通为普通为中性或微碱性。中性或微碱性。第4页试验器材仪器或其它用具：仪器或其它用具：搪瓷杯，试管，三角瓶，烧杯，搪瓷杯，试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，电磁炉、培养基分装器，高压蒸汽量筒，玻棒，电磁炉、培养基分装器，高压蒸汽灭菌锅，精密灭菌锅，精密pH试纸（试纸（pH 5.59.0），牛角匙，），牛角匙，棉花（或橡胶塞），牛皮纸，记号笔，纱布，棉棉花（或橡胶塞），牛皮纸，记号笔，纱布，棉绳等。
4、绳等。溶液或试剂：溶液或试剂：牛肉膏，蛋白胨，可溶性淀粉，葡牛肉膏，蛋白胨，可溶性淀粉，葡萄糖，萄糖，NaCl，K2HPO4，KNO3，MgSO47H2O，FeSO47H2O，琼脂，孟加拉红，链霉素，琼脂，孟加拉红，链霉素，1mol/L NaOH，1mol/L HCl等。等。第5页 操作步骤 称量称量 溶化溶化 调调pH pH 过滤过滤 分装分装 加塞加塞 包扎包扎 灭菌灭菌 搁置斜面搁置斜面 无菌检验无菌检验第6页称量称量：按培养基配方百分比依次准确地按培养基配方百分比依次准确地称取所需药品逐一放入搪瓷杯中称取所需药品逐一放入搪瓷杯中 第7页溶化溶化：在电炉上加热溶解。在电炉上加热溶解。第8
5、页注：琼脂要在沸水中溶解，用玻棒不停搅拌，直至注：琼脂要在沸水中溶解，用玻棒不停搅拌，直至完全溶解（分装试管）。完全溶解（分装试管）。也可先将一定量液体培养基分装于三角烧瓶中，然也可先将一定量液体培养基分装于三角烧瓶中，然后按后按1.5%2.0%量将琼脂直接加入各三角烧瓶中，量将琼脂直接加入各三角烧瓶中，在高温灭菌时即被溶化在高温灭菌时即被溶化(分装三角瓶分装三角瓶)。第9页分装：分装：液体培养基分装试管高度以液体培养基分装试管高度以1/4左左右为宜；固体培养基分装试管高度普通不右为宜；固体培养基分装试管高度普通不超出超出1/5，灭菌后制成斜面，灭菌后制成斜面。第10页第11页加加 塞塞第12
6、页包包 扎扎第13页高压蒸汽高压蒸汽灭菌灭菌第14页摆摆 斜斜 面面第15页搁置斜面：搁置斜面：最好待培养基冷至最好待培养基冷至50-6050-60时摆斜时摆斜面，以免形成大量冷凝水。搁置时要调整斜面面，以免形成大量冷凝水。搁置时要调整斜面倾斜度，以斜面长度不超出试管总长二分之一倾斜度，以斜面长度不超出试管总长二分之一（图示）为宜。能够成扎摆放，凝固前切莫移（图示）为宜。能够成扎摆放，凝固前切莫移动试管。动试管。试管斜面搁置与其长度示意图试管斜面搁置与其长度示意图第16页无菌检验：无菌检验：将灭菌培养基放入将灭菌培养基放入37温温箱中培养过夜，以检验灭菌是否彻底。箱中培养过夜，以检验灭菌是否彻
7、底。第17页基本原理（二）灭菌：灭菌：是指采取强烈理化原因使任何物体内外部是指采取强烈理化原因使任何物体内外部一切微生物永远丧失其生长繁殖能力办法。微生一切微生物永远丧失其生长繁殖能力办法。微生物试验要求在无菌条件下进行，为此，试验用器物试验要求在无菌条件下进行，为此，试验用器皿、培养基等都要预先包装并经灭菌后才可使用。皿、培养基等都要预先包装并经灭菌后才可使用。微生物试验中惯用灭菌方法有干热灭菌、高压蒸微生物试验中惯用灭菌方法有干热灭菌、高压蒸汽灭菌、紫外线汽灭菌、紫外线（UV）灭菌和过滤除菌等，可依灭菌和过滤除菌等，可依据详细情况选取不一样灭菌方法。据详细情况选取不一样灭菌方法。第18页高
8、压蒸汽灭菌：是将待灭菌物品放在一个密闭加压灭菌是将待灭菌物品放在一个密闭加压灭菌锅内，经过加热，使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。待水蒸锅内，经过加热，使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内冷空气从排气阀中驱尽（即排气），然后汽急剧地将锅内冷空气从排气阀中驱尽（即排气），然后关闭排气阀，继续加热，此时因为蒸汽不能溢出，而增加关闭排气阀，继续加热，此时因为蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内压力，从而使沸点增高，得到高于了灭菌锅内压力，从而使沸点增高，得到高于100100温度，温度，造成菌体蛋白质凝固变性而到达灭菌目标。造成菌体蛋白质凝固变性而到达灭菌目标。普通采取普通采取0.103 MPa蒸汽压
9、力，此时温度是蒸汽压力，此时温度是121.1，维持，维持1520 min。当灭菌物品中有易破坏成份时，可采取较低。当灭菌物品中有易破坏成份时，可采取较低温度温度115（蒸汽压力（蒸汽压力0.075 MPa）下维持）下维持30 min左右左右.第19页手提式高压蒸汽灭菌锅手提式高压蒸汽灭菌锅 第20页图示图示 手提式灭菌锅结构手提式灭菌锅结构1 1、安安全全阀阀；2 2、压压力力表表；3 3、放放气气阀阀；4 4、软软管管；5 5、螺螺栓栓6 6、灭菌桶；、灭菌桶；7 7、筛架；、筛架；8 8、水、水第21页第22页第23页锅内加适量水锅内加适量水第24页装入待灭菌物品装入待灭菌物品第25页插入
10、排气软管；加盖，旋紧螺栓插入排气软管；加盖，旋紧螺栓第26页加热，排气加热，排气第27页升压保压：升压保压：排气后，继续加热使锅内蒸汽压迟缓排气后，继续加热使锅内蒸汽压迟缓上升。当锅内压力抵达上升。当锅内压力抵达0.103MPa0.103MPa时，调整热源开时，调整热源开关，使锅内压力维持所需灭菌温度，同时计算灭关，使锅内压力维持所需灭菌温度，同时计算灭菌时间。普通培养基和玻璃器皿灭菌需维持菌时间。普通培养基和玻璃器皿灭菌需维持20min20min。降压：降压：抵达要求灭菌时间后，关闭热源，锅内压抵达要求灭菌时间后，关闭热源，锅内压力自然降至零压后，打开排气阀排气。力自然降至零压后，打开排气阀
11、排气。取料：取料：开启锅盖和取出灭菌物品时，锅体表面温开启锅盖和取出灭菌物品时，锅体表面温度依然很高，逸出蒸汽也很烫。故取物品时要预度依然很高，逸出蒸汽也很烫。故取物品时要预防手及其它部位皮肤烫伤。防手及其它部位皮肤烫伤。第28页第29页第30页 基本原理（三）干热灭菌：干热灭菌：普通在电热干燥箱中利用热空气进行普通在电热干燥箱中利用热空气进行灭菌。与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高灭菌。与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160 170），时间长（），时间长（1.5 2h）。但）。但干热灭菌温度不能超出干热灭菌温度不能超出180，不然包器皿纸或棉，不然包器皿纸或棉塞就会烤焦，甚至引发燃烧。塞
12、就会烤焦，甚至引发燃烧。干热灭菌仅适合用于对空玻璃器皿或金属器具消干热灭菌仅适合用于对空玻璃器皿或金属器具消毒灭菌毒灭菌第31页第32页 操作步骤玻璃器皿清洗玻璃器皿清洗 烘干烘干 包装包装 放入放入干燥箱干燥箱 165，2h 关电源，冷却关电源，冷却第33页器皿包扎第34页移液管包扎及移液管筒第35页干干热热灭灭菌菌干热灭菌：165，1.52.0h第36页试验安排牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基高氏一号培养基（同上）高氏一号培养基（同上）马丁氏培养基（同上）马丁氏培养基（同上）3个组：各个组：各配配1000ml，分装三角瓶（，分装三角瓶（200ml/瓶）瓶）1个组：个组：配配1000ml，分装三角瓶（，分装三角瓶（150ml/瓶）瓶）2个组：各个组：各配配500ml，分装三角瓶（，分装三角瓶（150ml/瓶）瓶）第37页试验安排（试验安排（4人人/组组）一、器皿包扎和灭菌一、器皿包扎和灭菌 （1）培养皿）培养皿12只（只（6只只1包）包）（2）1mL移液管移液管6支支 （3）干热灭菌（）干热灭菌（160 ，2h）二、制备无菌水二、制备无菌水 （1）250mL三角瓶：内装玻璃珠和三角瓶：内装玻璃珠和90mL水水 （2）试管）试管6支：分装支：分装9mL水水/支支 （3）牛皮纸包扎，高压蒸汽灭菌）牛皮纸包扎，高压蒸汽灭菌(121,20min)第38页
