1、课题1 微生物试验室培养专题2微生物的培养与应用1.提供营养和条件2.预防污染第1页微生物类群微生物类群原生生物：原生生物：原核生物原核生物:真菌真菌:病毒病毒:如酵母菌如酵母菌单细胞动植物单细胞动植物如草履虫、单细胞藻类等如草履虫、单细胞藻类等无细胞结构无细胞结构真核细胞真核细胞细菌、蓝藻细菌、蓝藻原核细胞原核细胞第2页(1)依据你所掌握知识，分析造成生产失败根源依据你所掌握知识，分析造成生产失败根源是什么是什么?(2)由此可见，研究和应用微生物前提是什么由此可见，研究和应用微生物前提是什么？根源在于发酵物中混入了杂菌根源在于发酵物中混入了杂菌 预防杂菌入侵，取得预防杂菌入侵，取得纯净培养物
2、纯净培养物 第3页一、培养基一、培养基微生物生存环境和营养物质微生物生存环境和营养物质1.1.基本成份：基本成份：碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐碳源碳源无机碳源：无机碳源：有机碳源：有机碳源：COCO2 2、COCO3 32 2-、HCOHCO3 3-牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物氮源氮源无机氮源：无机氮源：有机氮源：有机氮源：NHNH4 4、NONO3 3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含注：含CHONCHON有机物有机物是是异异养型微生物养型微生物碳源碳源、氮源氮源、能源能源第4页一、培养基一、培养基
3、微生物生存环境和营养物质微生物生存环境和营养物质1.1.基本成份：基本成份：碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐碳源碳源无机碳源：无机碳源：有机碳源：有机碳源：COCO2 2、COCO3 32 2-、HCOHCO3 3-牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物氮源氮源无机氮源：无机氮源：有机氮源：有机氮源：NHNH4 4、NONO3 3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：含注：含CHONCHON有机物有机物是是异异养型微生物养型微生物碳源碳源、氮源氮源、能源能源第5页1.1.基本成份：基本成份：碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮
4、源、水、无机盐2.2.特殊营养：特殊营养：维生素、碱基等维生素、碱基等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）3.pH3.pH、氧气需求：、氧气需求：4.4.种类：种类：固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基有有无无 凝固剂琼脂凝固剂琼脂分离分离 判定判定工业工业 生产生产化学成份：化学成份：物理性质：物理性质：天然培养基天然培养基 合成培养基合成培养基一、培养基一、培养基第6页划分划分标准准培养基种培养基种类特点特点用途用途物理性物理性质化学成份天然培养基天然培养基合成培养基合成培养基用途用途判别培养基培养基种类培养基种类不加凝固不加凝固剂加凝固加凝固剂，如，如琼脂
5、脂工工业生生产微生物分离、判定、微生物分离、判定、活菌活菌计数、保藏菌数、保藏菌种种含化学成份不明确天然物含化学成份不明确天然物质工工业生生产培养基成份明确培养基成份明确分分类、判定、判定在培养基中加入某种化学物在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要微生物生以抑制不需要微生物生长,促促进所需要微生物生所需要微生物生长培养、分离出特培养、分离出特定微生物定微生物在培养基中加入某种指示在培养基中加入某种指示剂或化学或化学药品品,用以判用以判别不一不一样种种类微生物微生物判判别不一不一样种种类微生物微生物选择培养基培养基液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基第7页加入青霉素培养基加入青霉素培养基
6、:不加氮源无氮培养基不加氮源无氮培养基:不加含碳有机物无碳培养基不加含碳有机物无碳培养基:几个选择培养基举例：几个选择培养基举例：分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌分离固氮菌分离固氮菌 分离自养型微生物分离自养型微生物唯一碳源为纤维素培养基唯一碳源为纤维素培养基分解纤维素细菌分解纤维素细菌第8页牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基 是一个应用最广泛和最普通细菌基础培养基是一个应用最广泛和最普通细菌基础培养基。1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基配方牛肉膏蛋白胨培养基配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g琼脂琼脂20.0g分析营养
7、组成？分析营养组成？第9页5.5.配制标准配制标准目标明确：目标明确：营养全方面、浓度适宜、百分比恰当营养全方面、浓度适宜、百分比恰当适宜适宜pHpH值：值：有机碳源有机碳源异养型：异养型：依据微生物依据微生物种类、培养目标种类、培养目标选择原料选择原料自养型：自养型：不加碳源不加碳源加入缓冲剂加入缓冲剂细菌偏碱，真菌偏酸细菌偏碱，真菌偏酸（COCO2 2碳源）碳源）生产生产科研科研第10页耐高温需保持干燥耐高温需保持干燥 物物品，品，160170 12小时小时接种环、接种针等接种环、接种针等 金属用具金属用具7075、30min 80、15min100、56min消毒消毒灭菌灭菌定义定义方法
8、方法较为较为温和温和理化方法，理化方法，杀死杀死部分有害菌体部分有害菌体（不不包含芽孢、孢子）包含芽孢、孢子）强烈强烈理化方法，理化方法，杀死杀死全部微生物全部微生物（包含（包含芽孢、孢子芽孢、孢子）煮沸消毒法煮沸消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法化学药剂化学药剂紫外线紫外线灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌酒精、氯气、石炭酸等酒精、氯气、石炭酸等高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌培养基，培养基，100KPa、121、1530min预防外来杂菌污染预防外来杂菌污染1.1.消毒与灭菌：消毒与灭菌：二、无菌技术二、无菌技术第11页请你判断以下材料或用具是否需要消毒或请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。假如需要，
9、请选择适当方法。灭菌。假如需要，请选择适当方法。（1 1）培养细菌用培养基与培养皿培养细菌用培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3）试验操作者双手试验操作者双手思考思考第12页2.2.无菌范围：无菌范围：试验操作空间消毒试验操作空间消毒操作者手、衣着消毒操作者手、衣着消毒试验用具灭菌试验用具灭菌试验操作过程试验操作过程二二.无菌技术：无菌技术：预防外来杂菌污染预防外来杂菌污染1.1.消毒与灭菌：消毒与灭菌：酒精灯旁操作酒精灯旁操作超净工作台超净工作台第13页四、大肠杆菌纯化培养四、大肠杆菌纯化培养分散成单个细胞分散成单个细胞,形成单个菌落形成单个菌落3.3
10、.功效：功效：单个单个或少数菌体或少数菌体2.2.特征：特征：大小、形状、光泽度、大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。颜色、透明度等。判定菌种判定菌种主要依据主要依据固体固体培养基上培养基上大量繁殖大量繁殖子细胞群体子细胞群体1.1.定义：定义：第14页1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基配方牛肉膏蛋白胨培养基配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g琼脂琼脂20.0g制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.1.计算：计算：培养基用量培养基用量依配方计算各成份用量依配方计算各成份用量2.2.称量：称量：3.3.溶化：溶化：牛肉
11、膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少许水加热溶解、少许水加热溶解 取纸取纸蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl琼脂琼脂 补水定容补水定容4.4.调调pHpH、分装、封口：、分装、封口：5.5.灭菌：灭菌：6.6.倒平板：倒平板：培养基、培养皿培养基、培养皿第15页倒平板倒平板约约50预防皿盖上水珠落入培养基，造成污染预防皿盖上水珠落入培养基，造成污染灼烧灭菌，灼烧灭菌，预防瓶口微生物污染培养基预防瓶口微生物污染培养基第16页制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：纯化
12、大肠杆菌：平板划线法：平板划线法：菌种菌种划划3 3个平板个平板1 1个不划线个不划线1.1.接种：接种：接种环接种环预防划破培养基预防划破培养基（重复试验）（重复试验）（空白对照）（空白对照）四、大肠杆菌纯化培养四、大肠杆菌纯化培养第17页第18页第19页平板划线时不能划破培养基，为何？平板划线时不能划破培养基，为何？一旦划破，会造成划线不均匀，难以到达分一旦划破，会造成划线不均匀，难以到达分离单菌落目标；离单菌落目标；二是存留在划破处单个细胞无法形成规矩菌二是存留在划破处单个细胞无法形成规矩菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状菌落。状菌落。第20
13、页问题讨论问题讨论1.1.为何在操作第一步以及每次划线之前都要灼烧接为何在操作第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，依然需要灼烧接种环吗？种环？在划线操作结束时，依然需要灼烧接种环吗？为何？为何？操作第一步灼烧接种环是为了防止接种环上可操作第一步灼烧接种环是为了防止接种环上可能存在微生物污染培养物能存在微生物污染培养物杀死上次残留菌种，确保使下一次划线时，菌杀死上次残留菌种，确保使下一次划线时，菌种直接起源于上次划线末端，从而经过划线次种直接起源于上次划线末端，从而经过划线次数增加，使每次划线时菌种数目逐步降低，方数增加，使每次划线时菌种数目逐步降低，方便得到菌落。便得到菌落
14、。及时杀死接种环上残留菌种，防止细菌污染环及时杀死接种环上残留菌种，防止细菌污染环境和感染操作者。境和感染操作者。第21页问题讨论问题讨论2.2.在灼烧接种环之后，为何要等其冷却后再进行划线？在灼烧接种环之后，为何要等其冷却后再进行划线？3.3.在作第二次以及其后划线操作时，为何总是从上一在作第二次以及其后划线操作时，为何总是从上一次划线末端开始划线？次划线末端开始划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：划线后，线条末端细菌数目比线条起始处要少，答：划线后，线条末端细菌数目比线条起始处要少，每次从上一次划线末端开始，能使细菌数目伴随划线每次从上一次划线末端
15、开始，能使细菌数目伴随划线次数增加而逐步降低，最终能得到由单个细菌繁殖而次数增加而逐步降低，最终能得到由单个细菌繁殖而来菌落。来菌落。第22页6 6支试管，分别加入支试管，分别加入9ml9ml无菌水无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液：菌液菌液微量微量 移液器移液器第23页第24页稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液：b.b.涂布平板：涂布平板：不超出不超出0.1ml0.1ml各梯度分别涂布各梯度分别涂布3个平板个平板1 1个不涂布作空白对照个不涂布作空白对
16、照滴滴灼灼试试涂涂稀稀释释10103 3倍倍稀稀释释10104 4倍倍稀稀释释10105 5倍倍第25页平板划线法：平板划线法：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌：1.1.接种：接种：稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：2.2.培养：培养：将将接种后接种后培养基和一个培养基和一个未接种未接种培养基培养基放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养12h12h24h24h后，后，观察并统计观察并统计四、大肠杆菌纯化培养四、大肠杆菌纯化培养第26页五、课题结果评价五、课题结果评价 培养培养12 h12 h与与24 h24 h后大肠杆菌菌落大小会有显著不一样后大肠
17、杆菌菌落大小会有显著不一样（一）培养基制作是否合格（一）培养基制作是否合格假如未接种培养基在恒温箱中保温假如未接种培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，后无菌落生长，说明培养基制备是成功，不然需要重新制备。说明培养基制备是成功，不然需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求（二）接种操作是否符合无菌要求假如培养基上生长菌落颜色、形状、大小基本一致，并符假如培养基上生长菌落颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落特点，则说明接种操作是符合要求；假如合大肠杆菌菌落特点，则说明接种操作是符合要求；假如培养基上出现了其它菌落，则说明接种过程中，无菌操作培养基上出现了其它菌落，则说明接种过程中
18、，无菌操作还未到达要求，需要分析原因，再次练习。还未到达要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致观察与统计（三）是否进行了及时细致观察与统计第27页1.1.暂时保藏：暂时保藏：试管固体斜面培养基上试管固体斜面培养基上442.2.长久保留：长久保留：菌种易被污染、变异菌种易被污染、变异甘油管藏甘油管藏1ml1ml甘油甘油1ml1ml菌液菌液2020六、课题延伸（菌种保藏）六、课题延伸（菌种保藏）第28页本课题知识小结本课题知识小结微微生生物物试试验验室室培培养养培养基培养基无菌技术无菌技术制备牛肉蛋白胨固制备牛肉蛋白胨固体培养基体培养基纯化大肠杆菌纯化大肠杆菌结果分析与评价结果分析
19、与评价培养基类型培养基类型培养基营养物质培养基营养物质防止杂菌污染方法防止杂菌污染方法试验室惯用消毒方法试验室惯用消毒方法试验室惯用灭菌方法试验室惯用灭菌方法平板划线法平板划线法稀释涂布法稀释涂布法（步骤）（步骤）第29页【典例解析】【典例解析】例例例例1:1:1:1:关于微生物营养物质叙述中，正确是关于微生物营养物质叙述中，正确是关于微生物营养物质叙述中，正确是关于微生物营养物质叙述中，正确是()()()()A.A.A.A.是碳源物质不可能同时是氮源是碳源物质不可能同时是氮源是碳源物质不可能同时是氮源是碳源物质不可能同时是氮源 B.B.B.B.凡碳源都提供能量凡碳源都提供能量凡碳源都提供能量
20、凡碳源都提供能量 C.C.C.C.除水以外无机物只提供无机盐除水以外无机物只提供无机盐除水以外无机物只提供无机盐除水以外无机物只提供无机盐 D.D.D.D.无机氮源也能提供能量无机氮源也能提供能量无机氮源也能提供能量无机氮源也能提供能量解析：解析：解析：解析：不一样微生物，所需营养物质有较大差异，要针对微生不一样微生物，所需营养物质有较大差异，要针对微生不一样微生物，所需营养物质有较大差异，要针对微生不一样微生物，所需营养物质有较大差异，要针对微生物详细情况分析。对于物详细情况分析。对于物详细情况分析。对于物详细情况分析。对于A A A A、B B B B选项，它表示是不完整。有碳源只选项，它
21、表示是不完整。有碳源只选项，它表示是不完整。有碳源只选项，它表示是不完整。有碳源只能是碳源，如二氧化碳；有碳源可同时是氮源，如能是碳源，如二氧化碳；有碳源可同时是氮源，如能是碳源，如二氧化碳；有碳源可同时是氮源，如能是碳源，如二氧化碳；有碳源可同时是氮源，如NHNHNHNH4 4 4 4HCOHCOHCOHCO3 3 3 3；有；有；有；有碳源同时是能源，如葡萄糖；有碳源同时是氮源，也是能源，碳源同时是能源，如葡萄糖；有碳源同时是氮源，也是能源，碳源同时是能源，如葡萄糖；有碳源同时是氮源，也是能源，碳源同时是能源，如葡萄糖；有碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于如蛋白胨。对于如蛋白胨。对于
22、如蛋白胨。对于C C C C选项，除水以外无机物种类繁多，功效也多选项，除水以外无机物种类繁多，功效也多选项，除水以外无机物种类繁多，功效也多选项，除水以外无机物种类繁多，功效也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物碳源；样。如二氧化碳，可作为自养型微生物碳源；样。如二氧化碳，可作为自养型微生物碳源；样。如二氧化碳，可作为自养型微生物碳源；NaHCONaHCONaHCONaHCO3 3 3 3，可作为，可作为，可作为，可作为自养型微生物碳源和无机盐；而自养型微生物碳源和无机盐；而自养型微生物碳源和无机盐；而自养型微生物碳源和无机盐；而NaClNaClNaClNaCl则只能提供无机盐。对于则只能提
23、供无机盐。对于则只能提供无机盐。对于则只能提供无机盐。对于D D D D选项，无机氮源提供能量情况还是存在，如选项，无机氮源提供能量情况还是存在，如选项，无机氮源提供能量情况还是存在，如选项，无机氮源提供能量情况还是存在，如NHNHNHNH3 3 3 3可为硝化细菌可为硝化细菌可为硝化细菌可为硝化细菌提供能量和氮源。提供能量和氮源。提供能量和氮源。提供能量和氮源。D D第30页例例2 2：下面对发酵工程中灭菌了解不正确是：下面对发酵工程中灭菌了解不正确是()A.A.预防杂菌污染预防杂菌污染 B.B.毁灭杂菌毁灭杂菌 C.C.培养基和发酵设备都必须灭菌培养基和发酵设备都必须灭菌 D.D.灭菌必须
24、在接种前灭菌必须在接种前解析：灭菌是微生物发酵过程一个主要步骤。解析：灭菌是微生物发酵过程一个主要步骤。解析：灭菌是微生物发酵过程一个主要步骤。解析：灭菌是微生物发酵过程一个主要步骤。A A A A说是灭菌目标，说是灭菌目标，说是灭菌目标，说是灭菌目标，因为发酵所用菌种大多是单一纯种，整个发酵过程不能混入因为发酵所用菌种大多是单一纯种，整个发酵过程不能混入因为发酵所用菌种大多是单一纯种，整个发酵过程不能混入因为发酵所用菌种大多是单一纯种，整个发酵过程不能混入其它微生物（杂菌），所以是正确；其它微生物（杂菌），所以是正确；其它微生物（杂菌），所以是正确；其它微生物（杂菌），所以是正确；B B B
25、 B是错误，因为灭菌目标是错误，因为灭菌目标是错误，因为灭菌目标是错误，因为灭菌目标是预防杂菌污染，但实际操作中不可能只毁灭杂菌，而是毁是预防杂菌污染，但实际操作中不可能只毁灭杂菌，而是毁是预防杂菌污染，但实际操作中不可能只毁灭杂菌，而是毁是预防杂菌污染，但实际操作中不可能只毁灭杂菌，而是毁灭全部微生物。灭全部微生物。灭全部微生物。灭全部微生物。C C C C是正确，因为与发酵相关全部设备和物质都是正确，因为与发酵相关全部设备和物质都是正确，因为与发酵相关全部设备和物质都是正确，因为与发酵相关全部设备和物质都要灭菌；发酵所用微生物是灭菌后专门接种，灭菌必须在接要灭菌；发酵所用微生物是灭菌后专门
26、接种，灭菌必须在接要灭菌；发酵所用微生物是灭菌后专门接种，灭菌必须在接要灭菌；发酵所用微生物是灭菌后专门接种，灭菌必须在接种前，假如接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。种前，假如接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。种前，假如接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。种前，假如接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。B B第31页编号编号成份含量含量粉状硫粉状硫10g10g（NHNH4 4）2 2SOSO4 40.4g0.4gK K2 2HPOHPO4 44.0g4.0gMgSOMgSO4 49.25g9.25gFeSOFeSO4 40.5g0.5gCaClCaCl2 20.5g0.5gH H2 2O O100m
27、l100ml例例3 3右表是某微生物右表是某微生物培养基成份，请据此回培养基成份，请据此回答：答：（1 1）右表培养基可培）右表培养基可培养微生物类型是养微生物类型是 。（2 2）若不慎将过量）若不慎将过量NaClNaCl加入培养基中。加入培养基中。如不想浪费此培养基，如不想浪费此培养基，可再加入可再加入 。自养型微生物自养型微生物 含碳有机物含碳有机物 第32页（3 3）若除去成份）若除去成份，加（，加（CH2OCH2O），），该培养基可用于培养该培养基可用于培养 。（4 4）表中营养成份共有）表中营养成份共有 类。类。（5 5）不论何种培养基，在各种成份都）不论何种培养基，在各种成份都溶化后分装前，要进行是溶化后分装前，要进行是 。（6 6）右表中各成份重量确定标准是）右表中各成份重量确定标准是 。（7 7）若右表培养基用于菌种判定，应）若右表培养基用于菌种判定，应该增加成份是该增加成份是 。固氮微生物固氮微生物 3 调整调整pHpH 依微生物生长需要确定依微生物生长需要确定 琼脂（或凝固剂）琼脂（或凝固剂）第33页
