1、电泳原理与技术n移动界面电泳(movingboundaryelectrophoresis)n区带电泳(zoneelectrophoresis)n稳态电泳(steadystateelectrophoresis)其中以区带电泳为当前惯用电泳系统。依据技术原理，电泳可分三种形式:任何电泳技术方法，均是以某种载体或支持介质作为样品中蛋白质泳动跑道，在一定温度、pH条件下、稳定静电场中实现对样品中蛋白质分离，进而进行分析。第1页电泳支持介质必须含有：化学惰性、不干扰大分子电泳过程，化学稳定性好、均匀、重复性好、电内渗小等特征。常见凝胶电泳支持介质：聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel,P
2、AG)由丙烯酰胺和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂作用下，聚合而成。未交链单体丙烯酰胺属神经性毒素，并含有致癌作用，试验过程注意尽可能防止中毒。试验过程简单，仪器设备叫珍贵，但分辨率很高，重复性强。主要用于蛋白质、酶、小分子核酸等分离分析。琼脂糖凝胶：从琼脂中精制分离出胶状多糖，其分子结构大部分是由1，3连接-D吡喃半乳糖和1,4连接3,6脱水-D吡喃半乳糖交替形成。试剂昂贵，方法简单，分辨率较高。主要用于DNA分离分析。淀粉凝胶：15%淀粉凝胶作为载体可对一定分子量蛋白质进行有效分离。成本低，简单。主要用于同工酶等分离分析。第2页一、醋酸纤维薄膜电泳第3页1.操作技术要领：(1)
3、.醋酸纤维薄膜前处理(2).点样：点样23l；点样量多少直接影响分离效果，控制点样量是试验成功关键。点样位置合理：距离薄膜一端约2cm样线上平行点样，23个样点基本保持在一条线上。商品薄膜在pH8.6巴比妥缓冲液浸泡1h以上。取出后，小块滤纸对折吸收薄膜表面多出缓冲液，进行点样。(3).醋酸纤维薄膜置于电泳槽样点一端贴阴极盐桥(黑线端)，非点样端置于阳极盐桥(红线)排除气泡压实(确保薄膜与电极接触良好)。(4).电泳：80100V；3550min。pH8.6巴比妥缓冲液培养皿醋酸纤维薄膜-+点样线悬空切勿接触(近)滤纸第4页(5).染色薄膜浸泡于氨基黑溶液中510min。(6).脱色薄膜浸泡于
4、漂洗液中进行漂洗，至背景为乳白色。(7).薄膜干燥(8).透明薄膜浸泡于透明液中1030s，及时取出贴于洁净玻板上，排气泡。慢加热，逐步烘干。(9).分析薄膜从玻板上取下，进行分析。Alb(清蛋白)-球蛋白-球蛋白1-球蛋白2-球蛋白薄膜置于烘箱完全干燥。-+第5页Alb(白蛋白)-球蛋白-球蛋白1-球蛋白2-球蛋白各组分组成白蛋白1-酸性糖蛋白；1-抗胰蛋白酶；HP；CP；-巨球蛋白；脂蛋白；转铁蛋白；补体系统；脂蛋白IgG；IgM；IgA；IgD；IgE正常参考值Alb：57%68%1：1.0%5.7%2：4.9%11.2%：7%13%：9.8%18.2%凝胶成像系统拍照及扫描分析结果第6
5、页2.醋酸纤维薄膜电泳分离人血清蛋白质原理蛋白质名称等电点相对分子量(KD)Alb(白蛋白)-球蛋白-球蛋白1-球蛋白2-球蛋白4.645.065.065.126.857.36920030090150156950-+在pH8.6条件下血清中哪种蛋白质在电场中向阳极移动最快？-分子量相同时，带负电荷越多者移动较快；相同等电点时，分子量较小者向异极移动较快。1比2球蛋白分子量小，向阳极移动快！Alb(白蛋白)-球蛋白-球蛋白1-球蛋白2-球蛋白-+%57-722-54-96-1212-20第7页polyacrylamidegelelectrophoresis二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)不一样
6、蛋白质因为带电性质、分子颗粒大小及形状不一样，在聚丙烯酰胺凝胶(PAG)中，向异极泳动速度快慢不一样，经过电泳最终被分开。因为蛋白质在凝胶系统分离过程中存在浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，所以，PAGE法是分离、分析蛋白质很好技术方法之一。第8页（一）PAGE技术流程介绍2.制胶1.组架3.点样4.电泳5.染色6.脱色7.分析玻板胶条U型玻板封胶分离胶溶液浓缩胶溶液插入梳子+-电极缓冲液电极缓冲液第9页通常采取过硫酸铵或核黄素来引发该过程,以N,N,N,N-四甲基乙二胺(Tetranmethylenediamine,TEMED)为增速剂。该引发-增速催化系统实质是自由基催化氧化-还原过程。其结
7、果是液态转变为逐步胶凝半固体状态。凝胶形状取决于模具。（二）丙烯酰胺凝胶聚合原理与凝胶结构CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONH2CH2NHC=OCH2=CH甲叉双丙烯酰胺+丙烯酰胺胶联单体胶联剂过硫酸铵TEMED聚丙烯酰胺凝胶具备立体网状结构-CH2-CH-CH2-CH-n-CH2-CH-CH2-CH-n-CH2-C=ONH2C=ONHCH2NHC=OC=ONH2C=ONH2C=ONH2-CH2-CH-CH2-CH-n-CH2-CH-CH2-CH-n-CH2-C=ONHCH2第10页立体网状结构中网眼大小与凝胶浓度相关:总胶浓度(%)平均孔径(nm)nBis(铰链剂)占总胶百分数15
8、15256.58.010.012.015.02402301901701401901601409070280240200360300胶浓度T=a+bm100%胶联度C=ba+b100%a:丙烯酰胺(单体)量(g)b:甲叉双丙烯酰胺(交联剂)量(g)m:a+b所在缓冲溶液总体积(ml)第11页凝胶内均匀立体网状结构示意图凝胶中网眼大小与胶浓度相关，胶浓度越小，其网眼越大，胶浓度越大网眼越小。普通常规胶浓度为8%-10%。分离分析较小蛋白质分子时用较高浓度凝胶，而分离分析分子量较大蛋白质时则用较大浓度凝胶。第12页凝胶浓度T(C=2.6%)分子量范围(kDa)凝胶浓度T(C=5%)分子量范围(kDa
9、)53020056070010151001022280151050151020020215205150凝胶浓度与有效分离蛋白质分子量之间关系n分离胶浓度太大，孔径小于样品分子尺寸，电泳时蛋白质分子不能进入凝胶，样品仍留在加样位置；n分离胶浓度太小，孔径太大，样品中各种蛋白质分子受到分子筛效应减小，不能得到很好分离；所以试验过程需要依据样品中被分析蛋白质分子大小适当进行设计。第13页引发剂和增速剂浓度：浓度小易造成聚合速度慢；浓度过大则易造成电泳时烧胶以及电泳带畸变；普通控制使聚合过程在4060分钟内完成。系统pH值：酸性条件、碱性条件均可，但依然存在一个最正确pH值，以取得最正确聚合结果；温度
10、：低温下聚合造成凝胶变脆和混浊；适当提升温度能够是凝胶透明而有弹性；分子氧：分子氧存在会妨碍凝胶化学聚合；抽气系统纯度：金属离子会影响凝胶聚合；（三）影响凝胶聚合速度主要原因第14页（四）PAGE分离蛋白质原理PAG系统电泳分离蛋白质含有很高分辨率，因为该系统工作状态下存在三种效应，这三种效应与凝胶系统pH不连续性及凝胶网眼大小相关。1.浓缩效应电极缓冲液Tris-HCl(pH8.5)浓缩胶为pH6.5，通电后样品中各种带负电荷蛋白质会在快离子(Cl-)和慢离子形成高压带之间初步分开并形成很窄条带，而整个样品中蛋白质在将进入分离胶时会形成一条细线，即被浓缩之效果。2.电荷效应3.分子筛效应样品
11、+-甘氨酸缓冲液浓缩胶(网眼大)甘氨酸缓冲液分离胶(网眼小)pH8.5pH6.5pH8.9玻板组成三明治模具(1mm厚)电泳槽第15页2.电荷效应3.分子筛效应在设置好浓缩胶及分离胶特定pH条件下，不一样蛋白质所带电荷多少不一样，并在稳定静电场中向异极泳动动力所决定泳动速度不一样，最终会被分离。分离胶内属于立体网状结构，分子量较大蛋白质颗粒向异极泳动受到阻力较大，泳动较慢，而分子量较小蛋白质则阻力较小，向异极涌动较快，最终被分开。第16页（五）影响蛋白质泳动速度及分离效果主要原因1.系统pH值凝胶体系及电极缓冲液pH决定样品中蛋白质带电性质，直接影响蛋白质电泳方向和泳动速度。pH普通设置成大于
12、样品中蛋白质等电点，蛋白质均荷负电，电泳方向朝阳极。而当pH小于样品中蛋白质等电点时，则全部蛋白质分子荷正电，静电场中向阴极泳动。前一个电泳系统属于碱性电泳，后者成为酸性电泳。2.电场强度普通电泳高压电泳520V/cm电压降(电位梯度)。70200V/cm电压降(电位梯度)。直接影响蛋白质泳动速度主要原因。第17页3.温度电泳过程中因为电流作用致使凝胶发烧，热效应对电泳有很大影响。温度升高时介质粘度下降，分子热运动加剧，自由扩散变快，有效迁移率增加，但对于蛋白质分离不利。另外较高温度会使凝胶变形，分子筛效应降低，影响分离。所以，普通要求在15-25之间进行电泳效果很好。4.电渗作用电泳介质或支
13、持物(如凝胶)在电极缓冲液中吸附带电离子，使溶液相对带电，进而在电场作用下，溶液就会向一定方向移动，这种想象称为电渗现象。带电溶液移动会影响蛋白质泳动。第18页sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis三、三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白质受还原剂作用解开二硫键，同时受SDS作用处于变性状态，在聚丙烯酰胺凝胶中，向亦极泳动速度快慢主要是按照分子颗粒从小到大小依次排开得以分离技术方法。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳设备简单、操作简便、快速、重复性好、样品无需纯化。因为同时存在三种效应，所以分
14、辨率和检出灵敏度高。技术主要特点：技术主要应用范围：除了分离分析蛋白质亚基种类、表示剂量之外，还可用于测定未知蛋白质亚基分子量。第19页（一）SDS-PAGE分离基本原理蛋白质分子解聚SDS是一个阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们多肽链，解聚后氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超出了蛋白质原有电荷量，消除了不一样分子间电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体形状也
15、基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率影响。所以，SDS-PAGE过程中蛋白质分子在凝胶中泳动速度主要取决与亚基分子量大小。与PAGE技术方法相同，蛋白质亚基在电泳过程中存在三效应。第20页蛋白质样品用SDS处理后亚基解聚和分子形状改变：第21页（二）未知蛋白质分子量测定以不一样分子量标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不一样标准蛋白电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测定迁移率，从标准曲线得到对应分子量；相对迁移距离(Relativemigration,cm)logMrUnknownprotein第22页1.电泳槽：是凝胶电泳系统关键部分，管式电泳槽、垂直板电泳槽、水平板电泳槽四、电泳常规设备第23页2.电源:3.脱色、染色槽4.凝胶成像分析系统第24页思索题：1.常见凝胶电泳有哪几个？说明其主要用途，并比较其主要优缺点。2.简单说明PAGE技术方法对于样品中蛋白质分离效果很好主要原因有哪些，并简单解释对应原因产生有原因。3.从分离原理和实际应用两方面简单说明SDS-PAGE和PAGE技术方法有何主要区分？4.影响蛋白质电泳分辨率主要原因有哪些？第25页
