1、PCRPCR技术及其应用技术及其应用生物化学试验技术农业生物学试验教学中心制作人：张杰道制作人：张杰道1/43目录PCR反应原理PCR类型和应用PCR示例2/43多聚多聚酶链式反式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)Kary B.MullisKary B.Mullis PCR是由美国科学家是由美国科学家穆利斯提出一个穆利斯提出一个体外简化条件下模拟体外简化条件下模拟DNADNA体内复制体内复制DNADNA快速扩增方法，此技术取得快速扩增方法，此技术取得19931993年诺贝年诺贝尔化学奖。尔化学奖。3/43体内体内DNADNA复制体系复制体系DNADNADNADNA聚
2、合酶聚合酶聚合酶聚合酶（I II IIII II IIII II IIII II III）拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶解旋酶类解旋酶类解旋酶类解旋酶类SSBSSBSSBSSB 引物引物引物引物dNTP MgdNTP MgdNTP MgdNTP Mg2+2+2+2+5 5334/43MullisPCR构思构思引物引物引物引物DNADNA聚合聚合酶酶DNADNA聚合聚合酶酶特定特定DNADNA片段片段5/43TaqTaq DNADNA聚合聚合酶酶（thermusaquaticus)thermusaquaticus)酶酶酶酶活活活活性性性性(%)温度温度温度温度()40 50 60 70
3、 80 90 100100 80 60 40 20耐耐热DNADNA聚合聚合酶Saiki（1988）将耐热）将耐热DNA聚合酶引入聚合酶引入PCR，使利用热变性解链，使利用热变性解链DNA模板可行。模板可行。6/43PCR反应循环反应循环7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环变性变性变性变性退火退火退火退火延伸延伸延伸延伸7/43 PCRPCRPCRPCR指数扩增（指数扩增（指数扩增（指数扩增（2 2 2 2n n n n）引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸5 5 5 53 33 3变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、
4、退火8/43TaqTaqP1P1P2P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：模板：DNA引物：引物：P1 P2DNA聚合酶：聚合酶：Taq原料：原料：dNTP反应缓冲液反应缓冲液辅助因子：辅助因子：Mg2+9/431 1）PCRPCR反反应成份成份（1 1 1 1）模板）模板）模板）模板单、双、双链DNADNA均可。均可。不能混有蛋白不能混有蛋白酶、核酸、核酸酶、DNADNA聚合聚合酶抑制抑制剂、DNADNA结合蛋白合蛋白类。DNADNA模板普通模板普通100ng/100100ng/100 L L。模板模板浓度度过高会造成反高会造成反应非特异性增加。非特异性增加。PCR
5、反应条件10/43（2 2 2 2）引物）引物）引物）引物浓浓度度度度0.1-0.50.1-0.5 mol/Lmol/L浓度度过高易造成模板与引物高易造成模板与引物错配配,反反应特异性下降。特异性下降。（3 3 3 3）TaqTaqTaqTaq DNADNADNADNA聚合聚合聚合聚合酶酶0.5-2.5U/500.5-2.5U/50 l l酶量增加使反量增加使反应特异性下降特异性下降;酶量量过少影响反少影响反应产量。量。11/43（4 4 4 4）dNTPdNTPdNTPdNTPdNTPdNTP浓度取决于度取决于扩增片段增片段长度度四种四种dNTPdNTP浓度度应相等相等浓度度过高易高易产生生
6、错误碱基碱基掺入入,浓度度过低低则降低降低反反应产量量dNTPdNTP可与可与Mg2+Mg2+结合合,使游离使游离Mg2+Mg2+浓度下降度下降,影响影响DNADNA聚合聚合酶活性。活性。12/43（5 5 5 5）Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+是是DNADNA聚合聚合酶激活激活剂。适宜。适宜浓度度为0.5-0.5-2.5mmol/L2.5mmol/L反反应体系。体系。Mg2+Mg2+浓度度过低会使低会使TaqTaq酶活性活性丧失、失、PCRPCR产量下降；量下降；Mg2+Mg2+过高影响反高影响反应特异性。特异性。Mg2+Mg2+可与可与负离子离子结合合,所以反所以反应体系
7、中体系中dNTPdNTP、EDTAEDTA等等浓度影响反度影响反应中游离中游离Mg2+Mg2+浓度。度。13/432 2 2 2）循）循）循）循环环参数参数参数参数(1)(1)变变性性性性(2)使双使双链DNADNA解解链为单链9494，20-30秒秒(2)(2)(2)(2)退火退火退火退火温度由引物温度由引物长度和度和GCGC含量决定。含量决定。增加温度能降低引物与模板非特异性增加温度能降低引物与模板非特异性结合合;降低降低温度可增加反温度可增加反应灵敏性。灵敏性。14/43（3 3 3 3）延伸）延伸）延伸）延伸70-75,70-75,普通普通为7272延伸延伸时间由由扩增片段增片段长度决
8、定度决定（4 4 4 4）循）循）循）循环环次数次数次数次数主要取决于模版主要取决于模版DNADNA浓度度普通普通为25-3525-35次次次数次数过多：多：扩增效率降低增效率降低错误掺入率增加入率增加15/43PCR技术特点1111）高度灵敏性）高度灵敏性）高度灵敏性）高度灵敏性30303030轮轮循循循循环环扩增量达增量达230230个拷个拷贝（109109拷拷贝）PCRPCR产物每物每轮循循环增加一倍增加一倍16/432 2 2 2）特异性）特异性）特异性）特异性引物引物引物引物引物引物引物引物引物序列及其与模板引物序列及其与模板结合特异性是决定合特异性是决定PCRPCR反反应结果关果关
9、键。引物引物设计最大最大标准是最大程度地提升准是最大程度地提升扩增效率和增效率和特异性；同特异性；同时尽可能降低非特异性尽可能降低非特异性扩增。增。17/43引物引物设计设计：（1)1)序列序列应应位于高度保守区位于高度保守区,与非与非扩扩增区无同源增区无同源序列。序列。（2 2）引物）引物长长度以度以15-40bp15-40bp为为宜。宜。（3 3）碱基尽可能随机分布碱基尽可能随机分布,G+C,G+C占占40-60%40-60%。（4 4）引物内部防止形成二）引物内部防止形成二级结级结构。构。（5 5）两引物）两引物间间防止有互防止有互补补序列。序列。（6 6）引物）引物33端端为为关关键键
10、碱基；碱基；5 5端无端无严严格限制。格限制。18/433 3 3 3）操作）操作）操作）操作简简便易行便易行便易行便易行 利用利用PCRPCR扩增增,只需要数小只需要数小时,就能就能够扩增出增出 可用可用电泳法泳法检出出DNADNA，可用于，可用于检测基因基因组中中仅含数个拷含数个拷贝模板序列。模板序列。19/431 1 1 1）不对称）不对称）不对称）不对称PCRPCRPCRPCR 目目标：扩增增产生特异生特异长度度单链DNADNA。方法：采取两种不一方法：采取两种不一样浓度引物。分度引物。分别称称为限制性限制性引物和非限制性引物引物和非限制性引物,其最正确百分比普通是其最正确百分比普通是
11、0.010.5M,0.010.5M,关关键是限制性引物是限制性引物绝对量。量。用途：制用途：制备核酸序列核酸序列测定模板；制定模板；制备杂交探交探针；基因基因组DNADNA结构功效研究构功效研究 PCRPCR类型20/43 高浓度引物高浓度引物低浓度引物低浓度引物21/432)2)2)2)反向反向反向反向PCR(reversePCR)PCR(reversePCR)PCR(reversePCR)PCR(reversePCR)用反向互用反向互补引物来引物来扩增两引物以外增两引物以外DNADNA片段，片段，对某某个已知个已知DNADNA片段两片段两侧未知序列未知序列进行行扩增。增。未知序列未知序列未
12、知序列未知序列已知序列已知序列22/43已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶23/433 3 3 3）多重）多重）多重）多重PCRPCRPCRPCR（复合（复合（复合（复合PCRPCRPCRPCR）用于用于检测特定基因序列存在或缺失。特定基因序列存在或缺失。24/43电电泳泳泳泳引物引物1234123425/434 4 4 4）LP-PCRLP-PCRLP-PCRLP-PCR（Labelled primers)Labelled primers)Labelled primers)Labelled primers)利用同位素、
13、利用同位素、荧光素等光素等对引物引物进行行标识,用以直用以直观地地检测目目标基因。基因。尤其适合大量尤其适合大量临床床标本基因本基因诊疗可同可同时检测各种基因成份各种基因成份26/43标识引物标识引物标识引物标识引物观察观察PCRPCR产物产物27/435 5 5 5）锚定）锚定）锚定）锚定PCRPCRPCRPCR（anchored PCR,A-PCRanchored PCR,A-PCRanchored PCR,A-PCRanchored PCR,A-PCR）锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作
14、PCR扩增28/43cDNAcDNA末端核酸转移酶末端核酸转移酶3GGGG3GGGG55CCCC CCCC 锚定引物锚定引物锚定引物锚定引物3GGGG3GGGG55CCCCCCCC3GGGG3GGGGCCCCCCCC29/436 6 6 6）PCRPCRPCRPCR固相分析法固相分析法固相分析法固相分析法模模板板生物素生物素化引物化引物PCRPCR扩增扩增探探针针亲和固亲和固相介质相介质检测探检测探针信号针信号可用于基因芯片制作可用于基因芯片制作30/437 7 7 7）原位）原位）原位）原位原位聚合原位聚合酶链式反式反应（InStillPCR,IsInStillPCR,IsPCRPCR）是）
15、是由由HaaseHaase等于等于19901990年首年首创。它是利用完整。它是利用完整细胞作胞作为一个一个微小反微小反应体系来体系来扩增增细胞内目胞内目标片段片段,在不破坏在不破坏细胞前胞前提下提下,利用一些特定利用一些特定检测伎伎俩来来检测细胞内胞内扩增增产物。物。直接用直接用细胞涂片或石蜡包埋胞涂片或石蜡包埋组织切片在切片在单个个细胞中胞中进行行扩增。可增。可进行行细胞内定位和胞内定位和检测病理切片中病理切片中含量含量较少靶序列。少靶序列。31/43操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目片段3.原位杂交
16、检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表示32/438 8 8 8）逆转录酶逆转录酶聚合酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCRPCR扩增扩增33/439)9)9)9)荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCRPCRPCR（real-time PCR)real-time PCR)real-time PCR)real-time PCR)经过荧光染料或光染料或荧光光标识特异性探特异性探针,对PCRPCR产物物进行行标记跟踪跟踪,实时在在线监控反控反应过程程,结合合对应软件能件能够对结果果进行分析行分析,计算待算待测样品初始模板品初始模板量。量。内掺式染料内掺式染料SYB
17、R GreenSYBR Green I序列特异性探针序列特异性探针Taqman Taqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)引物特异性探针引物特异性探针 Amplifluor(Intergen)Amplifluor(Intergen)34/435353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I 35/43 实时荧光定量实时荧光定量PCR仪仪梯度梯度PCR仪仪普通普通PCR仪仪36/43PCR示例示例一、实验目学习学习PCRPC
18、R分析原理与技术。分析原理与技术。37/431 1、材料：含、材料：含1Kb1Kb插入片段克隆载体插入片段克隆载体Pmd18-TPmd18-T 质粒质粒DNADNA2 2、仪器：微量移液器及吸头、仪器：微量移液器及吸头、PCRPCR仪及仪及PCRPCR管管 琼脂糖凝胶电泳设备琼脂糖凝胶电泳设备3 3、试剂：、试剂：1010X XPCRPCR 反应缓冲液反应缓冲液 25mmol/L MgCl 25mmol/L MgCl2 2 10mmol/L dNTP10mmol/L dNTP 10 10mol/L mol/L 引物引物1 1和引物和引物2 2二、试验材料、仪器和二、试验材料、仪器和试剂试剂38
19、/431.1.按照以下体积向按照以下体积向PCRPCR管中按次序加入各试剂管中按次序加入各试剂 并混匀：并混匀：10 X PCR反应缓冲液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 质粒DNA 1.0 L Taq 0.1 L(5U)水补充至 25.0 L三、操作步骤三、操作步骤39/432.2.按照以下体积向按照以下体积向PCRPCR管中按次序加入各试剂管中按次序加入各试剂 并混匀：并混匀：10 X PCR反应缓冲液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 质粒DNA 1.0 L Taq 0.1 L(5U)水补充至 25.0 L三、操作步骤三、操作步骤40/4341/433.3.反应完成后反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按将反应液与凝胶电泳缓冲液按百分比混匀百分比混匀,上样电泳。上样电泳。三、操作步骤三、操作步骤琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳42/43TheEnd！43/43
