1、 第二章 酶的发酵工程 酶工程 第二章 酶的发酵工程 所有的生物为了维持其正常的生命活动，在一定 的条件下都能够合成其自身生长所需要的各种酶，酶 的种类和数量是受到细胞自身的严格调控的。 通过人为的操作控制，利用生物细胞的生命活动 来大规模发酵生产人们所需要的酶的技术过程，称为 酶的发酵生产。 酶的制备方法：提取法、发酵法、合成法。 第二章 酶的发酵工程 酶工程 第一节 酶生物合成的调节机制 第二节 酶的发酵技术 第三节 酶发酵动力学 第二章 酶的发酵工程 酶工程 第一节 酶生物合成的调节机制 一、原核生物中酶生物合成的调节 原核生物酶的合成主要是在转录水平上进行调节，调 节方式主要有酶合成的
2、诱导和酶合成的阻遏两种方式。 原核生物中酶合成的诱导和阻遏作用机制都可以用 Jacob和Monod提出的操纵子理论来解释。 第二章 酶的发酵工程 酶工程 （一）乳糖操纵子学说 操纵子：由调节基因（R）、启动子（P）、操纵基因 （O）和结构基因（S）所构成的一个完整的基因表达单位。 1. 基本概念 诱导物：诱导酶起始合成的物质。 辅阻遏物：阻遏酶产生的物质。 调节蛋白：调节基因产生的一种变构蛋白。两个结合 位点：操纵基因结合位点、效应物结合位点。两种类型：阻 遏蛋白、阻遏蛋白原。 第二章 酶的发酵工程 酶工程 （1）乳糖操纵子的结构 IPOZYA -半乳糖苷酶透过酶乙酰基转移酶 诱导物 阻遏蛋白
3、 cAMP-CAP RNA聚合酶 mRNA （2）阻遏蛋白的负性调节；（3）CAP的正性调节 2. 乳糖操纵子的诱导机制 DNA 第二章 酶的发酵工程 酶工程 （二）色氨酸操纵子学说 磷酸核糖邻氨基苯甲酸 分支酸 邻氨基苯甲酸 羧苯氨基脱氧核糖磷酸 吲哚甘油磷酸 色氨酸 邻氨基苯甲酸合酶 邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶 磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶 吲哚甘油磷酸合酶 色氨酸合酶 第二章 酶的发酵工程 酶工程 1. 操纵子的调节作用 RPODBACE 阻遏蛋白原 辅阻遏物 （色氨酸） mRNA DNA 第二章 酶的发酵工程 酶工程 2. 衰减子的调节作用 RPODBACE 低色氨酸 高色氨酸 前导序列
4、 4 3 2 1 DNA 1 2 4 3 5/ - mRNA Pr 4 3 2 1 第二章 酶的发酵工程 酶工程 （三）酶生物合成的诱导作用 酶 合成方式 组成酶：细胞所固有的酶 诱导酶：在诱导物的诱导作用下合成的酶 诱导物 底物、产物、底物结构类似物（IPTG） 诱导 作用 协同诱导：诱导物同时诱导几种酶的合成 顺序诱导：先后诱导不同酶的合成 生物学意义： 节约机制； 环境适应能力 第二章 酶的发酵工程 酶工程 （四）酶生物合成的阻遏作用 1. 终产物阻遏 某一代谢（合成）途径的终产物阻遏合成途径中 酶的合成的现象。 ABCDE E1E2E3E4 第二章 酶的发酵工程 酶工程 2. 分解代谢
5、物的阻遏作用 当培养基中存在两种碳源（底物）时，容易利用的 碳源的分解代谢产物阻遏分解代谢另一种碳源的酶的合 成的现象。 葡萄糖效应：葡萄糖抑制微生物利用其他碳源（底 物）的现象 。 IPOZYA cAMP-CAP 第二章 酶的发酵工程 酶工程 二、真核生物中酶生物合成的调节 （一）细胞分化改变酶的生物合成 如：端粒酶的生物合成 （二）基因扩增加速酶的生物合成 如：爪蟾卵细胞形成时，rRNA的基因数增加4000倍； 中国田鼠细胞培养在含有氨甲基蝶呤的培养基中生长时， 细胞中编码二氢叶酸还原酶的基因大量扩增，以合成大量 的二氢叶酸还原酶。 第二章 酶的发酵工程 酶工程 （三）增强子促进酶的生物合
6、成 增强子：是一段能够提高转录效率的特定DNA序列，长 约100200bp，核心组件812bp，单拷贝或多拷贝串联存在 。 增强子的作用特点 ： （1）提高同一条DNA链上基因的转录效率，可远距离发 挥作用，在基因的上游或下游均可起作用。 （2）与其序列的正反方向无关。 （3）要有启动子才能发挥作用，但对启动子没有严格的 专一性。 （4）必须与特定的蛋白质因子结合才能发挥作用，具有 组织和细胞特异性。 第二章 酶的发酵工程 酶工程 三、酶生物合成调节作用机理的实际应用 （一）发酵中的应用 （二）酶生产中的应用 （三）微生物菌种选育中的应用 第二章 酶的发酵工程 酶工程 第二节 酶的发酵技术 利
7、用微生物的发酵作用，运用一些技术手段控 制发酵过程，大规模产酶的技术，称为酶的发酵技 术。内容主要包括：菌种的选育、培养基的配置、 培养条件控制、发酵方法。 第二章 酶的发酵工程 酶工程 一、酶的生产菌种 （一）产酶微生物的种类 1. 细菌：大肠杆菌青霉素酰化酶、L-天冬酰胺酶； 枯草芽孢杆菌中性蛋白酶、中温-淀粉酶； 地衣芽孢杆菌高温-淀粉 2. 放线菌：葡萄糖异构酶、谷氨酰胺转氨酶 3. 酵母菌：凝血激酶、尿激酶、植酸酶 4. 霉菌：黑曲霉、米曲霉-淀粉酶、糖化酶、乳糖酶 、 脂肪酶；理氏木霉木聚糖酶、纤维素酶； 青霉葡萄糖氧化酶、5/-磷酸二酯酶 第二章 酶的发酵工程 酶工程 （二）产酶
8、菌种的要求 （1）酶的产量高； （2）容易培养和管理，产酶细胞容易生长繁殖，适应性强，便 于管理； （3）菌株遗传性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体，保 证生产的稳定性； （4）菌株能利用廉价原料，发酵周期短，生产成本低； （5）有利于酶产品的分离纯化，最好是分泌型的胞外酶； （6）菌株安全可靠，非病原菌，不产毒素及其它有害物质，不 影响生产人员的身体健康； （7）基因工程菌必须符合安全性要求。 第二章 酶的发酵工程 酶工程 （三）菌种筛选 1. 含菌样品的采集 根据不同微生物的生态分布特点，从自然界中采样。 产酶微生物的分布基本规律 ： （1）相近菌种产生的酶性质一般相近或相似。 （2）
9、胞外酶的稳定性和最适条件通常和菌的最适生 长条件接近。 （3）为获得能降解某种物质的产酶菌株，一般可从 该物质分布比较丰富的地方寻找。 第二章 酶的发酵工程 酶工程 2. 菌种的分离纯化 平板划线法、稀释涂布分离法 3. 产酶性能的测定 初筛： 快速、简便；平板筛选法有色圈。 复筛： 精确；液体或固体培养发酵，测定产酶水平。 4. 菌种的选育 诱变育种、杂交育种、原生质体融合育种、基因工程育种 5. 菌种的保藏 斜面低温保藏法、沙土管保藏法、石蜡油封藏法、真空冷 冻干燥法、超低温保藏法、固体曲法等。 第二章 酶的发酵工程 酶工程 6. 菌种的退化与复壮 （1）菌种退化现象：随着菌种保藏时间的延
10、长或多次 的转接传代，菌种本身所具有的优良遗传性状发生了不利 于发酵生产的遗传变异现象。 （2）防止退化措施：创造合适的培养条件，采取有效 的菌种保藏方法，尽量减少传代次数。 （3）退化菌种的复壮：纯种分离和性能测定。包括已 发生退化菌种的复壮和菌种退化之前的复壮和提高。 第二章 酶的发酵工程 酶工程 （四）菌种活化与扩大培养 1. 菌种扩大培养 保藏菌种试管斜面活化三角瓶培养种子罐培养 2. 种子制备的过程 防止杂菌污染，减少转接次数，避免种子培养基的长时 高温灭菌；培养基及培养条件是细胞生长繁殖的最适条件； 培养时间以对数生长期为宜。 第二章 酶的发酵工程 酶工程 3. 种子质量的控制 （
11、1） 影响种子质量的因素及其控制 培养基 营养成分丰富，尽可能满足细胞生长繁殖； 营养成分尽可能与发酵培养基接近；pH值稳定 培养条件 必须是菌种细胞生长繁殖的最适条件；包括 温度、pH值、通气搅拌、通风、翻曲、湿度 种龄 生命力最为旺盛的对数生长期。细菌：724h; 霉菌：16 50h; 放线菌：2164h; 第二章 酶的发酵工程 酶工程 种子质量的判断 细菌、酵母菌 菌体健壮，菌形 一致，均匀整齐，一定的排列和形态； 霉菌、放线菌菌丝粗壮，染色力强，生长旺 盛，菌丝分枝和内含物情况良好。 种子的异常情况 菌种生长缓慢或过快，菌丝结团 接种量 与菌种特性、种子质量和发酵条件有关。 0.1 1
12、0% 第二章 酶的发酵工程 酶工程 （2） 种子质量的控制措施 菌种稳定性检查：保藏菌种 无（杂）菌检查：显微镜观察，肉汤或琼脂斜面培养 生化分析：养分消耗速度，pH变化，溶解氧利用， 色泽，气味等 第二章 酶的发酵工程 酶工程 二、培养基和培养条件对产酶的影响与调节 （一）培养基成分对产酶的影响 1. 碳源 淀粉及其水解物 2. 氮源 无机氮和有机氮 3. 无机盐类 大量元素和微量元素 4. 生长因子 氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素、激素 5. 产酶促进剂 表面活性剂、植酸钙镁、LS、聚乙烯 醇、EDTA等 第二章 酶的发酵工程 酶工程 （二）培养条件对产酶的影响与调节控制 1. pH对产酶的影响与调节控制 细菌、放线菌：中性至微碱性；霉菌、酵母菌：微酸性 培养基pH的改变会影响产酶的种类或比例
