1、常用基因检测方法原理与局限 单击此处添加副标题 陈白雪 Oct. 31, 2018 1 染色体病：染色体畸变引起 单基因遗传病 常染色体显性遗传：携带杂合致病突变即可发病。 常染色体隐性遗传：携带纯合致病突变或复合杂合 突变才能发病。 伴X连锁遗传 伴Y连锁遗传 多基因遗传病：多基因、环境因素联合 作用导致疾病发生 线粒体遗传病：呈母系遗传 （复习：母 系遗传=患病女性所有子女都患病？） 2 没有哪一种检测方法能够搞定所有 的事情，如果有，那就是忽悠 没有一种药包治百病，如果有，那就是 毒药 3 复习 遗传病的基因检测，本质上就是以参考基因为基准，对样本基因进行校对 4 碱基 染色体 片段 外
2、子 染色体 字句段落 章册 5 经典的直接测序方法，基因突变检测 的“金标准” 检测范围： 细胞核基因 线粒体基因 检测精度：20个以内碱基的替换、缺 失、重复 局限性 仅适用于目标基因明确的单基因遗传病 检测 一代测序/Sanger测序 6 Sanger测序应用举例 7 探针与待检测基因序列进行特异性杂交，通过探针的连接、PCR扩 增，收集数据并进行分析 可应用于缺失、重复突变检测，主要针对基因外显子。 亦可用于分析特定的点突变（通常是热点突变），前提是试剂盒里 已经有针对该突变设计的探针 多重连接酶依赖性探针扩增技术（MLPA ） 8 技术原理 9 MLPA探针结构 扩增产物毛细管 电泳结
3、果 10 11 片段分析（Fragment Analysis，FA） 借助毛细管电泳，检测待测物（通常为PCR扩增产物）中是否有特定长度 （范围）DNA片段出现 无法检测出序列内部的碱基改变 例如“SRY基因片段分析”项目：提取样本总DNA后，用SRY基因特异引物进行PCR 扩增，并将扩增产物进行毛细管电泳，观察是否有目标长度的扩增产物 片段分析的应用范围广泛 12 一对染色体分别来自父母。当缺失 了其中一方来源的染色体（LOH） ，或者是某一对染色体同时来自父 或母亲的一方（单亲二倍体，UPD ） UPD可以发生在局部，也可发生于 整个染色体组 如果发生在染色体“印迹区”，则 可导致疾病发生
4、 可用于单亲二倍体/LOH的检测 片段分析（Fragment Analysis，FA） 以下为全染色体组UPD的CMA结 果 13 对样本目标序列进行甲基化特异性 PCR后，印迹（DNA甲基化状态） 不同的序列会发生碱基的改变，并 扩增得到长短不一的片段 借助毛细管电泳，检测待测物（通 常为PCR扩增产物）中是否有特定 长度DNA片段出现 14 15 低通量检测：“有的放矢” Sanger序MLPAFA 已知微小突 未知微小突 大片段重复/缺失* UPD（双体） 突* * ：FA分析大片段缺失需要明确具体缺失范围，而MLPA只需要明确基因即可 *：理论上Sanger测序也能数动态突变重复单位个
5、数，但人工数易出错，且当 片段过长时容易超出Sanger测序分析的范围。 猜中“有奖” 猜不中“白折腾 ” 16 G显带染色体核型分析技术仍然是细胞遗传学产前诊断的“金标准” 应用范围 使染色体大小和形态一目了然,特别是发生在染色体上的遗传疾病，如染色体倒位、易 位、互换和短缺，都可以及时发现,有利于临床诊断 局限性 细胞培养耗时长、分辨率低以及耗费人力 对线粒体病无能为力 染色体显带技术，Chromosome banding 报告单出现类似右边的图像_ 就是核型报告 有该项目疑问请咨询 陈帆 吴梦华 47，XX，+21 17 应用范围 儿童复杂、罕见遗传病，如：智力障碍、生长发育迟缓、多发畸
6、形、孤独症样临床表现，排 除染色体病、代谢病和脆性X综合征之后的全基因组CNV检测 （包括智力低下、发育迟缓、 多种体征畸形以及自闭症中，CMA比传统G显带核型分析技术的检出率提高了10） 对自然流产、胎死宫内、新生儿死亡等妊娠产物的遗传学检测 可以检测出同源性单亲二倍体（UPD） 局限性 无法检出染色体倒位,易位,互换等结构变异 染色体微阵列分析 Chromosome microarray analysis, CMA 相当于升级版的核型分析，能查到比普通核型分析 更加细小的拷贝数改变以及单亲二倍体。 但是结构改变不行 撕成一一的再拿 去校，就不能出 装 了 18 21345678 1357
7、1 5 7 正常 19 21345678 1357 1 5 1 同源UPD 20 21345678 1357 1 5 3 异源UPD 21 22 PWS/AS：CMA or FA？ CMAFA 核基因全局分析 患者，区分PWS/AS 患者，区分 LOH/UPD 对于首选片段分析（FA）方法的PWS/AS患者， 先做3370项目（协助确诊）。 若结果为阳性，可以再做3381（协助判断预后） 注意：若患者为异源性UPD，则CMA无法检出， 但片段分析项目可以 23 优势：能同时对无数条DNA分子进行序列测定，效率极高 技术特点：每次测很短的片段（读长较短），但是可以通过超大量的平行测序，获得 大量
8、的序列。 “下一代”测序技术 Next-generation sequencing , NGS 24 （某个位点的）深度：这个位点 被测的次数 read(s)：测序直接得出的短序列 相当于把几本一样的书撕碎了（一份DNA溶液里面有无 数条DNA分子）。再叫一堆人（一个人就是一个read） ，每人发一个碎片校对。 由于撕碎是随机的，会有N个人校对到同一个句子（N= 深度）。一个地方被校对的次数越多，校对结果准确性 就越高。 25 高通量检测：“鸟枪法” 核型分析CMANGS 核基因全局分析* 大片段缺失/重复=3M=100k* 构改 二倍体（UPD） 本培养 * ：仅限于全基因组测序能做到核基因组全局分析，若只是全外显子组或者 Gene Panel则不行。 *：不能保证检出，若检出则需经过其他实验（例如MLPA）验证 。 保证中彩票头 奖的方法： 把所有号码都 买了 26 Thanks. 27
