1、组织培养细胞染色体的制备 实验五 n实验目的 n实验原理 n实验试剂与仪器 n实验步骤 n注意事项 n了解组织细胞的培养方法。 n掌握染色体标本的制备方法。 一、实验目的 二、实验原理 二、实验原理 n处于指数生长期的细胞，经过短期培养后 ，用秋水仙素处理，可把细胞分裂阻截在 中期，再经过低渗、固定、滴片和染色， 就可获得大量中期分裂相的细胞，制片后 可以清楚地对染色体进行观察。 n材料：具有很强生长分裂能力的细胞系（Hela细胞、 白血病K562细胞、C2C12，BHK细胞等） n仪器：恒温培养箱、离心机、显微镜 培养瓶、移液管、载玻片 n ：培养液（RPMI1640、M199、DMEM等）
2、、 胎牛血清、双抗、NaHCO3、生理水、肝素、 1.0g/L秋水仙素溶液（0.1%）、低渗液（0.075M/L KCl）、固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)、Giemsa染液 三、实验试剂及仪器 1. 秋水仙素 阻止微管组装，破坏纺锤体阻断细胞有丝分裂 。 使染色体收缩成一定的形状。 目的 : 获得大量的中期分裂相细胞。 2. Carnoy固定液 新配置的甲醇 ：冰醋酸混合液 (3:1)。 能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的 完整性，还能够增强染色体的嗜碱性，达到优良 染色效果 3. 低渗液（ 0.075M/L KCl ） 低渗的目的是凭借反渗透作用使细胞膨胀（但不 破裂）染色体铺展，同
3、时可使粘附于染色体的 核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有 染色体形态 4. 染料 （ Giemsa ） 不是一种单一染料，而是天青、伊红、甘油和 甲醇的混合物，配制后原液储存， 染色后，染色质呈红色，细胞核是蓝色。 四、实验步骤 培养液4ml 胎牛血清1ml 培养24小时 每ml培养液 加1ug 继续培养3-5小时 培养 秋水仙素 培养瓶 取样 取1ml培养液于 10ml离心管 1. 1000rpm 离心5分钟 弃上清 离心 2. 加KCl 8ml 混匀 37处理20分钟 低渗 3. 预固定固定 加3-4滴固定液 ，轻轻吹打后， 离心去上清 二次固定 4.5. 6. 加3ml固定液， 2
4、min后轻轻吹 打后，固定 10min,离心去 上清 加3ml固定液，轻 轻吹打后，固定 10min后，离心去 上清 三次固定 （同6） 制片 预冷冰片 距离20cm以上 玻片倾斜30 迅速吹气 过火焰 3-5次 7.8. 9. 空 气干燥 Giemsa 染色10min 细水流冲洗 染色 10.11. 12. 吹干 镜检 13. 14. 1）秋水仙素处理时间要把握好，时间过长，分裂细胞多 ，染色体短小；反之，则少而细长 2）低渗之后，要细心、温柔混匀细胞，防止细胞膜破裂 、染色体散失； 3) 离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之 ，细胞易丢失； 4) 载玻片要洁净，预冷；滴片时确定将
5、材料滴在玻片上 ； 五、注意事项 实验步骤 1.秋水仙素预处理: 收集生长旺盛的细胞1ml，轻轻吹 打散，加入秋水仙素1ul，继续培养6-8小时（已完成 ）； 2. 预处理后的细胞，以1000rpm离心5min，去上清； 3. 低渗处理：加入1ml低渗液，轻轻吹打，使细胞重悬 ，然后补加7ml低渗液，室温下静置20min 4. 预固定：加入3-4滴固定液后，轻轻混匀，避免粘 连，1000rpm离心5min，去上清； 5. 固定：沿管壁慢慢加入3ml固定液，2min后用吸 管轻轻吹打，使细胞分散，固定10min后， 1000rpm离心5min，去上清； 6. 二次固定：加3ml固定液，吹打均匀，
6、固定10min 后，1000rpm离心5min，去上清； 7. 三次固定：重复第6步； 8. 制悬液：去上清后剩0.5ml固定液，用吸管轻轻吹 打使其成为细胞悬液； 9. 滴片：将冰冷的载玻片倾斜30，吸取细胞悬液 距离载玻片至少1m滴于载玻片上，吹散，空气干 燥； 10. 染色：在干燥的载玻片上滴Giemsa，染色 10min，细水冲洗后，空气干燥； 11. 镜检：在低倍镜下寻找染色体分散良好、染色 适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。 小鼠中期胞染色体 （2N=40） 小鼠染色体核型分析 人类慢性骨髓性白血病 （chronic myelogenous leukemia） Chr9和Chr22相互易位 使得Chr9上的c-abl oncogene和 Chr22上的bcr gene相连，形成融合基 因。 其产物是一个融合蛋白 这个融合蛋白使细胞不受细胞周期的 控制，导致白血病。 只要一个细胞带有这种易位Chr，就 会致病。 猫叫综合征（Cat cry syndrome） 临床表现： 喉部发育不良，哭声似猫叫 身体与智能发育不全，小头畸形，满月形脸，眼距宽，低耳位，高鼻梁 在婴儿期或幼儿期夭折 病因： 5号染色体短臂缺失，5p-综合征
