1、病毒的细胞培养 赵健乔 一 基本原理 二 细胞培养的基本概念 三 主要优点 四 培养实验用品的前期处理 五 培养细胞的生长方式及类型 六 细胞培养的实验步骤 七 病毒的细胞培养 一 基本原理 通过机械解离或消化等方法将组织或细胞从机体 取出，分散成单个细胞，给与必要的生长条件。 模拟体内生长环境，使其在体外能继续生长与增 值。 在长成致密单层细胞后，将病毒接种在细胞上， 置于适当环境中进行培养，逐日观察细胞病变（ CPE）待75%的细胞出现CPE后收获细胞，反复 冻融3次，置-70保存备用。 细胞培养的基本概念 传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后 ，被分开接种到新的培养器皿中。 原代培养：取
2、自体内新鲜组织并置于体外 条件下生长的细胞在传代之前称为原代培 养。 二 主要优点 研究的对象是活的细胞。 研究的条件可以人为的控制。 研究的样本，可以达到比较均一性。 研究的内容便于观察、检测和记录。 研究的范围比较广泛。 研究的费用相对较经济。 三 分类 原代细胞培养 传代细胞培养 原代细胞培养 概念：从供体获取组织细胞后在体外进行 的首次培养。 优点：生物学特性未发生很大变化，细胞 染色体仍为二倍体，接近和反映体内生长 特性，适合做药物测试、细胞分化及病毒 学方面的实验 缺点：传代次数较多细胞就会衰亡。 传代细胞培养 概念：原代细胞经过一系列传代，产生变 异，转化为能够连续传代的细胞。
3、传代细胞可以直接从肿瘤组织获得，又可 以通过人工驯化获得。 常用的传代细胞：PK-15、IBRS-2、Vero 、Marc-145、CHO、MDCK、CRFK、 Hela 等 四 培养实验用品的前期处理 1.清洗和浸泡: (1)玻璃器皿 (2)塑料器皿 2.包装 3.消毒：在组织细胞培养技术中，务必保 证组织细胞在无微生物的条件下生长。 4.细胞培养用液及培养基（液）: （1）水：蒸馏水、双蒸水，可高压除菌。 （2）平衡盐溶液（PBS)：PH为7.27.4，不含钙镁离子 ， 可高压除菌。 （3）消化液 : 胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为025，pH值7.2左 右。需过滤除菌。 EDTA液：常
4、用浓度为 002，配制时采用无Ca2+、 Mg2+平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。 (4) 培养基 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的 溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡 胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产 物的提取和实验结果的分析，易发生支原体污染 合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数 量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多 种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化 合物、无机盐
5、和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本 低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生 长需要。 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想 使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天 然培养基（如血清）。 血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子 激素 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原 等。 各种生长因子 转移蛋白 不明成分 一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞 可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加10 血清 对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明 ，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚 血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎
6、牛血清、新生牛血清、小牛血情、 兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无 细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟 （5）丙酮酸钠、葡萄糖：是属碳水化合物的成分，是细 胞生命的能量来源。 （6）抗生素：最终浓度为青霉素 100 Uml，链霉素 100Uml（青霉素为80万U瓶，将其溶解于4ml三蒸水 中，每升培养液中加人0.5ml；链霉素为100万U瓶，将 其溶解在5ml三蒸水中，每升培养液加0.5ml）。 （7）冻存液：二甲基亚砜 （8）细胞生长液：是用以维持细胞生长增殖的液体。 其是配方： 基础培养基 8090
7、血清 10% 双抗 100u/ml （9）细胞维持液：用以维持细胞缓慢生长或不死的培养 液。 其是配方： 基础培养基 95 血清 25 双抗 100u/ml 五 培养细胞的生长方式及类型 贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大 体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难 以确定其稳定形态的细胞。 悬浮生长型细胞 不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。 每代贴附生长细胞的生长过程 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期） 贴附生长型细胞 细胞培养常用的培养瓶、 培养皿、6孔板、96孔板 悬浮生长型细胞 六 细胞培养的实验步骤 1原代细胞的培养 以鸡胚成纤维细胞为例
8、 （1）取胚 （2）组织处理 （3）消化 （4）分装、培养 （1）取胚 选取9-11日龄SPF鸡胚，大头朝上直立于蛋 架上，用碘酒、酒精消毒气室外壳。用镊 子从气室端打开蛋壳，撕开壳膜，用无菌 镊子轻轻取出鸡胚，放入灭菌平皿中。 （2）组织处理 用PBS液冲洗胚体2-3次，再将鸡胚的头、 爪、内脏去除，剩下的胚体在用PBS液冲 洗胚体2-3次，然后再放入平皿中，用剪刀 将鸡胚剪成碎块。 （3）消化 用PBS液充分冲洗组织碎块2-3次，加入3-5 倍量的胰蛋白酶消化液，置37消化10分 钟，每隔2-3分钟轻轻摇动一次。待组织碎 块聚合成团，边缘毛样模糊时取出，轻轻 吸取上层消化液，加适量DMEM
9、培养液， 用吸管反复吹打，使细胞分散。 （4）分装、培养 将细胞悬液移入细胞培养瓶中，在细胞培 养瓶中加入到10ml DMEM，充分混匀，让 细胞呈单个形式存在，最后将其放入恒温 箱中培养。 2传代细胞的培养 （1）细胞的复苏 （2）细胞的传代 （3）细胞的换液 （4）细胞生长状况的观察 （5）细胞的冻存 （1）细胞的复苏 概述 复苏细胞与冻存的要求相反，应采用快速融 化的手段。这样可以保证细胞外结晶在很短的时 间内即融化。避免由于缓慢融化使水分渗入细胞 内形成胞内再结晶对细胞造成损害。 操作步骤 准备好培养瓶、培养液和离心管等放于超净工作台内。 从保存液氮或低温冰箱中冻存管（安瓶）的小袋或冻
10、存盒内取出的 冻存管（安瓶）应直接投入37温水中，并轻轻摇动令其内容尽快融 化。 从37水浴中取出冻存管或安瓶，离心1000r1min,用酒精消毒 后开启，用滴管吸出上清液，注入培养液1ml充分混匀，转入刻度离心 管制成细胞悬液后低速离心，除去上清液，必要时再重复用培养液洗 一次。 用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放入CO2培养箱静置培养，次 日更换一次培养液。继续培养。如果复苏时细胞密度较高要及时传代 。细胞复苏时细胞数可以做1020倍稀释，接种密度以5105 ml为 宜。 （2）细胞的传代 原理 在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和（细胞增值 达到一定密度后），为使细胞能继续生长，同时也将
11、细胞 数量扩大，就必须进行传代（再养）。传代培养也是一种 将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各 种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁 细胞需经消化后才能分瓶。 操作步骤 将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 用1-2ml营养液或PBS缓冲液，清洗培养瓶，倒出 加入1ml含有EDTA的胰酶，清洗五面，倒出 在加入1ml含有EDTA的胰酶，当看到培养瓶上含有 一两个小空斑，也可看到有灰白色浑浊时，将胰酶倒掉 加入培养液，用移液管吹洗贴有细胞的一面，将细 胞从培养瓶壁上吹下来 然后进行传代 消化传代的步骤 （3）细胞的换液 原理： 当细胞的量很少，未能铺满整个生长表 面
12、，但细胞培养液的pH值已经发生很大变 化；或者是细胞形态很差等情况时，需要 给细胞换液。 操作步骤 （1）吸弃或倒掉培养瓶内的旧培 养液 （2）加入PBS溶液清洗细胞瓶五 面 （3）加入足量的细胞生长液，放 入37、5%CO2培养箱静置培养 。 （4）细胞生长状况的观察 原理： 应每日或隔日观察一次细胞，及时了 解细胞形态、数量及培养液pH值、污染与 否等情况，以便采取相应的措施处理。 肉眼观察 显微镜观察 （5）细胞的冻存 传代细胞应有充足的冻存储备。 一则防止细胞因污染等原因造成细胞系的 绝种。 二则防止细胞因传的代次太多，造成细病毒增殖技术 动物增殖病毒技术 禽胚增殖病毒技术 细胞增殖病
13、毒技术 一、动物增殖病毒技术 选择动物的标准： 大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应病毒疫苗 、青壮年和健康(经临床检查、检疫)； 对相应病毒易感，并十分敏感； 经隔离饲养和观察检查证明健康； 家兔、小鼠、大鼠等应符合普通级或清洁级实验动物标 准；鸡应属非免疫鸡或SPF级标准；犬和猫应品种明确， 并符合普通级实验动物标准； 体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大。 二、禽胚增殖病毒技术 （一）禽胚的选择 SPF鸡胚 据国家标准，无22种特定病原体 非免疫鸡胚 应无特定病原的母源抗体， 普通鸡胚 可能带有鸡的多种病原体，不适用于疫苗生产 异源性性疫苗：鸭胚和鸽胚 （二）禽胚接种途径与收获 绒
14、毛尿囊膜接种法 尿囊腔接种法 卵黄囊接种法 羊膜腔接种法 静脉接种法 脑内接种法 鸡胚绒毛尿囊膜接种法 尿囊腔接种法 尿囊液收获方法 鸡胚卵黄囊接种法 1种蛋质量 病原微生物：垂直传递，如白血病、脑脊髓炎、腺病毒、 支原体及传染性贫血因子等。 母源抗体： 抗生素：立克次氏体和鹦鹉热衣原体 2孵化技术 温度：3739.5。传染性支气管炎病毒37 湿度：鸡胚5357，水禽胚比鸡胚高510。 通风：氧气，二氧化碳。 翻蛋： （三）影响禽胚增殖病毒的因素 3接种技术 不同病毒的增殖有不同的接种途径， 同一种病毒接种不同日龄禽胚获得的病毒量也不同。 接种日龄：鸡胚1314日龄。鸭胚1516日龄，尿囊液含
15、 量最高，平均约68ml，羊水约12ml。 接种部位：不应伤及胚体和血管，以免影响其发育 严格防止禽胚污染 鸡胚接种时严格无菌操作； 定期清扫消毒孵化室，保持室内空气新鲜； 种蛋入孵前先用温水清洗，消毒，凉干。 三、细胞增殖病毒技术 1细胞培养的概念 细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化学方法使动物 组织或传代细胞分散成单个乃至24个细胞团悬液进行培养 。 细胞分类：根据细胞染色体和繁殖特性 原代细胞(primary cell) 细胞株(cell strain) 传代细胞（continued cell line） 细胞系(cell line) （1）原代细胞(primary
16、 cell) 指由新鲜组织经剪碎和胰酶消化制备的细胞，如CEF细胞。 （2）细胞株(cell strain) 又称二倍体细胞 指自继代培养的细胞中选育出具有特殊生物学性质和标记的 细胞。这类细胞且能保持原来的二倍染色体数目，能连续传很 多代(50100代)，但为有限生命；没有肿瘤原。如PKl5、 BHK21和Vero （3）传代细胞（continued cell line） 细胞系(cell line) 能在体外无限传代，应用方便，其染色体数目及增殖特性均 类似于恶性肿瘤细胞，且多来源于癌细胞，如HeLa细胞系 静置培养 转瓶培养 悬浮培养(suspension cell culture )
17、微载体培养(microcarrier cell culture) 中空纤维细胞培养(hollow fibre cell culture) 微囊化细胞培养 2细胞培养方法 悬浮培养 通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内 的培养方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细 胞，如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。 微载体培养 微载体直径应为60105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培 养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收 培养液和化学反应，表面光滑、硬度小、有弹性，易于细胞 吸附在表面，如DEAESephadexA-50、Cytodexl、 Cytodex2、Cytodex
18、3等。 微载体培养的容器为特制的生物反应器，有自动化装置。细 胞产量达106107个/m1，每升培养液可加微载体25g，每 克有80009000个珠子，培养面积约为25万cm2，比常规 培养面积大1025倍。 中空纤维细胞培养(hollow fibre cell culture) 组成:中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵 中空纤维由乙酸纤维、聚氯乙烯丙烯复合物或多聚碳酸硅等 材料制成，外径50100m，壁厚2575m，壁呈海绵状，上面 有很多微孔。 中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜，允许营养物质和 代谢废物出入，而对细胞和大分子物质（如单克隆抗体）有滞 留作用。 培养液能有效
19、地分布，细胞培养维持时间可达数月，保持高度 活性，培养的细胞密度大，细胞分泌的蛋白质浓度高，纯度可 达6090；占用空间小，适于各类细胞，但设备昂贵。 培养液 血清 细胞接种量 pH 温度 无菌条件 培养器皿清洁度 3. 细胞培养要素 RPMI-1640、199 、 DMEM、F12 血清 成分：必需氨基酸、促进细胞生长和贴壁的成分。-珠蛋 白和白蛋白能促进细胞生长；白蛋白具有毒作用；糖蛋白 、a2-球蛋白和脂蛋白G2能促进细胞贴壁。 血清选择：同种动物优于异种动物血清；人和牛血清优于 马血清；马血清优于兔血清和鸡血清。 血清使用：目前国内多用犊牛血清，使用前须经56灭活 30min，并进行细胞毒性试验。生长液血清含量一般为5 20。维持液中血清量为0%5。 血清替代因子：激素和生长因子（如胰岛素、上皮生长因 子）、结合蛋白（如转铁蛋白）、贴壁因子（如鱼精蛋白 、聚赖氨酸）和微量元素（如硒）四类几十种，多数无血 清培养液须补加38种血清替代因子。 细胞接种量 细胞在生长过程中分泌刺激细胞分裂的物质，若细胞量太少， 这些物质分泌量少，而作用也小。 接种细胞数量越大，细胞生长为单层的速度越快，但细胞过多 对细胞生长也不利。 鸡胚成纤维细胞为100万m1 小鼠或地鼠肾细胞为50万
