1、ICS 11.080.99 C 47 备案号 DB42 湖北省地方标准 DB 42/T 14122018 医疗机构物体表面清洗效果现场快速检测-ATP 生物荧光法 Rapid detection of surface washing effect in medical institution - ATP bioluminescence method (报批稿) 2018 - 09 - 04 发布 2018 - 11 - 24 实施 湖北省质量技术监督局 发 布 DB42/T 14122018 I 目 次 前言 . III 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4
2、 方法原理 . 2 5 设备与试剂 . 2 6 工作环境 . 2 7 校准曲线绘制 . 2 8 操作步骤 . 3 9 样品 ATP 含量和洗手后 RLU 值下降率的计算 . 3 10 清洗效果预警值 . 4 附录 A（资料性附录） ATP 生物荧光法参数 . 5 附录 B（规范性附录） ATP 生物荧光法物体表面采样检测方法 . 8 DB42/T 14122018 II DB42/T 14122018 III 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。 本标准由湖北省卫生计生委提出并归口管理。 本标准主要起草单位：武汉市疾病预防控制中
3、心、湖北省疾病预防控制中心。 本标准参与起草单位：武汉市医院感染管理质量控制中心、武汉市中西医结合医院、武汉市第三医院、武汉市中心医院、湖北省妇幼保健院、武汉市第八医院。 本标准主要起草人：许慧琼、张天宝、梁建生、刘志钢、陈晓婷、何小满、雷新云、汤建荣、王一梅、王斌、黄晓波、彭燕琼、唐朴勤、邱菊红、高峡、朱明秋、王志、张继锋。 DB42/T 14122018 1 医疗机构物体表面清洗效果现场快速检测-ATP 生物荧光法 1 范围 本标准规定了医疗机构物体表面清洗效果现场快速检测ATP生物荧光法的方法原理、 设备与试剂、工作环境、校准曲线绘制、操作步骤、样品ATP含量和洗手后RLU值下降率的计算
4、及清洗效果预警值。 本标准适用于使用一体式ATP物体表面测试管进行的医疗机构医疗器械机械清洗消毒（湿热）及医务人员洗手效果现场快速检测及其结果预警判断。 注1：环境物体表面清洗效果现场快速检测及其结果预警判断不适用于本标准。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 5750.3-2006 生活饮用水标准检验方法 水质分析质量控制 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 15982 医院消毒卫生标准 GB/T 36004 食品接触
5、表面清洗消毒效果试验方法 三磷酸腺苷生物发光法 WS 310.2 医院消毒供应中心第2部分：清洗消毒及灭菌技术操作规范 WS/T 313 医务人员手卫生规范 TB/T 3121-2005 铁路食（饮）具洁净度ATP生物发光检测法和分级判定 3 术语和定义 TB/T 3121-2005和GB/T 5750.3-2006界定的以及下列术语和定义适用于本标准。为了便于使用以下重复列出了TB/T 3121-2005和GB/T 5750.3-2006中的某些术语和定义。 3.1 ATP adenosine triphosphate 腺嘌呤核苷三磷酸（简称三磷酸腺苷）是一种不稳定的高能化合物，由腺嘌呤、核
6、糖和3个磷酸基团连接而成，水解时释放出能量较多，为生物体内最直接的能量来源。 3.2 相对光单位（RLU） relative light unit 样品经ATP生物荧光检测仪检测后，所显示在仪器上的读数。 注2：本标准中，在 RLU 检测模式下的读数，即为相对光单位，ATP 含量越高，RLU 值越高。不同的 ATP 生物荧光检测仪对同一样品进行检测时所得的 RLU 值可能各不相同。 TB/T 3121-2005，定义2.2 3.3 ATP 含量 ATP content DB42/T 14122018 2 样品中所包含的微生物细胞内ATP、体细胞内ATP及细胞外ATP经裂解剂等试剂处理后释放出来
7、能与荧光素发生生物化学反应的ATP总量，单位为mol。 3.4 ATP 标准溶液 ATP standard solution 具有足够均匀和稳定的特定特性，并附有由权威机构发布文件，且有溯源性的含有ATP的溶液。 3.5 校准曲线 calibration curve 描述待测物质浓度或量与检测仪器响应值或指示量之间的定量关系曲线，分为“工作曲线” （标准溶液处理程序及分析步骤与样品完全相同）和“标准曲线”（标准溶液处理程序较样品有所省略，如样品预处理）。本标准中使用“标准曲线”作为校准曲线。 GB/T 5750.3-2006，定义5.1 3.6 预警值 early warning value
8、用于早期发现风险的判断值， 当评价指标大于或小于该值时， 存在有医疗器械机械清洗消毒 （热力）不合格或医务人员卫生手洗手不合格的风险，提示应查找原因并采取相应措施（如重新清洗等），以达到早期预防感染的目的。 4 方法原理 ATP存在于所有动植物、微生物细胞内，ATP生物荧光法是利用一种生物化学反应，即荧光素和O2在Mg2+和荧光素酶的催化下与ATP进行反应，将化学能转化为光能，产生560nm的荧光，而在其他反应物过量的情况下， 发光强度与ATP含量成正比关系。 因此， 使用ATP生物荧检测仪对发光强度进行测量，即可测定出ATP的含量。 5 设备与试剂 5.1 ATP 生物荧光检测仪 应选用灵敏
9、度不低于1.0 10-15 mol的仪器，每年对仪器进行检定，检定指标可参照附录A选择。 5.2 ATP 标准溶液 ATP含量不低于1.0 10-12mol，在28环境下冷藏，并在有效期内使用。 5.3 一体式 ATP 物体表面测试管 包括采样拭子和荧光素酶等反应液；同一产品拭子的大小一致，保持一定湿润度，浸有符合厂家要求的采样液；测试管内含荧光素酶等反应液的质量应符合厂家要求。应置于铝膜袋中避光密封保存，在28环境下冷藏，并在有效期内使用。 6 工作环境 检测工作应在室温（2025）下进行。 7 校准曲线绘制 DB42/T 14122018 3 新检测仪器投入使用前、试剂更换批号后及修理、检
10、定后应进行校准曲线绘制，参照GB/T 5750.3绘制校准曲线，用至少符合GB/T 6682中三级水标准的纯水将ATP标准溶液作系列梯度稀释，ATP含量包括1.0 10-12 mol 1.0 10-15 mol，最低含量应为仪器最低限出检值，每次取各稀释溶液10 l滴在采样拭子上，检测方法按附录A执行，读取RLU值，各稀释度溶液重复测定3次，取平均值，分别以ATP含量对数值和RLU值对数值为x、y轴拟合校准曲线yabx。 8 操作步骤 8.1 样品准备 样品符合附录B要求。 8.2 试剂准备 检测前将一体式ATP物体表面测试管从冷藏环境中取出，待恢复至室温后使用。 8.3 仪器准备 开机预热，
11、关闭检测仓，仪器完成自检程序后，正常进入工作状态。 8.4 采样方法 参照GB 15982进行采样，具体方法按附录B执行。 8.5 检测方法 参照GB/T 36004进行检测，具体方法按附录B执行。 9 样品 ATP 含量和洗手后 RLU 值下降率的计算 9.1 样品 ATP 含量 依据7中拟合的校准曲线yabx，按式（1）和（2）换算样品的ATP含量： yaxb （1） ATP含量（mol）10 x （2） 式中： y检测的RLU值对数值； a校准曲线的常数项； b校准曲线的斜率； xATP含量对数值。 9.2 洗手后 RLU 值下降率 医务人员洗手后RLU值下降率=（洗手前RLU值-洗手后
12、RLU值）/洗手前RLU值 100% （3） DB42/T 14122018 4 10 清洗效果预警值 10.1 按照式（1）和（2）换算样品的 ATP 含量，医疗机构医疗器械当采用机械清洗消毒（热力）时，ATP 含量预警值为2 10-15 mol。 10.2 医务人员洗手后，按照式（3）计算 RLU 值下降率（%），预警值为90%。 DB42/T 14122018 5 A A 附 录 A （资料性附录） ATP 生物荧光法参数 A.1 稳定性 在检测仪器良好工作情况下，在5h内，每隔20min取1.0 10-15 mol的ATP标准溶液对仪器进行10次测量，按式（4）计算稳定性R，10%R
13、。 12100%RRRx （4） 式中：R稳定性，%； R1 10次测量的极大值，RLU； R2 10次测量的极小值，RLU； x 10次测量的平均值，RLU。 A.2 线性相关系数 在检测仪器良好工作情况下，按7拟合校准曲线：yabx，其中x为RLU值的对数值， y为ATP含量的对数值（mol），按式（5）计算线性相关系数r。 12211()()()()niiinniiiixxyyrxxyy （5） 式中： r 线性相关系数； ix第i个浓度测量值的平均值对数值，RLU； xn个浓度测量平均值的平均值对数值，RLU； iy第i个浓度的ATP含量对数值，mol； yn个ATP含量的平均值对数值
14、，mol； N 浓度数量。 A.3 最低检出限 DB42/T 14122018 6 在检测仪器良好工作情况下，不对一体式ATP物体表面测试管内拭子做任何处理，直接与管内反应液混匀后进行20次空白测量，并按7拟合的校准曲线进行ATP含量换算，再按式（6）计算得标准偏差S，按式（7）计算检出限LC（mol）。 2()1ixxSn （6） 3LCS （7） 式中：S标准偏差，mol； LC检出限，mol； ix第i次测量值，mol； x20次测量的平均值，mol n测量次数。 A.4 零点漂移 在检测仪器良好工作情况下，使用ATP阴性标准管进行零点校准，读取初值，等待30min后继续读数为变化值，变
15、化值和初值之差即为仪器零点漂移，30min内的零点漂移10RLU。 A.5 重复性 在检测仪器良好工作情况下，使用移液器取含量为1.0 10-15 mol的ATP标准溶液，检测20次，依据贝塞尔公式计算仪器重复性，RSD8%。 1100%1niixxRSDxn （8） 式中：RSD相对标准偏差，%； ix第i次测量值，RLU； x20次测量的平均值，RLU； n测量次数。 A.6 校准曲线的不确定度 分析方法或仪器通常是通过观察被分析物x的不同浓度的响应值y来校准的。 在大多数情况下， 这种关系被认为是线性的， 通常通过最小二乘法回归来确定7中校准曲线的a和b， 在做阳性对照时， 选取ATP含
16、量2.0 10-15 mol为x，仪器检测RLU显示值为y1，按式（1）和（2）换算ATP含量为x1，按式（9）计算该点（x1,y1）的线性最小二乘法校准的不确定度。大多数情况下，扩展不确定度为2U，因此以（x 2U）作为评价阳性对照x1是否合格的标准。 DB42/T 14122018 7 2121()11()niixxSUbpnxx （9） 21()2niiiyabxSn （10） 式中：U不确定度，mol； b斜率； p测试jx的次数； ix第i次测量值对数值，RLU； x不同校准标准溶液的平均值对数值（n次），RLU； n测量次数。 DB42/T 14122018 8 B B 附 录 B
17、 （规范性附录） ATP 生物荧光法物体表面采样检测方法 B.1 采样原则 B.1.1 送检时间 采样后进行现场检测。 B.1.2 采样对象 分别对医疗器械机械清洗消毒（湿热）后和医务人员洗手前后按下列要求进行采样。 a) 医疗器械按WS 310.2完成机械清洗消毒（热力）程序后干燥恢复到室温，在检查打包之前进行采样。 b) 医务人员手在手卫生指征前保持手干燥进行采样；按WS/T 313 附录A要求使用流动水进行洗手，不使用手消毒剂，干燥后再次进行采样。 B.2 采样方法 B.2.1 医疗器械 B.2.1.1 被采医疗器械表面100 cm2，取全部表面；被采医疗器械表面100 cm2，取100
18、 cm2。 B.2.1.2 非管腔类医疗器械采手持部位以下的内、外侧表面，重点涂擦咬合处；管腔类医疗器械采器械内、外侧前端5 cm。 B.2.1.3 取出一体式ATP物体表面测试管内的采样拭子，在采样部位从上至下分别往返涂擦各2次，在涂擦过程中注意拭子与医疗器械紧贴，并随之转动拭子，用力均匀。 B.2.2 医务人员手 取出一体式ATP物体表面测试管内的采样拭子，在双手手指曲面从指跟到指端来回涂擦各2次（一只手涂擦面积约30 cm2），拭子紧贴手指，并随之转动拭子，用力均匀。 B.2.3 个人防护用品 采样时佩戴无粉、无菌手套及一次性口罩、帽子。 B.3 检测方法 采样后将拭子与测试管中的反应液
19、充分混合，中等力度均匀敲打80次，避免产生过多泡沫，20s内放入检测仓内进行检测，待显示屏数据稳定后，读取数值，单位为RLU。 每批次的一体式ATP物体表面测试管应设一个空白对照。空白对照对采样拭子不做任何处理，直接与测试管内反应液充分混合，中等力度均匀敲打80次，避免产生过多泡沫，20s内放入检测仓内进行检测，待显示屏数据稳定后，读取数值，单位为RLU。 DB42/T 14122018 9 每批次的一体式ATP物体表面测试管应同时设一个阳性对照。阳性对照用2.0 10-15 mol的ATP标准溶液进行检测，取ATP标准溶液10 l滴在采样拭子上，与测试管内反应液充分混合，中等力度均匀敲打80次， 避免产生过多泡沫， 20s内放入检测仓内进行检测， 待显示屏数据稳定后， 读取数值， 单位为RLU。 B.4 结果换算 根据7绘制的校准曲线，按式（1）和（2）将检测所得的RLU值换算为样品的ATP含量，单位为mol。 空白对照结果高于检出限时应更换不同批次一体式ATP物体表面测试管重新做空白对照； 如仍不合格则需对仪器设备进行重新校准。 阳性对照结果偏离标准曲线（x1超出A.6标准）时应更换不同批次一体式ATP物体表面测试管重新做阳性对照；如仍不合格则需对仪器设备进行重新校准或重新绘制标准曲线。 _
