1、ICS 65.020.30 B 44 DB15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 19002020 过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型构建技术规程 Technical regulations for establishment of hydrogen peroxide-induced oxidative damage model of bovine mammary epithelial cells 2020-06-10 发布 2020-07-10 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 19002020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
2、本标准由内蒙古自治区农牧业科学院提出。 本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。 本标准主要起草人员：马燕芬、赵磊、吴志红、宋利文、凤英、张春华、乃门塔娜、羿静、宝华、杜瑞平、高民、米丽。 DB15/T 19002020 1 过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型构建技术规程 1 范围 本标准规定了过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的构建方法。 本标准适用于采用过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞产生氧化损伤模型的构建。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 原代细胞培养 primary cell cul
3、ture 将乳腺上皮细胞在模拟体内生存环境中进行培养，使细胞生长增殖达到可传代状态的培养方法。 3 工作区条件 工作区由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室组成。 4 主要仪器、设备及耗材 4.1 主要仪器、设备 超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、4 离心机、4 冰箱、-20 冰箱、0.22 m过滤器、80目滤网。 4.2 主要耗材 25 cm2细胞培养瓶、90 mm细胞培养皿、15 mL离心管、300 mL烧杯、250 mL蓝口瓶、1.5 mL Eppendof管、2 mL冻存管、6孔板、24孔板、96孔板、10 L-5 mL移液枪及枪头、瓷盘、镊子、剪刀、贮液瓶。 5 主要试剂及配制 5
4、.1 主要试剂 DMEM/F12培养基、10 %胎牛血清、双抗、5 %胰岛素转铁蛋白硒钠、氢化可的松、两性霉素B、表皮生长因子、催乳素、L-谷氨酰胺、PBS缓冲液（pH7.4）、0.5 % 型胶原酶、10 %二甲基亚砜（DMSO）、30 %过氧化氢、甲醇、高压灭菌超纯水、0.4 %台盼蓝、75 %酒精、新洁尔灭、0.25 %胰酶、丙酮、10 %山羊血清、兔抗细胞角蛋白（cytokeratin）18单克隆抗体、山羊抗兔免疫球蛋白G、Alexa Fluor488、DAPI染液、四氮唑蓝盐化合物（MTS）、细胞裂解液、活性氧（ROS）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、DB15/T 19002020 2
5、 超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒、谷胱甘肽巯基转移酶（GST）试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒。 5.2 培养基配制 5.2.1 完全培养基（生长培养基，按配 100 mL 计算） 将10 %胎牛血清10 mL、双抗1 mL、5 %胰岛素转铁蛋白硒钠0.5 mL、100 g/mL氢化可的松100 L、100 g/mL两性霉素B 100 L、10 ng/mL表皮生长因子10 L、50 g/mL催乳素50 L、200 mmol/L L-谷氨酰胺1.5 mL加入86.74 mL的DMEM/F12培养基中，0.22 m滤器过滤，密
6、封分装，4 保存。 5.2.2 无血清培养基（饥饿培养基，按配 100 mL 计算） 将双抗1 mL、5 %胰岛素转铁蛋白硒钠0.5 mL、100 g/mL氢化可的松100 L、100 g/mL两性霉素B 100 L、10 ng/mL表皮生长因子10 L、50 g/mL催乳素50 L、200 mmol/L L-谷氨酰胺1.5 mL加入96.74 mL的DMEM/F12培养基中，0.22 m滤器过滤，密封分装，4 保存。 5.2.3 终止培养基（按配 100 mL 计算） 将10 %胎牛血清10 mL加入90 mL DMEM/F12培养基中，0.22 m滤器过滤，密封分装，4 保存。 5.3 试
7、剂配制 5.3.1 氢化可的松（100 g/mL） 将100 g氢化可的松溶于1 mL无水乙醇中，0.22 m滤器过滤，密封分装，-20 保存。 5.3.2 两性霉素 B（100 g/mL） 将1 mg两性霉素溶于10 mL无菌超纯水中，0.22 m滤器过滤，密封分装，-20 保存。 5.3.3 表皮生长因子（10 ng/mL） 将0.2 mg表皮生长因子溶于20 mL DMEM/F12培养基中，充分混匀，配制成10 g/mL的表皮生长因子浓贮，取100 L 10 g/mL浓贮溶于100 mL DMEM/F12培养基中，即为10 ng/mL表皮生长因子工作液，0.22 m滤器过滤，密封分装，-
8、20 保存。 5.3.4 催乳素（50 g/mL） 将250 IU的催乳素（按25 IU/mg转换）溶于1 mL DMEM/F12培养基中，配制成浓度为10 mg/mL的浓贮，取100 L 10 mg/mL浓贮溶于20 mL DMEM/F12培养基中，即为50 g/mL催乳素工作液，0.22 m滤器过滤，密封分装，-20 保存。 5.3.5 L-谷氨酰胺（200 mmol/L） 称取2.923 g谷氨酰胺溶于100 mL DMEM/F12培养基中，即为200 mmol/L的谷氨酰胺，0.22 m滤器过滤，密封分装，-20 保存。 5.3.6 含 1 %双抗的 PBS 将5 mL双抗加入500
9、mL PBS中，0.22 m滤器过滤，密封分装，4 保存。 DB15/T 19002020 3 5.3.7 含 3 %双抗的 PBS 将15 mL双抗加入500 mL PBS中，0.22 m滤器过滤，密封分装，4 保存。 5.3.8 型胶原酶（0.5 %） 称取100 mg 0.5 %型胶原酶粉末溶于20 mL PBS中，0.22 m滤器过滤，密封分装，-20 保存。 5.3.9 细胞冻存液（100 mL） 将20 mL 10 %胎牛血清和10 mL 10 %二甲基亚砜加入到70 mL完全培养基中，0.22 m滤器过滤，密封分装，4 保存。 5.3.10 过氧化氢甲醇（3 %） 将30 %过氧
10、化氢和甲醇按1：9的比例稀释，0.22 m滤器过滤，密封分装，-20 避光保存，现用现配。 5.3.11 过氧化氢原液配制（1 mol/L） 在1 mL H2O2中加入8 mL高压灭菌超纯水稀释到9 mL，配制成浓度为1 mol/L（1000mmol/L）的H2O2原液，0.22 m滤器过滤，密封分装，4 保存。 注：30 % H2O2浓度约为9 mol/L。 5.3.12 过氧化氢工作液配制（600 mol/L） 在0.006 mL 1000 mmol/L 的H2O2原液中加入9.994 mL高压灭菌超纯水稀释到10 mL， 即为600 mol/L H2O2工作液，0.22 m滤器过滤，-2
11、0 保存，每次换液时现配。 5.3.13 过氧化氢诱导培养基配制（600 mol/L，按 20 mL 计） 将12 L的1000 mmol/L的H2O2原液加入到19.98 mL的无血清培养基中，即为600 mol/L H2O2诱导培养基，0.22 m滤器过滤，密封分装，-20 保存，每次换液时现配。 5.3.14 一抗 将兔抗细胞角蛋白（cytokeratin）18单克隆抗体与PBS按1：200比例稀释而成，0.22 m滤器过滤，密封分装，-20 保存。 5.3.15 二抗 采用Alexa Fluor488标记的山羊抗兔免疫球蛋白G，-20 保存。 6 奶牛乳腺上皮细胞体外培养 6.1 奶牛
12、乳腺样品采集 商业屠宰场采集健康奶牛乳腺组织，选取切开后乳腺深层组织内无出血点，切面呈肉白色，能见白色乳汁的健康奶牛乳腺组织约200 g，立即装入干净样品袋中带回实验室。 DB15/T 19002020 4 6.2 奶牛乳腺样品处理 6.2.1 在操作台前点燃酒精灯，取 250 mL 贮液瓶，装入约 200 mL 含 3 %双抗的 PBS 溶液。 6.2.2 将采集的乳腺样品放入已灭过菌的瓷盘里，用镊子和剪刀剪掉组织外层，于深层处选取 1 cm3大小的组织块若干块（注意避开导管和结缔组织）。 6.2.3 放入贮液瓶中浸泡 10 min。 6.3 奶牛乳腺上皮细胞原代培养 6.3.1 准备好需要
13、拿到培养间的物品：含 1 %双抗的 PBS，含 3 %双抗的 PBS，75 %酒精，DMEM/F12 培养基，0.5 %型胶原酶，15 mL 离心管，90 mm 细胞培养皿，25 cm2细胞培养瓶。 6.3.2 关闭超净台紫外照射灯，打开超净台并点燃酒精灯。 6.3.3 将浸泡后的乳腺组织移至超净台内，依次用含 3 %双抗的 PBS 清洗三遍，75 %酒精浸泡 30 s，含 1 %双抗的 PBS 清洗三遍，然后将乳腺组织放入一无菌 90 mm 细胞培养皿中，用眼科镊子和剪刀剪去组织块表层，剪取深层腺泡约 1 mm3的乳腺组织放入另一无菌 90 mm 细胞培养皿中，用眼科剪刀将乳腺组织块剪成糊状
14、。 6.3.4 将呈糊状的乳腺组织块吸移至 15 mL 离心管中，用适量含 1 %双抗的 PBS 清洗 90 mm 细胞培养皿 3 次，液体转入 15 mL 离心管中，1300 r/min 离心 5 min。 6.3.5 弃掉上清液，向离心管中加入等体积的 0.5 %型胶原酶。 6.3.6 盖好离心管盖子，放入 37 水浴锅消化 1 h，消化过程中每隔 20 min 轻轻摇晃离心管。 6.3.7 消化完毕后，将消化后的组织块用 80 目滤网过滤（滤网应先用含 1 %双抗的 PBS 润湿）到灭菌烧杯里，用含 1 %双抗的 PBS 将离心管润洗 3 遍后，经滤网过滤到烧杯里。 6.3.8 用 5
15、mL 枪头吸取滤液于 15 mL 离心管（根据滤液的多少来决定个数）内，用含 1 %双抗的 PBS清洗烧杯后，将液体也转移到离心管中，1300 r/min 离心 5 min。 6.3.9 弃掉上清液，分别向 15 mL 离心管中加入含 1 %双抗的 PBS 3 mL 清洗，轻轻吹打后，1300 r/min离心 3 min。 6.3.10 再次弃掉上清液，向其加入 5 mL 完全培养基，轻轻充分混匀后，将 5 mL 细胞培养液全部吸出，轻轻放置于 25 cm2细胞培养瓶中，于 37 ，5 % CO2培养箱中培养。 6.3.11 收拾超净台，喷洒新洁尔灭。 6.4 奶牛乳腺上皮细胞传代及纯化 6.
16、4.1 待细胞生长至 70 %80 %汇合度，从 CO2培养箱中取出培养瓶，在超净台内吸去旧培养基。 6.4.2 加入 PBS 清洗 2 次，弃掉上清液。 6.4.3 加入 0.25 %胰酶 1 mL（注意让枪头从培养瓶侧面加入，不要对着细胞加），计时 30 s，弃掉上清液，加入 PBS 清洗 2 次，弃掉上清液。 6.4.4 加入 0.25 %胰酶 1 mL，于 37 ，5 % CO2培养箱中消化培养 9 min。 6.4.5 取出培养瓶，于倒置显微镜下观察细胞脱壁情况。 6.4.6 乳腺上皮细胞消化完全后， 迅速向瓶内加入 3 mL 终止培养基终止消化， 防止深度消化损伤细胞，用 1 mL
17、 枪头将细胞培养瓶底壁的细胞吹打下来。 6.4.7 吸取细胞悬液于 15 mL 离心管中，室温 1000 r/min 离心 5 min。 6.4.8 弃掉上清液，向 15 mL 离心管中加入 3 mL PBS 清洗，轻轻吹打后，室温 1000 r/min 离心 5 min。 6.4.9 再次弃掉上清液， 向其加入 5 mL 完全培养基， 将细胞沉淀充分吹散开后， 细胞计数， 以 2.0105个/mL 的密度接种于 25 cm2细胞培养瓶中。 6.4.10 全部吸出轻轻加入到 25 cm2细胞培养瓶中，于 37 ，5 % CO2培养箱中培养。 DB15/T 19002020 5 6.5 奶牛乳腺
18、上皮细胞生长曲线绘制 6.5.1 制备细胞悬液 将生长良好的第三代细胞消化下来，计数后分别制成0.5104个/mL、1.0104个/mL、2.0104个/mL细胞悬液25 mL，备用。 6.5.2 接板 吸取0.5104个/mL、1.0104个/mL、2.0104个/mL细胞悬液于不同24孔板内，每个浓度24个孔，每孔1 mL，于37 ，5 % CO2培养箱中培养24 h。 6.5.3 计数 培养24 h后，用0.25 %胰酶消化24孔板中0.5104个/mL、1104个/mL、2104个/mL的3孔细胞，分别制成1 mL细胞悬液并计数。以后每隔24 h计数一次，连续8 d，未计数细胞组每2
19、d换液一次。 6.5.4 绘图 以培养天数为横坐标，乳腺上皮细胞浓度为纵坐标，绘制折线图。 6.6 奶牛乳腺上皮细胞活力测定 6.6.1 染色：将细胞制成细胞悬液，用 10 L 移液枪分别吸取 10 L 细胞悬液和 10 L 0.4 %台盼蓝，并将其混匀。 6.6.2 计数：混匀后静置 30 s，吸取 20 L 混合液于细胞计数板上，使混合液充满盖片和计数板之间，在倒置显微镜下 100 计数，无色且透明发亮的小圆圈为健康活细胞，蓝色细胞为死细胞。 6.6.3 存活率： 计数 1000 个细胞中被台盼蓝染成蓝色的细胞个数， 细胞存活率等于存活细胞个数与细胞总数量的比率。 6.7 奶牛乳腺上皮细胞
20、免疫荧光染色测定 6.7.1 纯化的奶牛乳腺上皮细胞以 2 104个/mL 接种到 24 孔板中，待长至半汇合单层状态时进行下一步实验。 6.7.2 用预冷的 PBS 缓冲液洗涤细胞 3 次，2 min/次，用冰浴的丙酮：甲醇（1：1）固定细胞 20 min。 6.7.3 用 PBS 缓冲液冲洗细胞 3 次，5 min/次，滴加 1 mL 3 %过氧化氢甲醇溶液室温静置 10 min，以阻断内源性过氧化氢酶。 6.7.4 再用 PBS 缓冲液冲洗细胞 3 次，5 min/次，滴加 1 mL 10 %山羊血清室温静置或封闭 1.5 h。 6.7.5 去掉血清，滴加 1 mL 一抗，于 37 ，5
21、 % CO2培养箱中培养 2 h。 6.7.6 用 PBS 缓冲液清洗 3 次，5 min/次，在避光条件下，滴加 1 mL 二抗，于 37 ，5 % CO2培养箱中室温避光培养 1 h。 6.7.7 用 PBS 缓冲液清洗 3 次，5 min/次，在避光条件下 DAPI 复染细胞核 5 min。 6.7.8 再用 PBS 缓冲液冲洗 3 次，5 min/次，荧光倒置显微镜下，观察拍照。 7 过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的构建 DB15/T 19002020 6 7.1 奶牛乳腺上皮细胞培养 将传第三代奶牛乳腺上皮细胞使用完全培养基悬浮，并以2105个/mL或2104个/mL密度分
22、别接种于25 cm2细胞培养瓶或6孔板中，置于37 ，5 % CO2培养箱中培养至细胞贴壁达80 %90 %时，于无血清培养基中饥饿培养12 h16 h。 7.2 过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型构建 饥饿培养12 h16 h后，PBS清洗2次，分别加入5 mL/瓶或2.5 mL/孔的600 mol/L浓度的H2O2诱导培养基，置于37 ，5 % CO2培养箱中培养6 h后，收集细胞培养液。 8 过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的判定 8.1 氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞数量和形态 在倒置显微镜下观察，当奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤数量达20 %40 %，氧化损伤乳腺上皮细胞形态呈现不
23、规则椭圆形态。 8.2 氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞增殖率测定及判定 8.2.1 制备细胞悬液 将乳腺上皮细胞制成细胞悬液，浓度为2104个/mL。 8.2.2 接板 向离心管中加入完全培养基，充分混匀，接到96孔板中，每组5个复孔，每孔200 L，于37 ，5 % CO2培养箱中继续培养12 h。 8.2.3 饥饿处理 培养12 h后，每孔内的完全培养基换成200 L的饥饿培养基，于37 ，5 % CO2培养箱培养16 h。 8.2.4 换液 培养16 h后，每孔内的饥饿培养基换成100 L的H2O2诱导培养基，于37 ，5 % CO2培养箱中培养6 h。 8.2.5 加 MTS 培养6 h后，
24、在每孔内加20 L MTS，在37 ，5 % CO2培养箱中培养1 h4 h。 8.2.6 测吸光度值 将96孔板放入酶标仪中中速摇动10 min，490 nm读取吸光度（OD）值，OD值范围为0.200.25。 8.2.7 氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞增殖率判定 奶牛乳腺上皮细胞增殖率小于80 %。 8.3 氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞氧化-抗氧化指标测定及判定 DB15/T 19002020 7 8.3.1 氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞氧化-抗氧化指标测定 600 mol/L的H2O2作用于乳腺上皮细胞6 h后，弃上清，抽取1 mL PBS清洗每孔内贴壁生长的乳腺上皮细胞2次，弃去上清液，每孔加入200 L的细胞裂解液，冰浴30 min，将贴壁细胞用细胞刮刀全部刮下，分别将细胞悬液收集于1.5 mL Eppendof管中，于4 ，12000 r/min离心10 min，收集上清液测定氧化和抗氧化指标。 8.3.2 氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞氧化-抗氧化指标判定 氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞氧化-抗氧化指标判定参见表1。 表1 氧化损伤奶牛乳腺上皮细胞氧化-抗氧化指标判定范围 氧化指标 判定范围 ROS 3500 pg/mL MDA 75 mmol/L 抗氧化指标 判定范围 SOD 150 U/mL GSH-Px 600 U/L CAT 1000 mIU/L LDH 23 IU/L _
