1、ICS 65.020.30 B41 备案号：60861-2018 DB63 青海省地方标准 DB 63/T 16982018 实验用喜马拉雅旱獭 遗传质量控制 2018 - 09 - 25 发布 2018 - 12 - 01 实施 青海省质量技术监督局 发 布 DB63/T 16982018 I 前 言 本规程按照GB/T 1.1-2009给出的规则编写。 本规程由青海省科学技术厅提出并归口。 本规程起草单位：青海喜马拉雅动物实验中心有限公司、青海央宗药业有限公司、青海省野生动植物保护协会。 本规程主要起草人：吴天一、范微、张评浒、徐楠、张玲、周国华、张毓。 DB63/T 16982018 1
2、 实验用喜马拉雅旱獭 遗传质量控制 1 范围 本部分规定了实验用喜马拉雅旱獭的遗传分类、封闭群的繁殖方法、遗传质量监测。 本部分适用于封闭群实验用喜马拉雅旱獭的遗传质量控制和管理。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 14923 实验动物 哺乳类实验动物的遗传质量控制 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实验用喜马拉雅旱獭 Experimental Marmota Himalayana 指经人工饲育适应青藏高原低氧环境， 对
3、其携带的病原微生物和寄生虫实行控制， 遗传背景明确或者来源清楚，用于科学研究、教学、生产和检定等其他科学研究的青藏高原特有种鼠喜马拉雅旱獭。 3.2 封闭群或远交群 Closed colony or outbred stock 以非近亲方式进行繁殖的实验用喜马拉雅旱獭群体， 在不从外部引入新的个体的条件下， 至少繁殖4代以上，封闭群亦称远交群。 4 封闭群实验用喜马拉雅旱獭的繁殖方法 按照GB 14923附录A封闭群动物繁殖方法进行。 5 封闭群实验用喜马拉雅旱獭的遗传质量监测 5.1 遗传质量要求 5.1.1 具有明确的遗传背景资料，来源清楚，有较完整的资料（包括种群名称、来源、遗传基因特点
4、及主要生物学特性等） 。 DB63/T 16982018 2 5.1.2 用于保种及生产的繁殖谱系应清楚完整，繁殖方法科学合理。保持喜马拉雅旱獭的基因异质性和多态性， 避免近交系数随代数增加而过快上升。 遗传谱系鉴定参照喜马拉雅旱獭遗传进化分析方法进行，见附录 A。 5.1.3 经遗传检测（微卫星分子标记）证明基因频率稳定，为相同种群。微卫星分子标记检测方法见附录 B。 5.2 遗传检测方法 5.2.1 喜马拉雅旱獭遗传进化分析方法，见附录 A。 5.2.2 微卫星分子标记检测方法，见附录 B。 5.2.3 抽样 按表1要求。 表1 抽样数量 生产种群旱獭数量 取样数量（只） 100 只以上
5、30 100 只以下 15 5.2.4 微卫星分子标记的选择 选择实验用喜马拉雅旱獭13个具有高度多态的位点作为遗传检测的微卫星分子标记。 5.2.5 群体评价 5.2.5.1 群体内遗传变异采用平均有效杂合度指标或群体平衡状态进行度量。所用分子标记或生化标记能反映群体基因多态性。 5.2.5.2 当平均有效杂合度在 0.5 时0.7 时，群体为合格封闭群实验旱獭群体。或用群体是否达到平衡状态来判断定，如果没有达到平衡状态，说明群体的基因频率或基因型频率发生变化，该封闭群判为不合格。 5.2.5.3 喜马拉雅旱獭 Cytb 序列进行同源比对与遗传进化分析。 5.3 检测频率 封闭群实验喜马拉雅
6、旱獭每年进行一次遗传质量检测。 DB63/T 16982018 3 A A 附 录 A （规范性附录） 喜马拉雅旱獭遗传进化分析方法 A.1 实验材料与仪器 A.1.1 主要试剂 DNA Marker、RNase、高保真Taq酶、琼脂糖、琼脂粉、Tris碱、质粒抽提试剂盒、AMP、IPTG、-gal、Goldview、异丙醇、CaCl2、甘油、QIAGEN动物组织与全血DNA提取试剂盒。 A.1.2 实验室常用溶液的配置方法 TE 缓冲液（pH8.0）：10mM Tris-HCl，1mM EDTA； TAE 母液（50）：242g Tris 碱，57.1ml 冰乙酸，100ml 0.5mol/
7、L EDTA(pH8.0) 定容至 1升； 凝胶加样缓冲液母液（6）：0.25% 溴酚蓝，0.25% 二甲苯青 FF，30% 甘油水溶液 4贮存； Goldview 染液：50ml TAE 缓冲液中加入 Goldview 1L。 A.1.3 仪器 台式高速离心机、核酸蛋白定量仪、超净工作台、电泳槽、稳压稳流电泳仪、PCR仪、IQ5荧光定量PCR仪、系统化学发光凝胶成像仪、恒温水浴、隔水式恒温生化培养箱、旋涡混合器、电子分析天平、恒温摇床、烘箱、手提式压力蒸汽灭菌锅、磁力搅拌器。 A.2 实验方法 A.2.1 喜马拉雅旱獭线粒体Cytb基因检测方法的构建 A.2.1.1 引物设计 参照GenBa
8、nk基因数据库中喜马拉雅旱獭线粒体cyt-b基因的核苷酸序列， 设计如下引物序列，由南京金斯瑞生物技术有限公司合成； WcytbF1: 5-GCTACAGCTTTCATAGGCTATG -3； WcytbR1: 5-CTATGACTAGAGCTGCGATG -3。 A.2.1.2 旱獭DNA的提取 1) 将冻存的旱獭肝组织样品剪成糊状后，加入 200l 缓冲液 GA，振荡悬浮，然后加入 4l RNase (100mg/mL)，振荡 15 秒，室温放置 5min。 2) 加入 20l 的蛋白酶 K 溶液，混匀，56放置过夜。 3) 加入 200l 缓冲液 GB，充分颠倒混匀，70放置 10min
9、,溶液变清后，简短离心去除管盖内壁的水珠。 4) 加入 200l 无水乙醇，充分振荡混匀 15 秒，简短离心去除管盖内壁的水珠。 DB63/T 16982018 4 5) 将上述所得溶液和絮状沉淀加入到吸附柱 CB3 中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm 离心 30 秒，倒掉废液，将吸附柱 CB3 放回收集管中。 6) 向吸附柱 CB3 中，加入 500l 缓冲液 GD，12,000rpm 离心 30 秒，倒掉废液， 将吸附柱 CB3放回收集管中。 7) 向吸附柱中加入 700l 漂洗液 PW，12,000rpm 离心 30 秒，倒掉废液，将吸附柱 CB3 放回收集管中。 8) 向吸附
10、柱中加入 500l 漂洗液 PW，12,000rpm 离心 30 秒，倒掉废液。 9) 将吸附柱 CB3 放回收集管中，12,000rpm 离心 2min，倒掉废液。 10) 将吸附柱 CB3 室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 11) 向吸附柱 CB3 吸附膜中间部位悬空滴加 100l 洗脱液 TE，室温放置 2-5min，12,000rpm离心 2min，将溶液收集到新的离心管中，放置于-20保存。 A.2.1.3 核酸浓度的测定 A.2.1.3.1 测定原理 具有共轭双键的有机分子，对紫外光有强烈吸收，核酸分子中的碱基就是共轭双键，因此也强烈吸收紫外光。核酸的最大吸收波长
11、为260 nm，吸收谷在230 nm。核酸的这一物理特征为测定核酸溶液的浓度提供基础。在波长为260 nm的光程为一个吸收单位(A260=1)相当于双链DNA浓度为50 g/ml，单链RNA为40 g/ml。所以测出溶液的A260值后既可以据此计算它的浓度。 A.2.1.3.2 测定步骤 使用 1cm 光程石英比色杯，以超纯水调好仪器零点。 将 20l 核酸样品稀释到 1mL 去离子水中。 测定并记录 A260与 A280的比值。 A.2.1.4 PCR扩增Cyt-b基因 PCR扩增Cyt-b基因反应体系: 组分 体积 H2O 31.5l 10buffer 5l MgCl2 2.5 mM 4l
12、 dNTP 2.5 mM 4l HcytbF1 2l HcytbR1 2l DNA template 1l Taq-polimerase (5u/l) 0.5l PCR扩增Cyt-b基因反应条件: 循环 温度 时间 1 94 5min 94 30sec 55 30sec 30 72 30sec DB63/T 16982018 5 1 72 10min 4 30min A.3 序列比对与遗传进化分析 利用DNAstar 5.0和MEGA4.0软件对喜马拉雅旱獭Cytb序列进行同源比对与遗传进化分析。 DB63/T 16982018 6 B B 附 录 B （规范性附录） 喜马拉雅旱獭微卫星遗传标
13、记的检测方法 B.1 仪器设备 PCR扩增仪、遗传分析仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅、0.001g级电子天平、pH计、微量核酸测定仪、移液器、匀浆器、电泳仪、电泳槽。 B.2 主要试剂 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1, V:V)、氯仿、异丙醇、70%乙醇、TE(pH8.0)、RNaseA、蛋白酶K、电泳试剂、PCR扩增试剂、SNET裂解缓冲液（配方见分子克隆实验指南 第三版）。 B.3 微卫星位点 选取13个微卫星位点对喜马拉雅旱獭封闭群进行遗传检测。微卫星各位点的名称、引物序列、Gene bank登录号、PCR 反应退火温度见表B.1。 表B.1 微卫星各位点的名称、引物序列、
14、Genbank 登录号、最佳退火温度 位点 引物序列（5-3） Genbank 登录号 退火温度（） SSR1 GAAATAGGCTGGTCCGTG CATACTTGATAGATGGTGGTG EF676085 60 SSR2 GTCTGTTCAGGAGCCATC CTCATCCAGCCTTAGTGTAG EF676086 60 SSR3 GATGGGTCAAATAATGGTAC ATGTGAAGGGTTGGGGTT EF676088 62 SSR4 GGGAAAACCAAAATCTGAAC ACAGCAAATCTCCCACCA EF676087 56 SSR5 ACATTGCTACCACTG
15、CTGCTCC GACCCAGACTGAATTACATCAT EF676090 52 SSR6 CTTCTTTCCTTCCCCATA AACTCAAGTGAGACCCTGT EF676084 52 SSR7 GCCTGTTTGAAGACTGAT TGACCTAAAGAAATGCTAT EF555519 50 SSR8 TCAGAAATGCAACCCAGAC GCCCCAACAGAAGGAACT EF676089 56 SSR9 AGGGGAACAGAACCAAAAGG GTTTCTTCCAGGGACAAAGCACCATC AY197780 56 SSR10 ATCCGTCCAATAAAGAAA
16、TTC GTTTCTTGTGGCTCAGTGGTCAGATG AY197781 56 SSR11 CATTTAGACGCACATTTTG GGGATGGAGAATGAGGAAG AY197782 56 SSR12 AATATGTTAAGGCAGTTCTAGC GTTTCTTCCTGATATGGAAAGATGATGT AY197783 52 SSR13 CCTGTGTGAGTCCAGCCATTTAGGTCTGC AY197784 54 DB63/T 16982018 7 B.4 实验方法 B.4.1 DNA提取 B.4.1.1 取旱獭尾部组织，将其切成小块转入EP管，加入适量SNET裂解缓冲液后
17、用组织匀浆器研磨。 B.4.1.2 加入等体积酚:氯仿:异戊醇，反复颠倒混匀，室温振荡30 min。 B.4.1.3 10000 r/min离心10 min后，吸取上清液至新EP管，加入等体积氯仿，反复颠倒混匀。 B.4.1.4 继续10000 r/min离心10 min后，吸取上清液至新EP管，加入等体积异丙醇，混匀后4 10000 r/min离心沉淀DNA。 B.4.1.5 弃去异丙醇上清，加入1 ml 70%的乙醇，反复颠倒洗涤沉淀。 B.4.1.6 再10000 r/min离心10 min，弃去70%的乙醇，室温空气干燥沉淀约15 min。 B.4.1.7 加入50 L TE，4静置过
18、夜溶解DNA。 B.4.1.8 取2 L 上述DNA溶液，用微量核酸测定仪对其质量进行检测。 B.4.2 PCR反应和电泳检测 B.4.2.1 PCR反应体系总体积为25 L。其中，10Buffer 2.5 L、10 mM dNTPs 0.5 L、10 mM上/下游引物各0.5 L、50 ng/L模板DNA 2.0 L、Taq DNA聚合酶1 U，用ddH2O将反应体系补充至25.0 L。 B.4.2.2 PCR反应条件为：94预变性5 min；94变性60 s，55退火60 s，72延伸90 s，共35个循环；72延伸10 min。 B.4.2.3 取PCR扩增产物5 L，通过加溴化乙锭的1
19、%琼脂糖凝胶进行电泳检测。 B.4.3 STR扫描 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，剩余PCR产物分别以Rox、6-Fam、Hex、Tamra四个标记物标记。取2.0 l标记样品上机STR检测。 B.5 数据处理 通过软件给出波峰获得扩增产物的分子量大小。 利用软件计算各微卫星位点的基因频率、 观察等位基因数、有效等位基因数、基因平均杂合度及Shannon指数。 B.6 结果判定 B.6.1 平均杂合度在 0.50.7， 且期望杂合度与观测杂合度经卡方检验无明显差异时， 为合格的封闭群喜马拉雅旱獭群体。 B.6.2 首先得到各个位点上各基因频率、基因型频率的实际值，然后计算出基因频率和基因型频率的预期值。用实际值和预期值比较，通过卡方检验，可知被监测群体是否达到平衡状态。如果没有达到平衡状态，说明群体的基因频率或基因型频率发生变化，该封闭群喜马拉雅旱獭群体判为不合格。 B.7 结果报告 根据判定结果对被检测的封闭群喜马拉雅旱獭群体做出检测报告。 _
