1、基因工程操作环境操作对象操作水平基本过程结果生物体外基因分子水平剪切拼接导入表达人类需要的基因产物一、基因工程 DNA重组技术实质：基因重组二、基因操作的工具vv 1 1、基因的剪刀、基因的剪刀限制酶限制酶vv 2 2、基因的针线、基因的针线DNADNA连接酶连接酶vv 3 3、基因的运输工具、基因的运输工具运载体运载体2、基因的的针线DNA连接酶连接的部位： 磷酸二酯键（在“梯子”的扶手处）， 不是氢键（在“梯子”的踏板处）。结果：两个相同的黏性末端的连接。思考（）用DNA连接酶连接两个相同的黏性末端要连接几个磷酸二酯键？（）用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？个个、基因的运输工具运
2、载体作用：具备的条件种类：将外源基因送入受体细胞。能在宿主细胞内复制并稳定地保存具有多个限制酶切点具有某些标记基因质粒、噬菌体的衍生物和动植物病毒。使用运载体的目的：用它作为运载工具，将目的基因送到宿主细胞中去。 质粒上会存在某些标记基因，标记基因有什么用途？（鉴别受体细胞是否含有目的基因并筛选含目的基因的受体细胞） 思考三、基因操作的基本步骤vv1 1、目的基因的获取、目的基因的获取vv2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建vv3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞vv4 4、目的基因的检测和鉴定、目的基因的检测和鉴定1、目的基因的获取(一)、目的基因主要是_编码蛋白
3、质的结构基因（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成（1）、从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库.基因文库 基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）基因文库: 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术 条件：_、_、_ 、 _ . 原理：_多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA双链复制模板DNA 四种脱氧核苷酸DNA引物热稳定DNA聚合酶利用PCR扩增目的基因过程：a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作
4、用下，_断裂，形成_b、退火（复性55-60）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。 D、循环氢键单链DNA双链DNA链人工合成：根据已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成2 基因表达载体的构建：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合位点位于基因的末端,终止转录鉴别受体细胞是否含有目的基因并筛选含目的基因的受体细胞 常用的受体细胞：常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌有
5、大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径的途径。3、将目的基因导入受体细胞（1）将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法（2）将目的基因导入动物细胞显微注射技术：将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中（3）导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子方法：四、目的基因的检测与鉴定检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞DNADNADNA分子杂交表
6、达检测转录检测分子杂交翻译检测抗原抗体杂交分子检测法鉴定抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等个体水平的鉴定小 结基因工程的基本内容基因工程的基本内容 基因操作基因操作的基本步骤的基本步骤 基因操作基因操作的工具的工具限制性内切酶限制性内切酶DNADNA连接酶连接酶运载体运载体目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的提取目的基因的提取vv基因工程药品的生产基因工程药品的生产vv基因诊断基因诊断返返 回回vv基因治疗基因治疗（一）基因工程与医药卫生（一）基因工程与医药卫生蛋白质工程 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构
7、规律及其与生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。 蛋白质工程流程图1.从预期的蛋白质功能出发2.设计预期的蛋白质结构3.推测应用的氨基酸序列4.找到相应的脱氧核苷酸序列比较：基因工程和蛋白质工程基因工程蛋白质工程相同点都要改造基因，都属于分子水平产生新的基因型，无新基因基因（型）产生的蛋白质原有的新的联系蛋白质工程以基因工程为基础，是基因工程的应用和延伸32用转基因技术培育出了抗TMV的烟草，主要流程如图-21所示。l l（1）经过程获得的目的基因两侧除应含有相关 的酶切位点外，目的基因的两端还必须有 。l（2
8、）由图分析，构建的重组质粒上含有的标记基因是 基因。l（3）过程采用的是植物组织培养技术，培养基中除含有卡那霉素及植物必需的各种营养成分外，还必须添加 ，以保证受体细胞能培养再生成植株。限制酶l启运子和终止子卡那霉素抗性植物激素l21（6分，每空1分）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图甲、图乙中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：l （1）一个图甲所示的质粒分子经Sma 切割前后，分别含有 、 个游离的磷酸基团。 （2）若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，质粒的热稳定性越 。l（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Srna 切割，原因是 。l （
9、4）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入 酶。l （5）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了 。l21(6分，每空1分) l（1）0、2l（2）高l（3）Sma会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因l（4）DNA连接l（5）鉴别和筛选含有目的基因的细胞专题2 细胞工程细胞工程应用的原理和方法研究的水平研究的目的细胞生物学和分子生物学细胞整体水平或细胞器水平按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品概念分类植物细胞工程动物细胞工程植物细胞工程的理论基础是： 植物细胞的全能性植物细胞工程常用的技术是 植物组织培养植物体细胞杂交全能性高低： 受精卵胚胎干细胞生殖细
10、胞体细胞植物细胞动物细胞2.1.1植物细胞工程常用的技术植物组织培养 植物组织培养的条件 1）离体细胞、组织或器官 2）适宜的外界环境条件，例如无菌、适宜的温度、湿度、光照等 3）培养基（一定的营养物质，植物激素） 植物组织培养的过程离体的植物器官、组织或细胞脱分化（又叫去分化）愈伤组织（排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞）再分化根或芽等器官植物体植物A细胞植物B细胞去壁原生质体A原生质体B原生质体融合融合体再生壁杂种细胞细胞分裂愈伤组织杂种植株去壁的常用方法：酶解法（纤维素酶、果胶酶等） 原生质体融合方法：物理法：离心、振动、电刺激等 化学法：聚乙二醇（PEG） 植物体胞交
11、过程示意图过程示意图概念：应用组织培养技术，快速繁殖植物（也叫快速繁殖技术）原理：植物细胞的全能性优点：繁殖率高，可大批量生产 取材少 培养周期短 保持优良性状微型繁殖2.1.2植物细胞工程的实际应用作物脱毒l病毒在作物体内逐年积累，会导致作物产量降低，品质变差l分生区附近（茎尖、根尖）的病毒极少，甚至没有l采用茎尖进行植物组织培养人工种子l结构：l人工薄膜+胚状体、不定芽、顶芽、腋芽l技术：l植物组织培养l原理：l植物细胞全能性单倍体育种l方法：l花药离体培养（植物组织培养） l技术：l组织培养获得单倍体l秋水素处理单倍体的幼苗，使染色体加倍l优点：l明显缩短了育种年限l后代稳定遗传2.1.
12、2植物细胞工程的实际应用l繁殖植物的新途径l微型育种l作物脱毒l人工种子l育种新方法l单倍体育种l诱导突变体l细胞产物的工厂化生产细胞产物的工厂化生产红豆杉与紫杉醇人参皂甘的生产2.2动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体技术核移植动物细胞工程常用技术2、动物细胞培养过程：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬液胰蛋白酶10代细胞原代培养50代细胞传代培养细胞株无限传代细胞系单个细胞加培养液遗传物质未改变遗传物质已改变动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。（分解弹性纤维）细胞贴壁过程植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细
13、胞培养原理植物细胞的全能性细胞增殖培养基性质固体培养基液体培养基培养基特有成分蔗糖 植物激素葡萄糖 动物血清培养结果植物体细胞株、细胞系培养目的快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白2.2.21、动物细胞融合（细胞杂交）2个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程细胞A细胞B杂交细胞灭活的病毒物理法化学法仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒一、动物细胞融合植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合细胞融合原理细胞膜一定流动性、细胞膜一定流动性细胞融合的方法去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合诱导方法物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）物理、化学方法（
14、同左）灭活的病毒用途获得杂种植株制备单克隆抗体单克隆抗体 由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。 特点：特异性强、灵敏度高、能大量制备、 如何大量生产单克隆抗体？l利用B淋巴细胞产生抗体的功能l利用肿瘤细胞无限增殖的特性l利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞l利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞 单克隆抗体制备过程 注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养能产生特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆抗体 1 下图为某同学根据杂交瘤
15、技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？4、图中B为_过程，常用_作为诱导剂，该细胞继承_的遗传特性，既能_,又能_。1、该实验方案的目的是_3、A是从小鼠的脾脏中取得_,该细胞能够产生_5、C过程指细胞培养，该过程包括_培养和_培养两个阶段。制备单克隆抗体B细胞抗体细胞融合灭活病毒双亲细胞分泌特异性抗体无限增殖原代传代50B体外培养骨髓瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群注射到小鼠腹腔AC2、下是物胞培养的基本程示意。据此回答 (1)容器A中放置的是物器官或。它一般取自_。(2)容器A中的物器官或首先要行的理是_，然后用 酶理，是了使胞分散开来。做的目的
16、是_. (3)培养首先在B瓶中行。瓶中的培养基成分有_ _等。(4)了把B瓶中的胞分装到C瓶中，用_理，然后配置成_，再分装。(5)在C瓶中正常培养了一段后， 胞全部死亡。原因是_。幼龄动物的器官或组织、动物胚胎剪碎 胰蛋白 使每个细胞能与培养液接触 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清 胰蛋白酶 细胞悬液细胞没有发生瘤癌变l22(11分，每空1分) 下图为细胞融合的简略过程，请据图回答：l(1)若A、B是植物细胞，在细胞融合之前已处理，一般用 法除去 ；A、B到细胞C的过程中，常用的化学方法是用 加以诱导。融合完成的标志是 。l(2)若A、B是植物细胞，则形成的D细胞一般应用 技术把D培
17、养成植株。l(3)若A、B是动物细胞，一般取自 ，然后用 处理使其分散开来。l(4)若该过程是制备单克隆抗体，A为小鼠B淋巴细胞，那么，在获得此细胞之前，小鼠已被注射了 ，图中B为 。在A、B到C的过程中，所形成的C有 种，用来培养的D细胞应该是 。l22(11分，每空1分) l（1）酶解 细胞壁 聚乙二醇 形成新的细胞壁l （2）植物组织培养 l（3）幼龄动物组织或胚胎 胰蛋白酶 l （4）相应的抗原 骨髓瘤细胞 3 杂交瘤细胞专题专题3:3:胚胎工程胚胎工程l操作对象：早期胚胎和配子l技术手段：胚胎移植、体外受精、 胚胎分割、胚胎干细胞培养等l理论基础：哺乳动物的受精卵和早期胚胎 的发育规
18、律实例1：l1.下列不属于胚胎工程技术的是（ ）lA.体外受精 lB.胚胎分割、胚胎移植lC.胚胎干细胞培养 lD.转基因鲤鱼的培育精原细胞有丝分裂初级精母细胞次级精母细胞精细胞精子M第一阶段第二阶段第三阶段M精子发生的过程多个精原细胞染色体复制变形精子细胞变形中的主要变化：1.细胞核2.高尔基体3.中心体4.线粒体5.细胞内其他物质精子头的主要部分头部的顶体精子的尾线粒体鞘(尾的基部)原生质滴(球状,最后脱落)2.卵子的发生l(1)发生部位：卵巢l(2)时间：减数第一次分裂是在雌性动物排卵前后完成；减数第二次分裂是在精子和卵子结合的过程完成的。卵原细胞有丝分裂多个卵原细胞染色体复制初级卵母细
19、胞M第一极体次级卵母细胞两个第二极体第二极体卵子退化消失（3）卵子发生过程M排卵前后完成在受精过程完成被卵泡细胞包围,形成卵泡胎儿时期完成1.一个卵泡中能形成几个成熟的卵子？2.排卵是指卵子从卵泡中排出，还是指卵泡从卵巢中排出？3.刚排出的卵是成熟的卵子吗？它在母体的什么部位与精子受精？ 答：刚排出的卵子尚未完全成熟，仅完成第一次减数分裂，需要在输卵管内进一步成熟，直到减数第二次分裂的中期才能与精子结合完成受精过程。排出的卵 子是在输卵管内与精子受精的。 答：正常情况下，一个卵泡只能形成一个成熟的卵子。 答：是指卵子从卵泡中排出。二)受精阶段:1)精子穿越放射冠和透明带 顶体反应使顶体内的顶体
20、酶释放出来并溶解放射冠内的卵丘细胞 透明带反应是防止多精入卵受精的第一道屏障2)精子进入卵细胞膜 卵细胞膜反应是防止多精入卵受精的第二道屏障3)原核形成： 雄原核形成和雌原核形成4)配子结合： 雌雄原核融合形成合子(受精卵)受精穿过放射冠：在卵子外围集聚有几十个精子，它们首先穿放射冠。受精卵卵裂期桑椹胚囊胚（内含囊胚腔）原肠胚（内含原肠腔）胎儿形成：在透明带内进行有丝分裂，细胞数量不断增加，但胚胎总体积并不增加，或略有减少。：由具有全能性细胞构成，细胞数在32个左右，排列紧密，形似桑椹内细胞团：发育成胎儿各组织滋养层细胞：发育成胎膜和胎盘：最初发育在输卵管进行有丝分裂三.胚胎发育滋养层外胚层中
21、胚层内胚层原肠腔试管动物技术 是指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育成早期胚胎后，再经移植产生后代的技术。管物技 程：第一步：体外受精 第二步：早期胚胎的培养第三步：胚胎移植请同学们分小组设计并绘制“试管牛”工厂化生产的技术流程图解。胚胎移植采集卵母细胞体外培养采集精子体外获能体外受精早期胚胎培养受体牛小结（时期： ） 1）超数排卵（试剂） 2）活体取卵（仪器） 3）从屠宰的卵巢取卵方法（方法，试剂）（试剂）（培养条件、目的阶段）成熟的卵子获能的精子MII中期方法有性生殖 无性生殖 核移植技术、胚胎移植遵循 不遵循体外受精胚胎移植 试管动物 克隆动物生殖方式技术手段
22、遗传物质遗传规律比较试管动物和克隆动物来自2个个体 主要来自核供体 一.胚胎移植1.概念:将雌性动物的早期胚胎,或者通过其他方式得到的胚胎,移植到同种的.生理状态相同的其他雌性动物的体内,使之发育为新个体的技术.供体：提供胚胎的个体。受体：接受胚胎的个体。选择供体母牛受体母牛同期发情处理超数排卵供体公牛配种冲卵质量检查、培养胚胎移植妊娠检查分娩（胚胎移植的犊牛）4.胚胎移植的基本程序l39. 【生物选修1：现代生物科学技术】（15分）l胚胎工程技术包含的内容很丰富，如图是胚胎工程技术研究及应用的相关情况，其中供体1是良种荷斯坦高产奶牛，供体2是黄牛，请据图回答下列问题：l(1)应用1中获得的小牛，其遗传物质来源于 ，细胞B的名称是 。l(2)应用2中牛完成体内受精的场所是_，刚种植在子宫内的胚胎其发育程度一般为 ，胚胎种植后可以通过_从母体获得正常发育所需要的物质。这种试管牛的产生，采用的胚胎工程技术有 （至少答出2种）等。l(3)应用3中细胞C取自牛胎儿的 ，或 细胞。l(4)应用4中通过 技术获得二分胚和，得到两只小牛，可以通过PCR技术进行小牛早期胚胎性别鉴定；也可以在细胞水平上通过对_的分析进行性别鉴定。
