1、第 29 卷第 5 期2023年 3 月Vol.29，No.5Mar.，2023中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae基于转录组数据的半夏 AP2/ERF基因家族鉴定及逆境响应分析杨金荣，崔婉宁，张瑜，伯晨，晁秋杰，朱艳芳，段永波，薛涛*，张爱民*（淮北师范大学 生命科学学院 安徽省特色资源植物利用工程实验室，安徽 淮北 235000）摘要 目的：鉴定并研究半夏 AP2/ERF转录因子的功能，为推进半夏品种的遗传改良提供理论依据。方法：该文基于半夏三代转录组数据鉴定了半夏中 AP2/ERF家族成
2、员，并对其进行系统的生物信息学分析，同时利用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测半夏 AP2/ERF在不同组织及不同胁迫条件下的表达情况。结果：通过转录组数据共筛选出 8个全长AP2/ERF 转录因子家族成员，归为 AP2、ERF 和 DREB 3 个亚家族；半夏 AP2/ERF 的氨基酸数目为 251512 个，等电点为 5.2911.72，不稳定指数为 45.9082.41，且主要定位于细胞核中；半夏 AP2/ERF 基因的结构域和 Motifs相对保守。组织特异性表达模式分析显示，半夏 AP2/ERF 基因在不同组织部位中具有不同的表达模式，且主要在叶中表达。逆境
3、胁迫应答分析表明，PtERF1主要响应 NaCl的胁迫诱导；PtERF2 和 PtERF4在低温和聚乙二醇（PEG）胁迫下表达量均有较大幅度的上调；PtERF3同时响应低温和 NaCl两种逆境的诱导；PtERF5同时响应高温、低温、NaCl、PEG 胁迫诱导；PtERF7在高温胁迫下表达量增加；而 PtERF8在低温胁迫下表达量的增加最为显著。结论：通过实验初步推测半夏 AP2/ERF 基因可响应逆境胁迫，可能具有调控半夏光合作用、提高根系抗逆能力等潜在功能。关键词 半夏；AP2/ERF基因家族；基因鉴定；表达分析中图分类号 R284.2；R289；R22；R2-031；R33 文献标识码 A
4、 文章编号 1005-9903（2023）05-0176-09doi 10.13422/ki.syfjx.20230114 网络出版地址 https:/ 2022-12-15 20:24:14Identification and Expression Analysis of AP2/ERF Family in Stress Responses of Pinellia ternata Based on Transcriptome DataYANG Jinrong，CUI Wanning，ZHANG Yu，BO Chen，CHAO Qiujie，ZHU Yanfang，DUAN Yongbo，XU
5、E Tao*，ZHANG Aimin*（Anhui Provincial Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Featured Resource Plants，College of Life Sciences，Huaibei Normal University，Huaibei 235000，China）Abstract Objective：To identify the functions of the AP2/ERF family members in Pinellia ternata and promote the gen
6、etic improvement of P.ternata varieties.Method：We identified and conducted a systematic bioinformatics analysis of the AP2/ERF family member genes in P.ternata based on the three generations of transcriptome data.Real-time polymerase Chain reaction（Real-time）PCR was employed to determine the express
7、ion pattern of AP2/ERF genes in different tissues and under different stress conditions.Result：A total of eight full-length AP2/ERF family members were identified from the transcriptome data，which were classified into three sub-gene families：AP2，ERF，and DREB.The deduced AP2/ERF proteins in P.ternata
8、 had the length of 251-512 aa，the theoretical pI of 5.29-11.72，the instability index of 45.90-82.41，subcellular localization in 收稿日期 2022-10-10基金项目 国家自然科学基金项目（81803665，82274048）；安徽省高校自然科学研究项目（KJ2021A0532）第一作者 杨金荣，在读硕士，从事药用植物研究，E-mail：通信作者 *薛涛，副教授，从事拟南芥和药用植物方面的研究，E-mail：xuetao_；*张爱民，高级实验师，从事药用植物生长调控和
9、次生代谢方面的研究，E-mail： 药学基础 176第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023the nucleus，and conserved domains and motifs.AP2/ERF genes were expressed in different tissues of P.ternata，with high expression levels in the leaf.The stress respon
10、se experiments showed that PtERF1 mainly responded to NaCl stress.The expression of PtERF2 and PtERF4 was significantly up-regulated under low temperature and polyethylene glycol（PEG）-simulated stress.PtERF3 responded to both low temperature and NaCl stress.The expression of PtERF5 was induced by hi
11、gh temperature，low temperature，NaCl and PEG stress.The expression of PtERF7 was up-regulated under high temperature，while that of PtERF8 under low temperature.Conclusion：The AP2/ERF genes in P.ternata can respond to stress and have the potential functions of regulating photosynthesis and improving r
12、oot stress resistance.Keywords Pinellia ternata；AP2/ERF gene family；gene identification；expression analysis半夏（Pinellia ternata）属于天南星科半夏属植物，主要产于四川、湖北、河南、江苏、贵州等省。半夏作为我国传统中药材，具有镇咳、祛痰、抗肿瘤等功效1。半夏忌旱怕涝，其生长的最适温度为 1525，在高温缺水条件下半夏会出现地上部分枯萎的现象，俗称“倒苗”2。研究表明半夏倒苗的临界温度为 30 3，“倒苗”对半夏的保存和繁殖有积极影响，是半夏对不良环境的一种适应，但其也会显著
13、降低半夏产量，因此缓解半夏倒苗也是一种重要的增产技术2。近年来，分子生物学技术在药用植物中应用广泛，功能基因的挖掘及表达模式分析成为研究热点4。目前已有针对半夏倒苗的研究，但多数仅处于生理水平，而从转录水平上挖掘响应半夏高温胁迫及倒苗相关功能基因的研究较少。AP2/ERF是一个广泛存在于植物中的转录因子家族，以 6070 个氨基酸组成的高度保守的 AP2/ERF 结构域而得名5。其特征是由 N 端的 DNA 结合域、C端的转录调控域、寡聚化位点和核定位信号4 个主要的功能域组成6。根据序列的相似性及结构域的数量可将 AP2/ERF基因家族分为 AP2、ERF、DREB、RAV 和 Solois
14、t 5个亚家组。其中 AP2蛋白包含 2 个相似性高且重复的 AP2 结构域7；RAV 蛋白包含 1 个 AP2 结构域和 1 个 B3 结构域8；ERF 蛋白和 DREB 蛋白都包含有 1 个 AP2 结构域，区别在于ERF 亚家族第 14 位氨基酸是丙氨酸，第 19 位是天冬氨酸，而 DREB 亚家族为缬氨酸和谷氨酸9。目前，AP2/ERF 基因家族已经在许多植物中被鉴定，例 如，NAKANO 等10在 拟 南 芥 中 发 现 了 147 个AP2/ERF 转录因子，RASHID 等11报道了 170 个水稻 AP2/ERF 基因，SONG 等12在番茄中发现了 190个 AP2/ERF
15、转录因子。AP2/ERF 在植物生长发育过程中具有重要功能，可直接或间接的在生物和非生物胁迫过程中发挥作用。例如，白桦 BpERF1.1基因的过表达株系同野生型相比，其在低温、干旱和高盐胁迫下的抗逆性显著增强13；水稻抗虫相关基因 OsERF3 通 过 调 控 OsMPK3、OsWRKY53 和OsWRKY70 的表达，从而引起下游防御反应发挥作用，增强水稻对二化螟的抗性14。目前，半夏基因组信息仍不清楚，导致其在分子水平上的研究发展相对迟缓，特别是关于半夏AP2/ERF 转录因子的研究还未见报道。因此，本研究基于半夏转录组数据，借助生物信息学手段鉴定了半夏 AP2/ERF 家族成员，并对其理
16、化性质、蛋白保守域、系统进化关系、组织表达模式进行了分析，同时研究了不同胁迫条件下的表达模式，为后续开展半夏 AP2/ERF转录因子的功能研究，推进半夏品种的遗传改良提供理论依据。1 材料RXZ-500B 型智能人工气候培养箱（常州国宇仪器制造有限公司），ME104E型万分之一分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），5430R 型高速低温离心机（Eppendorf 中国有限公司），MaestroNano 型超 微 量 分 光 光 度 计（环 亚 生 物 科 技 有 限 公 司），Tanon 1600 型 凝 胶 成 像 系 统（上 海 天 能 公 司），LightCycler96 型 实 时
17、荧 光 定 量 聚 合 酶 链 式 反 应（Real-time PCR）仪（瑞士罗氏公司），LS-75HD 型高温高压灭菌锅（上海博讯实业有限公司），RNase-Free 离心管（LABSELECT，MCT-001-1501.5 mL）；MonzolTM Reagent（莫 纳 生 物 科 技 有 限 公 司，批 号MI20101S），三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、聚乙二醇（PEG）-6000、NaCl（国药集团化学试剂有限公司，批号分别为20200907、20190826、20210927、20181108、20201113）；脱落酸（ABA，北京索莱宝科技 有 限 公 司，批 号 322N0
18、28）；5All-In-One MasterMix transcription kit试剂盒（ABM 公司，批号G492）；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号 Q131-02）。本研究的实验材料半夏为淮北师范大学薛建177第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023平教授提供，取其均一大小块茎种植于 RXZ-500型人工气候培养箱中（明暗周期 16 h/8
19、h，温度 25）。待半夏生长至三叶期，选择长势相同的半夏，分别用 200 mmol L-1 NaCl、100 mol L-1ABA、20%PEG-6000、高温（42）和低温（4）对半夏进行胁迫处理，选取正常生长的半夏为对照组，分别于 6、12、24、72 h 收集整株半夏材料，同时收集对照组半夏叶片、叶柄、块茎和根各组织器官材料，迅速置于液氮中，80 中保存用于后续 RNA 提取。上述各处理材料 30株，实验重复 3次。2 方法2.1半夏 AP2/ERF 基因家族的成员鉴定 基于半夏遮荫转录组（SRP215828）15，初步筛选并获得半夏 AP2/ERF 基因号及序列，保留含有 AP2/ER
20、F结构域的基因，并通过 DNAMAN 软件进行同源性分析，删除重复的基因序列并命名为 PtERFs。2.2半夏 AP2/ERF 转录因子的系统进化分析 通过 植 物 转 录 因 子 数 据 库 PlantTFDB16（http：/）获取拟南芥 AP2/ERF 基因家 族 成 员 的 蛋 白 序 列 作 为 参 考 序 列。通 过MUSCLE 程序对拟南芥和半夏的 AP2/ERF 蛋白序列进行多序列比对分析，使用 MEGA7 将比对后的结果采用邻接法进行系统进化树的构建，其中 Boot-strap 参 数 值 设 定 为 1 000、p-distance 和 Partial deletion，其
21、余参数为默认值。2.3 半 夏 AP2/ERF 的 理 化 性 质 及 保 守 结 构 域、Motif 分 析 于 2022 年 7 月 19 日 通 过 在 线 网 站ExPASy17（http：/web expasy.org/prot-param/）、SOPMA（http：/npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）预测 PtERFs 蛋白的一级结构和二级结构，运用在线网站 SWISS-MODEL（https：/www.swissmodel.expasy.org/）模拟PtERFs 蛋 白 的 三 维 结
22、构。使 用 Cell-PLoc 2.018（http：/ 亚 细 胞 定 位 预 测 分 析，通 过 在 线 工 具 Pfam19（http：/pfam.xfam.org/）、MEME20（http：/meme-suite.org/index.html）分析 PtERFs蛋白的结构域及保守域，其中 Motifs 数量设置为 7 个，使用 TBtools21软件绘制可视化图。2.4半夏 AP2/ERF 基因的表达模式分析 利用实验室前期光照 20 d（D20CK）和遮荫 20 d（D20S）的RNA-seq数据，基于每个 PtERF基因的 FPKM 值，使用 TBtools 绘制热图。利用在线网
23、站 NCBI（https：/ncbi.nlm.nih.gov/）对获取的 PtERFs 基因进行 Real-time PCR 引物设计并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表 1。使用 TRIzol 法提取半夏不同组织部位和不同胁迫条件下整株半夏的总 RNA，液氮充分研磨 3050 mg 半夏样品后转移至 RNase-Free 离 心 管 并 加 入 莫 纳 生 物 科 技 有 限 公 司 的MonzolTM Reagent 1 mL混匀，室温静置 5 min后加入三氯甲烷 0.2 mL 剧烈震荡，离心吸取上清液转移至新的 RNase-Free 离心管并加入等体积的异丙醇颠倒混匀，室温放
24、置 10 min 后离心去上清，75%乙醇洗涤沉淀两次后用 RNase-Free 的 ddH2O 充分溶解RNA，对提取的 RNA 分别使用超微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳进行浓度和纯度检测。结果显示吸光度 A260/280的比值在 1.82.0，说明 RNA 的浓度和纯度在正常范围内，没有明显的 DNA 和蛋白污染。利 用 ABM 公 司 的 5All-In-One MasterMix transcription kit进行 cDNA 反转录，步骤均参照说明书进行。以 cDNA 为模板、Pt18S 为内参基因，选用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的 AceQ qPCR SYBR Green M
25、aster Mix 和 罗 氏 公 司 的LightCycler96 PCR 仪进行 PtERFs 基因表达量分析，具体操作步骤参照文献 6 进行。2.5数据分析 原始数据通过 LightCycler 96 SW 1.1 软件获得，表达量按 2-Ct计算。采用 Microsoft Excel 2019 软件和 IBM SPSS 20.0 软件对本文取得的数据进行处理，student-t 检验方法检验不同处理之间的差异，P7，为碱性蛋白，其余为酸性蛋白。PtERFs 蛋白家族的不稳定指数为45.9082.41，均为不稳定蛋白。其平均疏水性均0，说明 PtERFs 蛋白家族均为亲水蛋白。亚细胞定位
26、预测分析，发现 PtERF1定位在细胞质中，PtERF8定位在细胞质和细胞核中，其余 PtERF2PtERF7均定位在细胞核中。因此，PtERFs基因编码的蛋白在178第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023氨基酸序列长度和蛋白特性变化上具有一定的差异，该蛋白家族主要以酸性、亲水的不稳定蛋白构成，且主要定位在细胞核中，见表 2。对 PtERFs 基因编码蛋白质的二级结构进行分析，结果表明 8 个 PtERFs 蛋白二级
27、结构均由-螺旋、延伸链、-转角和无规则卷曲组成，见表 3。其中，无规则卷曲为 PtERFs 蛋白的主要二级结构构成，其占比均高于 55%，PtERF6 的无规则卷曲率最低 为 55.06%，而 PtERF4 卷 曲 率 最 高 达 61.43%。-螺旋在蛋白二级结构中的分布介于 21%32%，延伸 链 分 布 于 7%14%，而 -转 角 占 比 最 少。对PtERFs 蛋 白 进 行 三 维 结 构 模 拟，可 以 看 出 8 个PtERFs蛋白主要是由-螺旋及无规则卷曲组成，与二级结构预测结果一致，见图 1。3.2 半 夏 AP2/ERF 系 统 进 化 分 析 目 前 对 半 夏AP2/
28、ERF 基因家族的了解较少，研究半夏 AP2/ERF基因家族的系统发育关系有助于揭示其基因功能。利用 MEGA7 软件对半夏（8 条）和拟南芥（61 条）AP2/ERF 基因家族蛋白序列进行邻接（NJ）系统发育树构建，结果表明，8个 PtERFs蛋白被划分为 3个亚 家 族 DREB、ERF、AP2。其 中 PtERF1、PtERF3、PtERF4、PtERF5 分 别 属 于 DREB 亚 家 族 的 A2 和A6；PtERF2和 PtERF6分别属于 ERF亚家族的 B2和B3；PtERF7和 PtERF8属于 AP2亚家族，见图 2。3.3半夏 AP2/ERF 蛋白的结构域及保守基序分析
29、 通过 CDD 数据库分析每个半夏 AP2/ERF 蛋白的结 构 域，结 果 表 明 PtERF1、PtERF2、PtERF3、PtERF4、PtERF5、PtERF6 含 有 1 个 AP2 结 构 域；表 1半夏 AP2/ERF基因 Real-time PCR引物序列Table 1Real-time PCR primer sequence of AP2/ERF genes from P.ternata基因名称PtERF1PtERF2PtERF3PtERF4PtERF5PtERF6PtERF7PtERF8基因号i2_LQ_Pts1_c122181/f1p7/2005i1_LQ_Pts1_c5
30、3196/f1p10/1433i2_LQ_Pts1_c36470/f10p20/2324i1_LQ_Pts1_c77966/f1p0/1582i2_LQ_Pts1_c97023/f1p14/2165i1_LQ_Pts1_c58334/f1p2/1538i2_LQ_Pts1_c7205/f1p3/2500i2_LQ_Pts1_c47570/f1p2/2245上游TGAGATCCACATAGTCCCTTCAGAATTCGCGGGCAGAAAGAGGAACAGCTTAGGCAGCAGAGTCAGTAAGGACTGCTCGCCGGCAGCTATCCTCCCAAAAAAGAGGGAGAGGGAAGACG
31、ATTCGACTGGAATGGGTCAGCATAATGTGGGTGGGCAGTCG下游GTCGAGATCCAAATCGAGGACTGGTGTTCTGGTTGGCATAGGACTTCATGGGTTGAGCCATCGTCGAAGCAGTCGAAGGCGACGACACCGAGGAAGATTTGAAGATGCCCTTGACCTCGAAAACACCATGGCTTGTGCCTGAGATTCCCATCTCCCCGT长度/bp1 011751 1618829301 0111 2751 539表 2半夏 AP2/ERF蛋白基本信息Table 2Physicochemical properties of AP2/
32、ERF proteins from P.ternata基因名称PtERF1PtERF2PtERF3PtERF4PtERF5PtERF6PtERF7PtERF8氨基酸数目/个336251386293309336424512蛋白质理论分子量/kDa35.8028.3040.8631.9733.4635.2846.7055.71等电点6.615.705.5311.727.915.295.496.29不稳定指数52.3845.9065.9482.4171.5964.1553.7752.37脂肪系数72.7752.5167.6457.1365.4769.2356.4660.06平均亲疏水性-0.367-
33、0.873-0.384-0.695-0.606-0.435-0.714-0.606亚细胞定位细胞质细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞核细胞质、细胞核表 3半夏 AP2/ERF蛋白二级结构分析Table 3Secondary structure analysis of AP2/ERF proteins from P.ternata%基因二级结构-螺旋延伸链-转角无规则卷曲PtERF125.3010.125.3659.23PtERF229.089.565.5855.78PtERF331.357.253.1158.29PtERF423.2111.953.4161.43PtERF526.5411.65
34、4.8556.96PtERF623.5115.186.2555.06PtERF723.3513.945.6657.08PtERF821.2913.484.3060.94179第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023PtERF7和 PtERF8包含 2个 AP2结构域，见图 3。使用在线网站 MEME 对半夏 AP2/ERF 基因家族进行比对分析预测出其保守域，发现共有 7 个保守基序存在于 PtERFs 基因家族中，并
35、将其命名为Motif1Motif7。结果显示，8 个 PtERFs 蛋白都含有Motif1 和 Motif2，由 此 可 以 推 测 Motif1、Motif2 是PtERFs 蛋白序列中的重要组成部分。此外属于DREB 亚家族的 PtERF3 和 PtERF5 亦包括 Motif6，属于 AP2 亚家族的 PtERF7 和 PtERF8 包括 Motif3、Motif4、Motif5，见图 4、图 5。3.4半夏 AP2/ERF基因表达模式分析 3.4.1遮荫条件下半夏 AP2/ERF 基因表达模式分析 温度是影响半夏倒苗的重要因素，为了解半夏AP2/ERF 基因家族在半夏遮荫过程中的表达情
36、况，利 用 课 题 组 前 期 光 照 20 d（D20CK）和 遮 荫 20 d（D20S）的 RNA-seq 数据绘制半夏 AP2/ERF 基因表达热图并对其表达模式进行了聚类分析。结果表明 PtERF1、PtERF2、PtERF4、PtERF5、PtERF6 和PtERF8在遮荫条件下的相对表达量呈上升的趋势，而 PtERF3和 PtERF7在遮荫条件下的相对表达量降低，见图 6。3.4.2半夏 AP2/ERF基因的组织差异表达分析 利用 Real-time PCR 对 8 个半夏 AP2/ERF 基因在各个组织部位（叶片、叶柄、块茎和根）的表达情况进行分析，结果显示 8 个 AP2/E
37、RF 基因在半夏的不同组织部位中均有表达，但存在组织表达差异性，其中 PtERF1、PtERF3、PtERF6 和 PtERF7 在叶中高表达，而 PtERF2在叶柄中表达量相对较高，PtERF4在叶柄和块茎中的表达量显著高于其他组织，PtERF5和 PtERF8则在叶柄和根中呈现高表达，见表 4。3.4.3半夏 AP2/ERF 基因在非生物胁迫下的表达模式分析 高温胁迫为半夏生长中的重要限制因子，易引发其倒苗，本研究首先分析了 8 个 PtERFs在 高 温 胁 迫 下 的 表 达 变 化。结 果 发 现 PtERF1、PtERF2、PtERF3、PtERF4、PtERF8 表达量在高温胁迫
38、各时间点均受抑制，而高温胁迫可促进 PtERF7注：.半夏 AP/ERF家族蛋白图 2半夏 AP2/ERF家族蛋白和拟南芥 AP2/ERF家族蛋白进化树Fig.2Phylogenetic analysis of AP2/ERF protein in P.ternata and Arabidopsis thaliana注：AH.PtERF1PtERF8蛋白三维结构图 1半夏 AP2/ERF蛋白结构预测Fig.1Protein structure prediction of AP2/ERF proteins in P.ternata图 3半夏 AP2/ERF家族的结构域Fig.3Domain of
39、 AP2/ERF family in P.ternata180第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023表达量的提高，其表达量在高温胁迫 6 h 和 12 h 较对照分别提升了 51%和 64%。PtERF5和 PtERF6在高温动态过程中的变化呈现出先降低后升高的趋势，与对照相比，PtERF5表达量在高温胁迫 6 h降低了 68%，而高温胁迫 24 h 其表达量提升至胁迫前的1.6倍；PtERF6表达量在高温胁迫 6
40、h和 12 h约降低为胁迫前表达量的 1/4，而其表达量在高温胁迫 24 h又提升至胁迫前水平，见表 5。进一步分析候选基因在其他逆境胁迫条件下表达变化，发现其表达变异呈现多样性。在 ABA处理条件下，8 个 PtERFs的表达量均呈降低趋势。而在低温、NaCl、PEG胁迫处理后 8个基因呈不同变化趋势，其中低温胁迫 72 h 时 PtERF1 表达量显著降低，表达量约为胁迫前的 1/7，其余 7 个基因的表达量均较对照显著升高，PtERF2、PtERF6 和 PtERF8表达量分别为胁迫前 6.5、4.8 和 11.1 倍。分析 NaCl和 PEG 胁 迫 条 件 下 PtERFs 的 表
41、达 量 变 化，发 现PtERF1、PtERF3 和 PtERF5 受 NaCl 诱导表达，分别图 4半夏 AP2/ERF家族的保守基序分析Fig.4Conserved motif of AP2/ERF family in P.ternata图 5MEME预测的 7个 motifs logoFig.5Logos of seven motifs predicted by MEME online software图 6遮荫条件下半夏 AP2/ERF基因家族的表达谱分析Fig.6Expression profile analysis of AP2/ERF genes in P.ternata und
42、er shading condition表 4半夏 AP2/ERF基因在不同组织部位中的相对表达水平Table 4Relative expression level of AP2/ERF genes in different tissues of P.ternata组织部位叶片叶柄块茎根PtERF110.3100.1330.486PtERF212.4970.5531.197PtERF310.2670.3250.298PtERF412.4282.5371.128PtERF513.0040.3313.403PtERF610.7220.1260.174PtERF710.8490.2650.519Pt
43、ERF811.8790.5451.761181第 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023较 oh 提升了 19.4、4.7 和 10.6 倍，而 PEG 胁迫诱导PtERF2 和 PtERF5 的表达量分别增加了 2.8 和 2 倍，PtERF3 的表达量则在 PEG 胁迫条件下降低了 4.9倍，见图 7。4 讨论有研究表明，转录因子常在植物响应逆境胁迫过程中具有重要调控作用22。在植物受到胁迫时，具有抗逆境作用的转录因
44、子的功能区域通过与下游信号通路功能基因启动子顺式元件作用或与其他转录因子互作而产生一个转录因子网络，进而调控胁迫过程中的基因表达，以此来调控植物抵抗胁迫的能力。目前，有关 NAC23、MYB24-26、bZIP27、bHLH28、WRKY29、AP2/ERF30等转录因子的研究较多，其中 AP2/ERF 转录因子已在多种植物中被研究报道，如玉米、水稻和小麦等31，而在半夏中的研究尚未见报道。本研究在半夏转录组中共鉴定出 8个 AP2/ERF基因，同拟南芥 AP2/ERF 基因家族成员一起进行聚类分析，显示其中 2 条为 DREB 亚家族成员、2 条为ERF亚家族成员、2条为 AP2亚家族成员，
45、而 PtERF1和 PtERF4 没有聚集在这 3 个亚家族中，说明这 2 个蛋白与其他蛋白之间具有较大的变异性。通过分析半夏 AP2/ERF 蛋白的一级结构和二级结构可知8 个 PtERFs蛋白均为不稳定的亲水性蛋白、以无规则卷曲为主，且亚细胞定位主要定位于细胞核中，与董亚茹等32报道的桑树 AP2/ERF 蛋白分析结果一致。进一步分析半夏 AP2/ERF 基因家族的功能，PtERF2 在低温和 PEG 胁迫条件下表达量显著增加，而在 ABA 和高温胁迫下显著降低，分析进化关系可知 PtERF2与拟南芥 B-2族的亲缘关系较近，拟南芥 B-2族成员可以调节植物根系发育并响应缺氧应激反应33-
46、35，因此推测 PtERF2具有在非生物胁迫条件下调控植物生长发育的功能。PtERF6 与拟南芥 B-3 组成员具有较近的亲缘关系，拟南芥 B-3 组成员可响应低温胁迫36-37，在低温条件下 PtERF6表达量增加，说明 PtERF6 在植物生长过程中可能具表 5高温胁迫下半夏 AP2/ERF基因家族的相对表达水平Table 5Relative expression levels of AP2/ERF genes in P.ternata under high temperature stresst/h061224PtERF110.6430.6590.401PtERF210.1060.182
47、0.383PtERF310.4350.2290.149PtERF410.1910.5040.197PtERF510.3230.6521.610PtERF610.2690.2250.955PtERF711.5141.6411.063PtERF810.3790.2310.489注：A.低温胁迫；B.ABA胁迫；C.NaCl胁迫；D.PEG胁迫；与对照组比较1）P0.05图 7非生物胁迫下半夏 AP2/ERF基因家族的相对表达水平Fig.7Relative expression levels of AP2/ERF genes in P.ternata under abiotic stress182第
48、 29 卷第 5 期2023年 3 月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol.29，No.5Mar.，2023有响应低温胁迫的功能。PtERF3 和 PtERF5 在低温、ABA、NaCl、PEG 和高温胁迫条件下均较对照有显著的变化，预测可知 PtERF3 和 PtERF5 与具有响应 PEG、高温、ABA 及 NaCl 胁迫功能的拟南芥 A-6族同源38-41，推测 PtERF3 与 PtERF5 可以调控非生物胁迫。组织表达模式结果显示 PtERF3 在叶片中的表达量高于其他组织部位
49、42，因此推测 PtERF3可能参与半夏叶片中光合作用的调控，进而介导半夏的非生物胁迫响应。高温胁迫引起半夏倒苗主要发生于叶柄部位43-44。通过对半夏 AP2/ERF基因家族的保守基序分析结果表明，属于同一亚族的基因成员表现出相似的 Motif 组成，说明其在功能上可能具有相似性，不同亚族的成员之间保守基序的数量、种类以及在分布上存在一定的差异，因此推测它们在功能上具有一定的差异性。本文共鉴定出 8 个半夏 AP2/ERF 基因家族成员，通过系统进化和表达模式分析初步推测出半夏AP2/ERF 基因的潜在功能，如调控半夏光合作用、促进半夏叶柄次生壁的发育、提高根系抗逆能力等。同时，AP2/ER
50、F 基因可能对防御半夏“倒苗”现象的发生起到调控作用，而有关基因功能和倒苗机制还需要进一步研究。目前半夏在分子生物学领域的相关研究较少，本研究鉴定出的半夏 AP2/ERF转录因子及其结构特征可为进一步分析研究半夏AP2/ERF基因家族成员的功能提供参考。利益冲突 本文不存在任何利益冲突。参考文献 1李哲，玄静，赵振华，等.半夏化学成分及其药理活性研究进展 J.辽宁中医药大学学报，2021，23（11）：154-158.2薛建平，丁勇，张爱民，等.高温胁迫下半夏倒苗前后保护酶活力的变化 J.中国中药杂志，2004，29（7）：641-643.3马聪吉，张智慧，王丽，等.不同温度对半夏倒苗的影响
