1、第 46 卷第 1 期2023 年 1 月河 北 农 业 大 学 学 报JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITYVol.46 No.1Jan.2 0 2 3基于转录组测序分析 SPACA1 在版纳微型猪近交系 睾丸中的表达及转录调控特征刘志朋1，张 霞2，代红梅1，杨福华1，廖隽锐1，许 静1，霍金龙1（1.云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201；2.吕梁学院 生命科学系，山西 吕梁 033001）摘要：旨在分析版纳微型猪近交系（Banna mini-pig inbred line，BMI）SPACA1 基因的序列特征、生物学功能及在睾
2、丸中的表达调控模式。选取 4 头成年 BMI 公猪的睾丸进行全转录组测序，获得 SPACA1 基因在睾丸中的表达丰度。采用 RT-PCR 技术克隆 SPACA1 的完整编码序列，分析 SPACA1 的序列、染色体定位、分子特征及相应蛋白的结构和功能。对 SPACA1 的相互作用蛋白进行 GO、KEGG 功能富集，并将获得的蛋白与转录组测序所获得的基因表达量进行关联分析。利用转录组测序数据构建 SPACA1 mRNA 与 miRNA 和 lncRNA 的ceRNA 调控网络。SPACA1 基因 CDS 区全长为 888 bp（Genbank 登录号：OK042308），具有 2 个跨膜螺旋结构，
3、与 SPACA3、SPACA4、HIPK4 和 CCDC62 显著相关；SPACA1 及其互作蛋白主要参与精子细胞发育、分化，精子活力、顶体反应和精子鞭毛形成等通路；SPACA1 基因受 6 个 miRNAs 靶向调控。本研究报道了 SPACA1的表达、分子结构、蛋白质功能、在睾丸中的和转录调控作用，为深入研究 SPACA1 基因在 BMI 受精以及顶体反应等重要生物学过程中的功能奠定基础。关 键 词：精子顶体膜相关蛋白 1；蛋白互作；功能分析；ceRNA 转录调控中图分类号：S828.3 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：文献标志码：ATranscriptomic analysis o
4、f expression and transcriptional regulation of SPACA1 in the testes of Banna mini-pig inbred lineLIUZhipeng1,ZHANGXia2,DAIHongmei1,YANGFuhua1,LIAOJunrui1,XUJing1,HUOJinlong1(1.College of Animal Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;2.Department of Life Sciences,L
5、yuliang University,Lvliang 033001,China)Abstract:This study analyzed the sequence characteristics,biological functions and expression regulation pattern of SPACA1 gene in the testis of Banna mini-pig inbred line(BMI).The testis samples of four adult BMI boars were collected for whole transcriptome s
6、equencing to obtain the expression abundance of SPACA1 gene.The complete coding sequence of SPACA1 was cloned by RT-PCR,and the sequence,chromosome location,molecular characteristics,structural and functions of the corresponding protein were analyzed.The interacting proteins of SPACA1 were enriched
7、using GO and KEGG,and the correlation analysis was performed between the proteins and 收稿日期：2022-08-22基金项目：国家自然科学基金项目（32060733）；吕梁学院博士科研启动基金项目.第一作者：刘志朋（1997），男，云南曲靖人，硕士研究生，从事猪分子遗传育种和生殖生理研究.E-mail:通信作者：霍金龙（1975），男，山西五寨人，教授，博士，从事猪分子遗传育种和生殖生理研究.E-mail:本刊网址：http:/文章编号：1000-1573(2023)01-0088-09DOI：10.1332
8、0/ki.jauh.2023.001389第 1 期the gene expression abundance.Transcriptome data were used to construct the ceRNA regulatory network among mRNA,miRNA and lncRNA of SPACA1.The full-length CDS of SPACA1 was 888 bp(Genbank accession number:OK042308),and SPACA1 protein contained two transmembrane helix struct
9、ures.SPACA1 significantly correlated with SPACA3,SPACA4,HIPK4 and CCDC62.SPACA1 and its interacting proteins were mainly involved in germ cell development,spermatid differentiation,sperm motility,acrosomal vesicle and sperm flagellum.BMI SPACA1 gene was targeted by six miRNAs.Overall,our study provi
10、ded comprehensive information on the expression,molecular structure characteristics,protein functions,and transcriptional regulation of SPACA1 in testis,laying a foundation for further study on the functions of SPACA1 gene in important biological processes such as BMI fertilization and acrosome reac
11、tion.Keywords:sperm acrosome membrane-associated protein 1(SPACA1);protein-protein interaction;functional analysis;ceRNA transcriptional regulation顶体是处于精子头前段的膜相帽状结构，顶体反应的诱导是哺乳动物成功受精的必要条件之一，顶体反应的生物学过程极其复杂，在睾丸中，顶体是由高尔基体产生的前顶体颗粒融合成一个大的顶体颗粒，然后呈现出成熟的物种特异性构象1。SPACA1（SAMP32），是精子顶体相关家族成员之一，最初由 Hao 等2在人类精子的提
12、取物中发现，并证明该蛋白是 1 种睾丸特异性的跨膜糖蛋白，与顶体内膜和精子顶体的赤道段有关。SPACA1 是公猪和公羊精子赤道段的主要酪氨酸磷酸化蛋白，在精卵融合中发挥作用3。卵母细胞成功受精不仅需要精子顶体的形态完整性，而且需要正常的分子结构。在雄性小鼠中敲除 SPACA1 基因，会导致成熟精子中顶体变性和消失，精子分化结构缺陷，甚至头部形成异常，最终影响精-卵融合4。顶体畸形或丧失会患球形精子症，该疾病是一种精子发生过程缺陷引起的不育综合症5。该病症的家族性遗传倾向较为严重，其主要受数量性状影响6。SPACA 家族中的 SPACA3 已被证明是 1 种溶菌酶样蛋白，并对 N-乙酰氨基葡萄糖
13、的寡糖具有保守的底物结合性，可与卵黄周围的透明质酸或相关分子结合7。SPACA4 是 1 种糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，具有类似于尿激酶纤溶酶原激活物受体超家族的功能域，SPACA4 能作为顶体膜受体，参与顶体膜的蛋白水解或粘附8。在 SPACA 家族中，SPACA3 和 SPACA5 具有很强的氨基酸同源性，SPACA7 蛋白在顶体反应过程中释放并参与受精9。版 纳 微 型 猪 近 交 系（Banna mini-pig inbred line，BMI）是自 1980 开始建系培育的高度近交群体，其在生命科学研究领域具有重要价值，是猪-人异种器官移植的良好供体10，急需扩繁群体数量来满足市场需求，
14、然而相对于其他地方品种猪，其繁殖力整体偏低，且出现了部分公猪不育现象，严重制约了其种群扩大，有悖市场需求。研究雄性育性相关基因的表达调控，对于理解 BMI 睾丸发育、精子发生、顶体反应的分子机制具有重要意义，不仅可以为探寻 BMI 公猪不育机制奠定基础，也可为困扰人类男性不育问题的解决提供借鉴。本研究以 BMI 睾丸组织为材料，分离 SPACA1 基因，分析其分子特征及互作蛋白，对其进行功能注释并构建ceRNA 网络，获得调控其的 miRNAs，结果可为进一步解析 SPACA1 调控 BMI 受精过程尤其是顶体反应过程的分子机制奠定基础。1 材料与方法1.1 基因扩增及序列测定采集 4 头 1
15、2 月龄 BMI 成年公猪的睾丸，提取总 RNA，送天津诺禾致源科技有限公司进行转录组测序筛选到高表达的精子发生相关基因SPACA1，其 对 应 Ensembl 中 猪 SPACA1 201 转录 本 ENSSSCT00000004763.4，利 用 R 包 Gviz对其表达丰度进行可视化。根据该转录本序列设计引物（F:CCGAGAACCATGAGCC；R:CGCTCTAATCTCCTTTGGTTT），使 用 Takara 公司的 Premix TaqTM扩增 SPACA1 基因。反应总体积25 L，其中 Premix 12.5 L，10 mol/L SPACA1 的F/R 引物各 1 L，5
16、0 ng/L 的睾丸 cDNA 1 L，用H2O 补足体积；扩增程序：94 5 min；94 30 s，55 45 s，72 60 s，循环 30 次；72 5 min。1.2 SPACA1 功能分析用 Lasergene 7.1 软 件 读 取 测 序 峰 图 获 得SPACA1 完 整 CDS 序 列；用 ProtParam 分 析SPACA1 的分子量、分子式及等电点等基本参数；用 SMART、SOPMA、ProtScale、TMHMM 和刘志朋，等：基于转录组测序分析 SPACA1 在版纳微型猪近交系睾丸中的表达及转录调控特征90第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报SignalP
17、 分别分析 SPACA1 蛋白质的功能域、二级结构、疏水结构、跨膜螺旋结构及信号肽，用I-TASSER预测 SPACA1 蛋白的三级结构，用 MEGA11 构建SPACA1 多物种氨基酸系统发育树。1.3 SPACA1 相关蛋白互作分析使用 String 11.5 进行蛋白互作网络分析，并将获得的蛋白使用 R 包的 clusterProfiler 进行 GO 和KEGG 功能富集，规定 P 值小于 0.05 的条目具有显著性；然后将获得的蛋白与转录组测序所获得的基因表达量关联，并计算它们之间的表达量相关性。1.4 SPACA1 的功能注释和 miRNA 和 lncRNA 调控分析通过 Unip
18、rot 数据库注释 SPACA1 参与的过程，用 miRanda 3.3 和 RNAhybrid 2.1.2 软件结合全转录数据综合筛选可调控 SPACA1 的 miRNA 和 lncRNA，用Cytoscape 3.9.1 可视化 ceRNA 转录调控网络。2 结果与分析2.1 SPACA1 基因结构、CDS 区序列及表达特征转录组测序获得 SPACA1 基因在 BMI 睾丸组织中的表达丰度如图 1 A 所示，SPACA1 基因位于猪 1 号染色体 56 378 291 56 395 493 bp 之间，全长 17 202 bp（图 1 A）。利用 F/R 特异引物从 BMI睾丸样品中扩增获
19、得了 SPACA1 937 bp 片段（图1B），SPACA1 基因有 7 个外显子和 6 个内含子，剪 接 位 点 符 合 GT-AG 法 则（图 1 C）。SPACA1基 因 完 整 CDS 区 长 888 bp，Genbank 登 录 号：OK042308，编码295个氨基酸（图1D）。其中，129 bp 处含有信号肽，41 61 bp 处含有低聚合度功能域，219 241 bp 处含有跨膜区（图 1 D）。ABD外显子统计外显子Exon长度/bpLength位置Position剪接位点序列Swquence at donor-acceptor junction121756378291 5
20、6378507 gcagtcagggCCGAGAACCAGAGCAGGATGgtgagggctg25756383599 56383655 ttatgtttagTTTCAAATAAGTTACATGTGgtaagtggca310256386822 56386923 tttaccaaagGTGTTGGTATGTTGTGGCTgtgagttgga410756387642 56387748 ttttttccagGGGGTAAACCGCCAAAACCAAgtgagtaatg513656389075 56389210 tttaaaatagCAAGCCGTTAACAACAGCTGgtaagtaccc61215
21、6394508 56394628 ttttctctagAATTGCAGATTTGTAAACTGgtaggtgaag723356395261 56395493 cttcttccagGGCGACAGTCACCATATAGCaaaatactttC注：A.基因表达丰度；B.RT-PCR 产物；C.外显子统计；D.编码区分析。图 1 SPACA1 基因结构Fig.1 Gene structure of SPACA191第 1 期2.2 SPACA1 蛋白质序列及结构分析猪 SPACA1 蛋白质分子量 32.24 kD，分子式C1410H2237N373O457S16，等电点 4.42。SPACA1蛋白质
22、二级结构中无规则卷曲、螺旋、延伸链、转 角 分 别 为 41.69%（123 AA）、27.46%（81 AA）、26.78%（79 AA）和 4.07%（12 AA），见图 2A，SPACA1 蛋白质的三级结构组成与二级结构吻合（图 2B）。SPACA1 氨基酸 N 端疏水，C 端亲水，在 10 23 AA 和 219 241 AA 位置有 2 个跨膜螺旋结构（图 2C），在 29 30 AA 处有信号肽切割位点（图 2D）。ACBD注：A.SPACA1 的二级结构；B.SPACA1 的三级结构；C.SPACA1 的跨膜螺旋结构；D.SPACA1 的信号肽区域。图 2 SPACA1 蛋白序列
23、特征分析Fig.2 Characteristic analysis of SPACA1 protein sequence2.3 多物种氨基酸序列相似性及系统进化树不 同 哺 乳 动 物 SPACA1 基 因 的 氨 基酸 序 列 多 重 比 对 发 现：BMI 与 长 须 鲸（Balaenoptera physalus KAB0403606）、水牛（Bubalus bubalis XP_025150371）、野牦牛（Bos mutus XP_005889360）、绵羊（Ovis aries XP_042109711）、山羊（Capra hircus XP_017909020）、单峰骆驼（Cam
24、elusdromedarius XP_010986010）、双峰骆驼（Camelus ferus XP_006178642）、狗（Canis lupus familiaris XP_854415）、猫（Felis catus XP_003986413）、大熊猫（Ailuropoda melanoleuca XP_002925558）、鬣狗（Hyaena hyaena XP_039088113）、大鼠（Rattus XP_032746045）、小 鼠（Mus musculus EDL05480）、人（Homo sapiens NP_112222）、猩 猩（Pan paniscus XP_0038
25、22909）、马（Equus caballus XP_001500471）的相似度均在75%以上（图3 A），说明序列较为保守。其中，猪和偶蹄目的其他动物如山羊、绵羊、水牛、牦牛及骆驼聚为一类；另外，食肉目的猫和狗、啮齿目的大鼠和小鼠、灵长目的人和大猩猩均可分别聚在一起，所有分支均符合系统分类标准。功能域分析也发现，以上 17 个物种的 SPACA1 蛋白质均含有相同的功能区域，保守性较高（图 3 B）。刘志朋，等：基于转录组测序分析 SPACA1 在版纳微型猪近交系睾丸中的表达及转录调控特征92第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报ABCapra hircusHomo sapiensMu
26、s musculusRattusOvis ariesFelis catusBos mutusPan paniscusCanis lupus familiarisCanis dromedariusCamelus ferusBubalus bubalisBalaenoptera physalusAiluropoda melanoleucaHyaena hyaenaEquus caballusEquus caballusPetent IdentityDivergence食肉目灵长目啮齿目奇蹄目偶蹄目Capra hircusHomo sapiensMus musculusRattusOvis arie
27、sFelis catusBos mutusPan paniscusCanis lupus familiarisCanis dromedariusCamelus ferusBubalus bubalisBalaenoptera physalusAiluropoda melanoleucaHyaena hyaena注：A.相似度分析；B.进化树。图 3 多物种氨基酸序列相似性及系统进化树Fig.3 The similarity of amino acid sequence and phylogenetic tree among multiple species2.4 SPACA1 蛋白互作分析蛋白
28、互作分析显示猪 SPACA1 与 ANAPC16、MAPK1IP1L、BCKDHB、SPACA4 有 较 高 的 相 关性（图 4 A），KEGG 富集分析发现这些互作蛋白主要参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解（Valine,leucine and isoleucine degradation）、泛 素 介 导的 蛋 白 水 解（Ubiquitin mediated proteolysis）、丙 酮 酸 代 谢（Pyruvate metabolism）、丙 酸 代 谢（Propanoate metabolism）、半胱氨酸和蛋氨酸代谢（Cysteine and methionine metabo
29、lism）等通路（图4 B）；GO 富集分析发现这些互作蛋白参与生殖细胞发育（Germ cell development）、精子细胞发育（Spermatid development）、精子细胞分化（Spermatid differentiation）、精子活力（Sperm motility）、顶体 囊 泡（Acrosomal vesicle）和 精 子 鞭 毛（sperm flagellum）（图 4 C），将这些互作蛋白与基因表达量数据进行匹配，依据表达量计算基因间的相关性，表达量相关性网络如图 4 D 所示，其中 SPACA1 与CCDC62、HIPK4、SPACA4、SPACA3 显著相
30、关，相关性分别为：0.997 995、0.998 024、0.998 561 和0.999 537。93第 1 期ABDCA.BMI SPACA1 互作蛋白网络；B.相关蛋白 KEGG 富集分析；C.相关蛋白 GO 富集分析；D.SPACA1 相关性弦图。线的颜色表示蛋白质之间作用的置信度，线条颜色越深表示表明蛋白与蛋白之间相互作用的置信度越高。图 4 猪 SPACA1 蛋白互作分析Fig.4 Interacting analysis of pig SPACA1 protein2.5 GO 注释和 ceRNA 调控网络ceRNA 调 控 网 络 分 析 发 现，BMI SPACA1 受到 6
31、个 miRNAs 靶 向 调 控，其 中 有 2 个 lncRNAs与 SPACA1 竞 争 性 结 合 ssc-miR-345-3p，有 3 个lncRNAs 与 SPACA1 竞 争 性 结 合 ssc-miR-185。通过对 SPACA1 的注释结果共发现 8 个 GO：在生物学过程（Biological process，BP），主要涉及顶体组装和精子发生 2 个 GO；在细胞成分（Cellular components，CC），主要涉及顶体膜、胞质囊泡、膜及膜集成组件、顶体囊泡、内顶体膜等 6 个 GO（图5）。图 5 ceRNA 调控网络Fig.5 Regulatory networ
32、k of ceRNA刘志朋，等：基于转录组测序分析 SPACA1 在版纳微型猪近交系睾丸中的表达及转录调控特征94第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报3 结论与讨论本研究通过对 BMI 成年公猪睾丸进行全转录组测序，筛选到精子发生关键基因 SPACA1；之后获得了该基因 888 bp 全长编码序列，对编码的 295 个氨基酸分析发现，SPACA1 蛋白序列 N 端为疏水性氨基酸，且在 29 30 AA 位置存在信号肽剪切位点，说明 SPACA1 具有分泌蛋白的属性。SPACA1蛋白含有 2 个跨膜螺旋结构，分别位于 10 32 AA和 219 241 AA 位置，其中信号肽切割位点位于第
33、一个跨膜螺旋结构域内。有研究利用该蛋白具有跨膜结构域、信号肽、多个疏水和亲水片段的特征，通过设计免疫多肽鉴定了 SPACA1 主要分布在精子头部的顶体腔内11，SPACA1 抗体与不孕不育病例的相关性显示 SPACA1 重组蛋白产生的抗体可以阻断体外受精12。17 个物种 SPACA1 氨基酸序列聚类分析结果显示，相似度均在 75%以上，且 BMI猪 SPACA1 氨基酸序列与偶蹄目的牛、山羊、绵羊相似度高达 85%左右，并在系统进化树中聚为一类，从图 3B 也能看出 17 个物种的 SPACA1 在信号肽区、跨膜区和低复杂度区一致性均较高，说明 SPACA1在进化上高度保守。蛋白质-蛋白质相
34、互作用（PPI）在信号转导、细胞凋亡、细胞生长和其他有助于调节细胞增殖以及组织再生的细胞事件中发挥重要作用，蛋白互作分析可为蛋白质功能预测、疾病发生机制等研究提供新方法、新途径13。本研究通过对 SPACA1 互作蛋白进行 GO、KEGG 分析发现 SPACA1 基因主要涉及精子细胞发育、精子细胞分化、精子活力、顶体组装、精子鞭毛和精子发生等过程，如顶体膜、胞质囊泡、膜、膜集成组件、顶体囊泡、内顶体膜等，说明 SPACA1 基因在精子生成和顶体反应过程中具有重要作用。相关性分析表明，SPACA1 与SPACA3、SPACA4、HIPK4 和 CCDC62 显著相关，特别 PPI、GO 和相关性
35、分析均富集到 SPACA1 与同家族成员 SPACA3 和 SPACA4 均有较强的互作。SPACA3 在人类编码 1 种顶体内精子蛋白7，它的插入、非同义替换等变异会影响人类育性14。在小鼠，SPACA3蛋白与精-卵细胞识别和结合有关15。SPACA4 是蛋白互作分析和相关性分析均能富集到与 SPACA1 相关的蛋白，它是 1 种配子特异性蛋白，主要在哺乳动物睾丸中表达，且在精卵融合过程发挥重要功能8，是精子穿透卵子外面的透明带所必需的重要精子蛋白，敲除 SPACA4 的小鼠精子不能使正常卵子受精16。HIPK4 是 1 种蛋白激酶，主要在小鼠的圆形及长形精子中发挥功能，是精子头部细胞骨架重
36、塑的重要调节因子，HIPK4 突变的精子与卵子不能正常结合，无法进行体外受精。在小鼠中，敲除 HIPK4 基因后会患少、弱、畸精子症17。CCDC62在精子发生的第一阶段存在于高尔基体中，后在伸长和成熟阶段存在于顶体中，CCDC62 是精子发生过程中细胞质去除和顶体形成所必需的调节蛋白18，CCDC62 突变小鼠的精子中段、头部和顶体会发生缺陷，导致雄性不育19。另外 PPI 分析 发 现 的 与 SPACA1 相 关 的 ACRBP、ADAD1 及DPY19L2 与精子获能、顶体反应、形态发生、精子活力以及球形精子症相关20-22。MicroRNAs（miRNAs）是 一 类 小 的 非 编
37、 码RNA，通过靶向 mRNA 在基因表达的转录后调控中发挥作用，它们是包括细胞生长、分化、发育和凋亡在内的各种细胞活动的强大调节器23，目前，miRNA 在基因转录调控方面的功能作用已成为多领域研究的热点，本研究分析发现，SPACA1 受 6 个miRNA 靶向调控，其中 ssc-miR-101 和 ssc-miR-185的研究报道相对较多。ssc-miR-101 能使处于高原缺氧条件下藏猪和大白猪心肌细胞中 VEGF 调控的靶基因表达下调24，进而调控血管生成、内皮细胞增殖，影响血管的通透性，并在缺氧适应中发挥重要作用25。也有研究发现，ssc-miR-101 能影响西班牙伊比利亚猪 眉山
38、猪 F2 群体的繁殖效率26。ssc-miR-185 可以直接靶向 CDC42 基因，在仔猪腹泻中发挥重要调控作用，过表达 miR-185 和敲除CDC42 可促进仔猪肠上皮细胞增殖27。此外 Liu等28发现，miR185 可参与免疫应答、炎症反应和谷胱甘肽代谢，且与多种癌症相关。Ma 等29发现，CCAT1/miR-185-3p/MLCK 信号通路损害肠屏障功能，并可加剧炎症性肠病的恶化。lncRNA 也是目前多领域研究的热点，其功能多样而广泛，能参与各种生物学过程，与多种疾病的发生和发展相关30，目前，只有极少数 lncRNA 的功能已阐明，绝大部分 lncRNA 的功能仍然未知。本研究
39、发现有 3 个lncRNAs 能 与 SPACA1 竞 争 性 结 合 ssc-miR-185，有 2 个 lncRNAs 能与 SPACA1 竞争性结合 ssc-miR-345-3p。综上，这些与 SPACA1 密切相关的 miRNA95第 1 期和 lncRNA 的发现为下一步 SPACA1 在 BMI 中的功能研究提供了方向。参考文献：1 Abou-Haila A,Tulsiani D R.Mammalian sperm acrosome:formation,contents,and function J.Archives of Biochemistry and Biophysics,2
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