1、第第 一一 节节 聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain ReactionCycle 25 Primer 15 Primer 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含的含量可以扩大量可以扩大100万倍以上。万倍以上。n模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2
2、+一、一、PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分二、二、PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析三、三、PCR的主要用途的主要用途四、几种重要的四、几种重要的PCR衍生技术衍生技术（一）反转录（一）反转录PCR技术技术（二）原位（二）原位PCR技术技术（三）实时（三）实时PCR技术技术（四）（四）MS-PCR技术技术实时实时PCRPCR技术原理技术原理第
3、第 二二 节节印迹技术印迹技术 （一）印迹技术（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为此称之为“blotting”，译为印迹技术。，译为印迹技术。一、分子杂交和印迹技术的原理一、分子杂交和印迹技术的原理用放射性核素、生物素或荧光染料标记其用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针探针”，探针可以与
4、固定在，探针可以与固定在NC膜上的核苷膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。（二）探针技术（二）探针技术一、分子杂交和印迹技术的原理一、分子杂交和印迹技术的原理二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹印迹(Southern Blotting)（二）（二）RNA印迹印迹(Northern Blotting)（三）蛋白质的印迹（三）蛋白质的印迹(Western Blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及
5、相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。n其他：其他：斑点印迹斑点印迹(dot blotting)原位杂交原位杂交(in situ hybridization)DNA点阵点阵(DNA array)DNA芯片技术芯片技术(DNA chip)三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较分子杂交实验分子杂交实验第第 三三 节节生物芯片技术生物芯片技术是指将许多特定的是指将许多特定的DNADNA片段有规律地紧密排列片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯
6、片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号进行检测、比较和分析，从而迅速得出定光信号进行检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。一、基因芯片一、基因芯片n基因芯片基因芯片(gene chip)(gene chip)n基因芯片工作流程示意图基因芯片工作流程示意图是是将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶
7、靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲和反应蛋白质分子间的亲和反应n蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)(protein chip)n蛋白质芯片作用原理蛋白质芯片作用原理第第 四四 节节生物大分子相互作用研究技术生物大分子相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析n常用蛋白质相互作用的研究技
8、术常用蛋白质相互作用的研究技术（一）酵母双杂交技术的基本原理和用途（一）酵母双杂交技术的基本原理和用途n酵母双杂交系统的应用酵母双杂交系统的应用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。的生物信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成基因融合成为为“诱饵诱饵”表达质粒，可以筛选表达质粒，可以筛选AD基因融合的基因融合的“猎物猎物”基因表达文库，筛
9、选未知的相互作用基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。蛋白质。（二）免疫共沉淀（二）免疫共沉淀 当细胞在非变性条件下被裂解时，依旧能够保持着完当细胞在非变性条件下被裂解时，依旧能够保持着完整细胞内存在的许多蛋白质整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用。如蛋白质间的相互作用。如果在细胞裂解液中加入感兴趣的果在细胞裂解液中加入感兴趣的A A蛋白的抗体，再加入蛋白的抗体，再加入能与抗体特异结合并与琼脂糖球珠偶联的能与抗体特异结合并与琼脂糖球珠偶联的Protein A/GProtein A/G，由于琼脂糖球珠可以通过离心沉淀下来，因而与，由于琼脂糖球珠可以通过离心沉淀下来，因而与A A蛋蛋白结
10、合的白结合的B B蛋白蛋白-A-A蛋白蛋白-抗抗A A蛋白抗体蛋白抗体-Protein A/G-Protein A/G就可就可以形成一个免疫复合物而被沉淀下来。经变性聚丙烯酰以形成一个免疫复合物而被沉淀下来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（胺凝胶电泳（SDS-PAGESDS-PAGE），复合物又被分离，然后经免），复合物又被分离，然后经免疫印迹或质谱即可检出疫印迹或质谱即可检出B B等与等与A A相互作用的蛋白。相互作用的蛋白。n免疫共沉淀免疫共沉淀荧光共振能量转移（荧光共振能量转移（fluorescence resonance fluorescence resonance energy trans
11、fer,FRETenergy transfer,FRET）是距离很近的两个荧光）是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象，当供体荧光分分子间产生的一种能量转移现象，当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在并且两个分子的距离在10nm10nm范围以内时，就会发范围以内时，就会发生一种非辐射的能量转移，即生一种非辐射的能量转移，即FRETFRET现象，使得供现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）灭），而受体发射的荧
12、光却大大增强（敏化荧光）。（三）（三）荧光共振能量转移荧光共振能量转移n荧光共振能量转移荧光共振能量转移电电 泳泳 迁迁 移移 率率 变变 动动 测测 定定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或或称称凝凝胶胶迁迁移移变变动动实实验验(gel shift assay)最最初初用用于于研研究究DNA结结合合蛋蛋白白与与相相应应DNA序序列列间间的的相相互互作作用用，可可用用于于定定性性和和定定量量分分析析，已已经经成成为为转转录录因因子子研研究究的的经经典典方方法法。目目前前这这一一技技术术也也被被用用于于研研究究RNA结结合合蛋蛋白白和和特特定定
13、RNA序列间的相互作用。序列间的相互作用。二、二、DNA-DNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定（一）电泳迁移率变动测定 放放射射自自显显影影未结合探针未结合探针结合有蛋白的探针结合有蛋白的探针标记探针标记探针1X1X1X1X1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X1X10X10X10X10X未标记探针未标记探针10X10Xn凝胶迁移实验结果示意图凝胶迁移实验结果示意图染染色色质质免免疫疫沉沉淀淀技技术术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是是目目前前可可以以研研究究体体内内DNA与与蛋蛋白白质质
14、相相互作用的主要方法。互作用的主要方法。（二）染色质免疫沉淀法（二）染色质免疫沉淀法n染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图第第 五五 节节遗传修饰动物模型的建立遗传修饰动物模型的建立及应用及应用转基因技术转基因技术采采用用基基因因转转移移技技术术使使目目的的基基因因整整合合入入受受精精卵卵细细胞胞或或胚胚胎胎干干细细胞胞，然然后后将将细细胞胞导导入入动动物物子子宫，使之发育成个体。宫，使之发育成个体。转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物(transgenic animal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物一、转基因技术一、转基因技
15、术核转移技术核转移技术 即即动动物物整整体体克克隆隆技技术术，将将动动物物体体细细胞胞核核全全部部导导入入另另一一个个体体的的去去胞胞核核的的受受精精卵卵内内，使之发育成个体，即克隆使之发育成个体，即克隆(clone)。二、核转移技术二、核转移技术基因敲除技术基因敲除技术也称基因靶向也称基因靶向(gene targeting)灭活，灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。有目的去除动物体内某种基因的技术。三、基因敲除技术三、基因敲除技术四、基因转移和基因敲除技术在医四、基因转移和基因敲除技术在医学中的应用学中的应用建立动物模型建立动物模型 单基因决定疾病模型单基因决定疾病模型 基因剔除基因剔除获得性突变获得性突变(gain-of-function mutation)多基因决定疾病模型多基因决定疾病模型
