1、中国免疫学杂志2023 年第 39 卷DNA 甲基化与类风湿关节炎发生、发展、诊断、治疗和预后关系的研究进展邓海珊 卢琳琳 刘中秋 周华（广州中医药大学国际中医药转化医学研究所，广州 510006）中图分类号 R593.22 文献标志码 A 文章编号 1000-484X（2023）08-1752-07摘要 类风湿关节炎（RA）是一种常见的慢性自身免疫性疾病。脱氧核糖核酸（DNA）甲基化是一种重要的表观遗传修饰。本文对近年DNA甲基化与RA发生、发展、诊断、治疗和预后关系研究进行了综述，发现DNA甲基化与RA的发生和发展密切相关，有希望作为RA诊断、治疗和预后的新靶点。其中，MAP3K5和LBH
2、等甲基化基因参与RA发病阶段的调控，CYP2E1 和 DUSP22 等甲基化基因调控 RA 的发展过程，SHROOM1 等甲基化基因可用于 RA 的诊断，Foxp3 和 patched 1（PTCH1）等基因甲基化水平可用于评价RA的治疗效果。此外，给药前后的整体甲基化水平改变可用于RA的预后，有利于加深RA发病机制、疾病过程在表观遗传学上的认识。关键词 类风湿关节炎；DNA甲基化；抗炎Research progress on relationship between DNA methylation and occurrence，development，diagnosis，treatment
3、and prognosis of rheumatoid arthritisDENG Haishan，LU Linlin，LIU Zhongqiu，ZHOU Hua.International Institute for Translational Chinese Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，ChinaAbstract Rheumatoid arthritis（RA）is a chronic autoimmune disease.DNA methylation is one of the i
4、mportant epigenetic modifications.This article reviewed recent research on RA and DNA methylation and summarized the relationship between DNA methylation and the occurrence，development，diagnosis，treatment and prognosis of RA.It has been reported that DNA methylation is related to the occurrence and
5、development of RA，and it is a promising target for the diagnosis，treatment and prognosis of RA.Among them，the methylation of MAP3K5 and LBH genes are involved in the regulation of the pathogenesis of RA.The methylation of CYP2E1 and DUSP22 genes regulate the development of RA.The methylation of SHRO
6、OM1 gene can be used for the diagnosis of RA.The treatment of RA can be evaluated from the methylation levels of Foxp3 and patched 1（PTCH1）genes.In addition，changes in global methylation levels before and after drugs treatment can be used for predicting the prognosis of RA.This research will give us
7、 a deepen understanding in the pathogenesis and progression of RA at epigenetics level.Key words Rheumatoid arthritis；DNA methylation；Anti-inflammation类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，在全世界的发病率约为1%1。RA可使关节发生炎症细胞浸润、滑膜细胞增生和血管增生，导致患者关节疼痛和肿胀，甚至严重残疾2-4。RA发病的危险因素包括遗传因素和环境因素，其分子机制尚不明确5。DNA甲基化是一种重
8、要的表观遗传修饰，可在不改变基因序列的情况下，改变基因的表达，从而影响机体功能6。DNA甲基化在哺乳动物中普遍存在，可影响疾病的发生发展7。近些年的研究发现，DNA甲基化与RA发生和发展密切相关，有希望应用于临床RA的诊断、治疗和预后8。本文对DNA甲基化与RA发生、发展、诊断、治疗和预后的关系进行综述，整理和归doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.08.033本文受国家自然科学基金海外及港澳学者合作研究基金延续 项目（81929003）资助。广州中医药大学第二附属医院，中医证候全国重点实验室，广州 510006。作者简介：邓海珊，女，硕士，主要从事抗炎药理学方面
9、的研究，E-mail：。通信作者及指导教师：周 华，男，博士，教授，主要从事中药心血管及抗炎免疫药理、分子生药鉴定、中药质量、创 新 药 物 研 究，E-mail：。专题综述 1752邓海珊等 DNA甲基化与类风湿关节炎发生、发展、诊断、治疗和预后关系的研究进展 第 8 期纳了一些相关的甲基化基因和位点，如：LBH、Foxp3和 cg213257234，9-10，以期为研究 DNA 甲基化对 RA的调控作用提供一定的参考。1 RA概述 RA是一种常见的慢性自身免疫性疾病，在全世界的发病率约为1%1。女性的发病率高于男性，并可发生在任何年龄阶段，高峰年龄为5060岁11。RA发病的危险因素包括遗
10、传因素和环境因素，其中具有强关联的环境因素是吸烟5，11。病理过程中会发生炎症细胞浸润、滑膜细胞增生和血管增生，可导致患者关节疼痛和肿胀，甚至严重残疾2-4。然而，RA发病的分子机制尚不明确。RA作为一种系统性疾病，没有单一症状或体征是特异性的。一般根据患者症状、家族史、危险因素评估、特异性自身抗体和影像学检查，如超声检查、核磁共振成像等进行诊断12。但RA发病常见为渐进性和隐匿性，尤其是在疾病早期，症状或体征不明显。为了改善患者的关节能力和提高患者的生活质量，提高早期诊断水平至关重要，这样才能及时展开有效的治疗。治疗RA的常见药物包括生物制剂、非甾体类抗炎药（non-steroidal an
11、ti-inflammatory drugs，NSAIDs）、缓解病情的抗风湿药（disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs）和糖皮质激素，这些药物具有一定的副作用，其中，NSAIDs作用过程中抑制环氧化酶（cyclooxygenase，COX），尤其是COX-2，会破坏前列腺素的稳态，长期应用增加心血管疾病的风险13。只有早期诊断、有效治疗才能减缓RA进程，减轻症状，改善预后，提高患者的生活质量，因此需要深入研究其发病机制和治疗药物。2 DNA甲基化 DNA甲基化在哺乳动物中普遍存在，是一种重要的表观遗传修饰7；可调控机体的生长发育，也可影响疾病
12、的发生发展，已经在癌症中得到了较广泛的研究14-15。DNA甲基化是机体在不改变基因序列的情况下，利用DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移至基因序列中特定的碱基上，从而影响基因表达的过程（图1）6。其中，哺乳动物中的DNMT1、DNMT3a和DNMT3b参与机体的DNA甲基化过程。哺乳动物的 DNA 甲基化主要发生在鸟嘌呤（Guanine，G）和胞嘧啶（Cytosine，C）含量丰富的C碱基上16。人类的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸（Cytosine-phosphate-Guanine dinucleotide，CpG）有分
13、散在基因序列中，也有聚集于CpG岛17。大多数DNA甲基化发生在CpG岛，而CpG岛大部分位于基因的启动子区8，18。启动子在基因转录过程中可特异性识别并结合RNA聚合酶19。启动子的异常DNA甲基化可影响基因转录过程，从而对基因表达产生影响16。3 DNA甲基化调控RA DNA甲基化也发生在RA中。研究RA的DNA甲基化，有助于阐明RA发生和发展过程中的机制，并有希望用于 RA 的诊断、治疗和预后8。下面对RA的DNA甲基化进行阐述（部分差异甲基化基因和位点见图2）。3.1DNA 甲基化调控 RA 的发生在 RA 非常早期，即临床上尚未明确诊断为RA的阶段，滑膜成纤维细胞（synovial
14、fibroblasts，SFs）中DNA甲基化已经发生改变，则DNA甲基化可能是RA持续发展的最初驱动因素20。这说明 DNA 甲基化可调控 RA 的发生。女性RA患者CD4+T细胞的CD40L启动子区低甲基化水平，而男性RA患者无此甲基化特征，这可Note：DNA methylation is mediated by DNA methyltransferases（DNMTs）.It transfers methyl group of S-adenosylmethionine（SAM）to 5-position of cytosine to form S-adenosylhomocystein
15、e（SAH）and 5-methylcytosine in most cases.图1DNA甲基化模式Fig.1Pattern of DNA methylationNote：Yellow arrow is hypomethylation，while the red arrow is hypermethylation.图2RA的DNA甲基化Fig.2DNA methylation in RA1753中国免疫学杂志2023 年第 39 卷能是RA发病率的性别差异原因之一21。更重要的是，女性RA患者的X性染色体上有一个低甲基化基因FRMPD4，但其与RA的关系有待研究6。有趣的是，RA的发病机制可
16、能存在关节差异，如RA患者的膝关节和髋关节的成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLSs）的甲基化存在差异，其中包括多个HOX基因，而HOX基因可调控骨骼发育和肢体形态生成22。HOX基因的差异表达，可能是源于不同的关节生物学功能的差异。这有利于解释不同关节发病的分子机制。在RA中的DNA甲基化受遗传因素和环境因素的双重影响。在遗传因素上，研究表明，RA-FLSs第3、5和7代的甲基化水平两两比较的相关性不小于0.883，证实了 RA-FLSs 甲基化特征具有遗传稳定性23。在主要组织相容性复合体区域，524个和RA密切相关的单核苷酸多态性（single
17、-nucleotide polymorphisms，SNPs）与 60 个差异甲基化位点产生联系，即基因型和差异甲基化之间存在关联24。在环境因素的研究中则表明，单卵双胞胎存在一人的抗瓜氨酸肽抗体（anti-citrullinated peptide antibodies，ACPA）为阳性，另一人的ACPA是阴性的情况；且两者存在差异甲基化区域（differentially methylated regions，DMRs）25。其中，ACPA是RA特异性自身抗体。在吸烟的影响因素中，甲基化位点cg21325723（chr6：32402555）可 介 导 SNP rs6933349（chr6：3
18、1002013）与吸烟之间的相互作用，这种相互作用可产生发展为ACPA阳性RA的风险，进一步证明了DNA甲基化受环境影响4。所以，需要加强环境因素对甲基化的研究，以减少后天环境对RA发病的影响。实验研究可首先对RA患者和对照者样本进行全基因组DNA甲基化分析。有研究确定RA患者和骨关节炎患者的 FLSs中共有 195个差异甲基化基因，有1 859个差异甲基化位点26-27。RA患者和健康对照者的外周血单个核细胞中有1 046个DNA甲基化位点28。接着，选出最显著的差异甲基化基因或位点作为深入研究的靶点。其中，差异甲基化基因 MAP3K5 和 MIR155HG 已被证明参与 RA 的发病26。
19、CHI3L1、STAT3等差异甲基化基因可能改变FLSs基因表达并参与RA的发病27。此外，PARP9基因甲基化和Jurkat细胞与从RA患者中分离出的T淋巴细胞的基因表达水平相关，而其表达水平正向调控Jurkat细胞的IL-2表达28。毫无疑问，采用这种方式可初步确定与RA关联程度较大的基因或位点。滑膜来源于 RA 患者或者模型动物的病变部位，其DNA甲基化能直接反映RA的发病机制。研究发现，与RA的发病机制有关的4个基因FCRLA、CCDC88C、APOL6和BCL11B在RA模型小鼠滑膜样本中呈现低甲基化和表达上调29。更重要的是，LBH基因可以调节RA-FLSs增殖30。LBH基因低表
20、达，会使RA-FLSs处于过度增殖状态。一个新LBH增强子，其含有与 RA 相关的 SNP rs906868和低甲基化位点（cg20495819）。SNP 和 DNA 甲基化相互作用影响增强子的功能并影响LBH表达，对FLSs的增殖产生影响10。因此，可通过对异常甲基化进行有效干预，改善滑膜组织的病理状态。研究淋巴细胞的DNA甲基化也能解释RA的发病机制。B淋巴细胞中的差异甲基化基因DHRS12、CD1C和TNFSF10与RA有关31。重要的是，在外周血单个核细胞样本中，TNFSF10在区分 RA患者和健康对照者中表现突出32。而B淋巴细胞的Ahr基因高甲基化致 Ahr表达下调，参与了 RA
21、的发病机制33。CD4+T细胞被认为是与RA高度相关的细胞类型。早期RA患者血样中初始CD4+T细胞的TNF-基因启动子区发生低甲基化34。RA患者CD4+T细胞中的 IL-8基因启动子区也存在低甲基化35。还有研究证实RA患者的CD4+T细胞中含有更多的差异甲基化基因36-37。此外，RA患者外周血单个核细胞的hMLH1启动子异常高甲基化而影响 hMLH1的表达，这与RA的发生和发展有关38。而RA组及健康对照组的全血细胞DNA相比较，RA组的c-Myc（pos 5、6）发生低甲基化而可能增加发病风险39。综上所述，与RA发病有关的甲基化研究可加深对RA发病机制的理解，并为RA的诊断、治疗和
22、预后提供有价值的线索和依据。3.2DNA甲基化调控RA的发展可通过DNA甲基化的变化了解RA的发展进程。早期RA患者与长期RA患者的T淋巴细胞和B淋巴细胞群相比较，一部分差异甲基化是两者都有的如：DUSP22、KCNJ5、MAGI2和MAML3；一部分为长期RA患者特有的如：BANF2、PSORS1C3、PCDH12 和 JRK，这可能反映了疾病进程中的差异甲基化变化40。此外，在RA-FLSs中，与早期RA相比，在细胞迁移、分化和黏附途径中，长期RA的整体DNA甲基化水平较低，这可能有助于细胞增殖、分化、迁移41。更重要的是，研究发现一些与RA发展进程有关的甲基化特征。趋化因子CXCL12的
23、CpG岛低甲1754邓海珊等 DNA甲基化与类风湿关节炎发生、发展、诊断、治疗和预后关系的研究进展 第 8 期基化而导致其表达增多，参与RA-SFs的活化，从而导致RA的持续存在42。在RA外周血中的4个免疫细胞亚群（CD19+B 细胞、CD14+单核细胞、记忆CD4+T细胞和初始 CD4+T细胞）中，CYP2E1启动子的低甲基化与RA活动性相关；DUSP22启动子的低甲基化与RA侵蚀性相关43。长期暴露于炎症环境中，IL-1可降低DNMTs表达而导致RA-FLSs DNA甲基化发生变化44。这些甲基化特征可能作为RA进展的生物标志物。3.3DNA甲基化用于RA的诊断以上关于RA的发病和进展的
24、 DNA 甲基化也可能应用于 RA 的诊断。此外，外周血单核细胞的 DNA 甲基化可判断RA活动性情况45。更重要的是，来源RA患者滑膜的FLSs中的差异甲基化CpGs在外周血样本中也检测出差异甲基化，即血液中DNA甲基化特征也可辨明疾病状态46。另有研究发现一组早期RA患者与短暂、非破坏性并已痊愈的关节炎患者的差异甲基化基因，特别是SHROOM1，其启动子的CpG岛呈现显著高甲基化20。这些差异甲基化基因具有作为RA早期诊断的生物标志物的潜在价值。3.4DNA甲基化用于RA的治疗靶点DNA甲基化不仅可以解释RA发病、发展过程的分子机制以及用于诊断，还可应用于治疗RA（抑制或激活DNA甲基化的
25、相关治疗RA的药物见表1）。Treg细胞具有维持机体免疫耐受的作用，但在RA中受到影响47。与空白组相比，胶原诱导的关节炎大鼠模型组的 Treg 细胞比例显著下降56。Foxp3 是调节 Treg 细胞功能的重要转录因子。在DNA 甲基化研究中，发现 Foxp3启动子的 DMRs调控Foxp3表达而影响Treg细胞功能9。肿瘤坏死因子受体（TNF receptor，TNFR）2通过抑制Foxp3启动子 DNA 甲基化来维持 Treg 细胞中 Foxp3 表达47。因此TNFR2可能是一个有潜力的药物靶点。此外，CTLA-4 启动子甲基化也会损害 RA 的 Treg 细胞功能，导致无法激活吲哚胺
26、 2，3-双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）通路，则抑制CTLA-4启动子甲基化以增强RA患者的IDO通路可作为一个治疗策略57。Treg 细胞与 RA 密切相关，研究 Treg细胞的DNA甲基化有助于发现有价值的治疗靶点。FLSs分离于滑膜，在RA中异常增殖。在佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠的 FLSs 中，methyl-CpG-binding protein 2（MeCP2）蛋白过表达介导 patched 1（PTCH1）基 因 发 生 高 甲 基 化，使 得PTCH1蛋白表达下调从而激活Hedgehog（Hh）信号通
27、路。敲除 MeCP2 可增加 PTCH1 表达，而应用DNA甲基化抑制剂5-aza-2-deoxycytidine后抑制了PTCH1的高甲基化，从而改善炎症48。合成的Hesperidin deriva-tive-是橙皮素衍生物，与橙皮素比，提高了生物利用度。它采用了同样的抗炎机制：抑制MeCP2的表达，下调PTCH1甲基化水平，抑制Hh信号通路53。此外，在FLSs中的MeCP2含量增加的同时，secreted frizzled related protein（SFRP）4 含量降低，其下调是 DNA 甲基化引起的。敲除MeCP2和使用5-aza-2-deoxycytidine治疗可分别增加
28、SFRP4表达49。而DNMT1直接调控SFRP2启动子甲基化，与上调的MeCP2协同，使SFRP2下调，但5-aza-2-deoxycytidine可上调SFRP2表达50。所以，联合应用 5-aza-2-deoxycytidine 和 MeCP2 可能是 一种治疗 RA 有前景的方法，而 Hesperidin deriva-tive-XIV 也有被开发的价值。编码酪氨酸磷酸酶SHP-2的PTPN11基因内含子的增强子异常甲基化，可增强 RA-FLSs 的侵袭性，而采用 SHP-2 抑制剂11a-1治疗后，降低了小鼠关节炎的严重程度，因此靶向抑制SHP-2或SHP-2通路可能是一种治疗RA的
29、策略58。毫无疑问，PTCH1、SFRP4、SFRP2 和PTPN11基因的差异甲基化特征都具有研究药物治疗RA机制的价值，但只采用动物模型，还需要进行系统研究和临床验证，以确定其应用价值。临床治疗RA的药物可影响DNA甲基化。RA患者的T淋巴细胞和单核细胞中发生DNA低甲基化以及 DNMT1 低表达；甲氨蝶呤（methotrexate）是一种常用的 DMARDs，治疗后的 RA 患者的甲基化水平恢复至与健康对照组的一致，DNMT1表达也有表1抑制/激活DNA甲基化的RA治疗药物/物质Tab.1Drugs/substances inhibit/activate DNA methylation
30、in RA treatmentDrugsTNF receptor 25-aza-2-deoxycytidine（Decitabine）Methotrexate1，25（OH）2D3 and vitamin D receptorHesperidin derivative-XIVWenhua Juanbi RecipeDNA methylation effectDNA methyltransferase inhibitorDNA methyltransferase inhibitorDNA methyltransferase activatorDNA methyltransferase activ
31、atorDNA methyltransferase inhibitorDNA methyltransferase activatorReference4748-5051525354-551755中国免疫学杂志2023 年第 39 卷升高的趋势 51。研究还发现，甲氨蝶呤治疗4周后检测出4个CpGs（cg23700278、cg27427581、cg04334751和 cg26764200）与 RA 的改善相关59；因此，甲氨蝶呤对RA患者的DNA甲基化影响不可忽视，这可能与其疗效有关。此外，本课题组研究发现青藤碱可以特异性地抑制微粒体前列腺素E2合成酶（microsomal prostaglan
32、din E synthase，mPGES）-1 表达，从而抑制炎症性PGE2的生成，发挥抗炎和抗关节炎的作用，且无心脑血管不良反应，这与其选择性诱导mPGES-1基因启动子甲基化有关60。温化蠲痹方（Wenhua Juanbi Recipe）为治疗 RA的验方，可上调胶原诱导的关节炎大鼠和RA患者的外周血单个核细胞的 DNMTs表达，恢复 DNA甲基化水平而达到治疗RA目的54-55。令人惊喜的是，非用于治疗RA的药物也可改善异常甲基化。例如，类固醇激素1，25（OH）2D3和 vitamin D receptor 可通过促进 CD70、CD40L和CD11a甲基化和抑制PKC/ERK通路而抑
33、制CD4+T细胞功能，从而缓解RA的免疫反应52。调控异常甲基化的药物有望更精准地用于治疗 RA患者。3.5DNA甲基化用于RA的预后与健康对照者相比，RA患者的外周血单个核细胞的整体低甲基化水平。使用甲氨蝶呤、sarilumab和Janus kinase抑制剂等治疗成功后，大多数RA患者的甲基化水平升高，提示整体甲基化程度可用于疾病治疗结果的预测61。此外，用依那西普治疗3个月时表现良好或无反应的患者存在差异甲基化，使用甲氨蝶呤后的反应良好和反应不良者也存在差异甲基化59，62。所以，差异甲基化可作为依那西普、甲氨蝶呤等药物治疗RA后反应的潜在生物标志物。4 RA甲基化研究的挑战与机遇 本文
34、对 DNA 甲基化调控 RA 的发生、发展、诊断、治疗和预后做了一定的总结和归纳。甲基化基因 MAP3K5、FRMPD4、FCRLA、LBH、TNF-、Ahr、hMLH1和甲基化位点cg21325723、cg20495819参与RA 发 病 的 调 控4，6，10，26，29，33-34，38。甲 基 化 基 因CYP2E1、DUSP22 和 CXCL12 调 控 RA 进 程42-43。SHROOM1 基因的甲基化可用于 RA 的诊断20。Foxp3、CTLA-4、SFRP2和patched 1（PTCH1）基因的甲基化水平可评估RA治疗效果9，48，50，57。此外，药物治疗前后整体甲基化
35、水平的变化可用于 RA 的预后。虽然现有研究取得一些进展，但还有很多未知需要探索和研究，同时存在一些待解决的问题。例如，RA的DNA甲基化研究中确定了一些与RA有关的差异甲基化特征，但这些差异甲基化特征大多数缺乏实验动物和临床病例的验证。需要采用大样本和多种实验方法进行验证，以得出更为可靠的结论。更重要的是，应加强差异甲基化特征与RA之间关系的研究，探讨RA的DNA甲基化变化的诱因和机制，并将所识别的差异甲基化特征应用于临床。在样本来源上，大多数研究的临床样本集中在血液和滑膜组织，也有学者提出滑膜液也和滑膜组织一样有研究的价值26。但滑膜一般需要通过关节手术才能从RA患者中获得，这给研究带来困
36、难。因此扩大以及采用微创、便捷的样本来源至关重要。此外，目前研究针对RA的DNA甲基化相关的药物和方法较缺乏。所以，研究和开发有效、低副作用的药物和方法是治疗RA的当务之急，以探索多样性和个性化的治疗途径。参考文献：1 ONEIL L J，BARRERA-VARGAS A，SANDOVAL-HEGLUND D，et al.Neutrophil-mediated carbamylation promotes articular damage in rheumatoid arthritisJ.Sci Adv，2020，6（44）：eabd2688.DOI：10.1126/sciadv.abd268
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