1、中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY第 32 卷第 3 期2023 年 6 月Vol.32.No.3June.2023收稿日期2022-09-14 修回日期2023-06-05作者简介锅红芬，女（1981年），汉族，本科，主治医师*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：Col5A2 促进非小细胞肺癌细胞的增殖迁移侵袭并增强 PI3K/AKT 信号活性锅红芬*，齐文秀，宋英，安琪（保定市第二中心医院病理科，保定 07275
2、0）摘要目的 探讨型胶原 2（collagen type V 2,Col5A2）蛋白在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中的表达、作用及其机制。方法 免疫组织化学检测人 NSCLC 组织中 Col5A2 表达，分析 Col5A2 表达与临床参数的关系。sh-Col5A2 转染 A549 细胞敲低 Col5A2 表达，CCK-8 法检测细胞增殖，集落形成实验检测细胞集落形成能力，Transwell 法检测细胞迁移和侵袭，测量敲低 Col5A2 的 A549 细胞在裸鼠体内生长，Western blot 和免疫组织化学染色分析 PI3K/AKT 信号活
3、性。结果 Col5A2 在 NSCLC 组织高表达，且 Col5A2 阳性表达与临床分期和淋巴结转移正相关。敲低 Col5A2 在体外抑制 A549 细胞增殖、迁移和侵袭，在体内抑制荷瘤生长，降低 p-PI3K 及 p-AKT 水平。结论 Col5A2 可能通过激活 PI3K/AKT信号同路通促进 NSCLC 进展和转移。关键词V 型胶原 2；非小细胞肺癌；增殖；迁移；侵袭；PI3K/AKT 信号通路中图分类号R365 文献标识码A DOI：10.16705/ki.1004-1850.2023.03.003Col5A2 promotes the proliferation,migration
4、and invasion of NSCLC cells and increases PI3K/AKT signaling activityGuo Hongfen*,Qi Wenxiu,Song Ying,An Qi(Department of Pathology,Baoding Second Central Hospital,Baoding 072750,China)AbstractObjective To investigate the expression,role and potential mechanism of collagen type V 2(Col5A2)protein in
5、 non-small cell lung cancer(NSCLC).Methods The expression of Col5A2 protein in human NSCLC tissues was detected by immu-nohistochemistry,and the relationship between Col5A2 protein expression and clinical parameters was analyzed.A549 cells were transfected with sh-Col5A2,cell proliferation was detec
6、ted by CCK-8 assay,colony formation ability was detected by colony formation assay,cell migration and invasion were detected by Transwell assay,the growth of A549 cells with Col5A2 knockdown was measured in tumor-bearing nude mice,and the PI3K/AKT signaling activity was analyzed by Western blot and
7、immunohistochemical staining.Results Col5A2 protein expression was increased in NSCLC tissues,and Col5A2 positive expression was positively correlated with clinical stage and lymph node metastasis.Knockdown of Col5A2 inhibited the proliferation,migration and invasion of A549 cells in vitro,and inhib
8、ited the tumor-bearing growth in vivo.Knockdown of Col5A2 could reduce the expression of p-PI3K and p-Akt.Con-clusion Col5A2 may promote the progression and metastasis of NSCLC by activating PI3K/AKT signaling.KeywordsCollagen type V 2;non-small cell lung cancer;proliferation;migration;invasion;PI3K
9、/AKT signaling pathway发生远端转移的 NSCLC 患者 5 年总体生存率低于5%4-5。造成 NSCLC 患者低生存率的最终主要原因为肿瘤的转移与恶性增殖6。因此，需继续深入研究 NSCLC 转移与恶性增殖的机制。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，在众多的生物过程中有重要的作用，如细胞增殖、迁移、分化和凋亡，在通常情况下，胶原蛋白通过不同的a链形成三聚体7。V 型胶原蛋白a2 链（collagen type V a2，COl5A2）在结直肠癌、胃癌和前列腺癌组织中高表达，是肿瘤进展转移与不良预后的生物标记物8-11。近来研究显示COl5A2也可作为肺腺癌预后的独肺癌的发病率
10、和死亡率均占所有类型肿瘤的首位，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占所有类型肺癌发病率的 85%1。尽管过去十多年来 NSCLC 的治疗药物和干预手段得到很大发展，对 NSCLC 患者带来生存益处，但 NSCLC的 5 年总体生存率仅为 15.7%17.4%2-3，特别是中国组织化学与细胞化学杂志246第 32 卷立生物标志物12。但关于 COl5A2 在 NSCLC 中的作用及其机制，目前尚不完全清楚。李萍等13人通过KEGG富集分析方法得出PI3K/AKT和AMPK激酶信号通路可能是 Col5A2 发挥促迁移和侵袭的主要信号通路。前期大量研
11、究显示 PI3K/AKT 信号通路中关键蛋白 p-PI3K 和 p-AKT 在 NSCLC 组织中表达上调，且此信号激活可促进NSCLC进展与转移14-15。本实验中，我们研究 COl5A2 表达与 NSCLC 的临床病理参数的关系，并用细胞和动物模型分析敲低其表达对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及与PI3K/AKT 通路活性的关系。材料和方法1 试剂、细胞与动物胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司），DMEM 培养基（美国 Gibco 公司），兔抗 Col5A2、蛋白激酶 B（protein kinase B,PKB/AKT）、磷酸化AKT（phosphorylated AKT,pAKT）
12、、磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）和 p-PI3K单克隆抗体（南京巴傲得生物科技有限公司），兔抗GAPDH 单克隆抗体、HRP-羊抗兔 IgG、ECL 化学发光液和兔SP免疫组化试剂盒（北京索来科技有限责任公司），Col5A2 的 shRNA 质粒（sh-Col5A2）和对照载体质粒 sh-NC（美国 Santa Cruz 公司），Lipofectamine 3000（美国 Invitrogen 公司），CCK-8细胞计数试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），Transwell 板（美国 Corning 公司），基质胶（美国BD 公司
13、），肺癌细胞 A549（中国科学院上海库），BALB/c 裸鼠（6 周龄、雄性、SPF 级，北京华阜康生物科技股份有限公司）。2 患者组织取样收集 60 例行手术切除的 NSCLC 患者的肿瘤组织和癌旁非肿瘤组织及临床特征信息。将所有组织样品用 10%福尔马林固定后，行石蜡包埋和切片。3 细胞培养与转染A549 细胞培养在加 10%血清的 DMEM 培养基中，细胞培养箱温度为 37。待细胞处理对数生长期时，收集细胞并按 1105/mL 的密度接种于 6 孔板。次日，用无血清培养基处理 6 h 后，按照转染说明书方法，用 Lipofectamine 3000 转染试剂将 sh-Col5A2 和s
14、h-NC 分别转入 A549 细胞，shRNAs 的终浓度为10 nmol/L，转染时间为 48 h，用 Western blot 鉴定转染效果。4 细胞活力的 CCK-8 分析分别将sh-Col5A2和sh-NC转染的细胞（均5000个/mL）接种于 96 孔板，继续培养14 d。按照试剂盒方法，分别加入 10 L CCK-8 试剂并孵育2 h，酶标仪（DNM-9602G 型，北京普朗新技术有限公司）检测450 nm处光密度（OD）值，并计算相对于shNC组的细胞活力。相对细胞活力=ODsh-Col5A2/ODsh-NC100%。5 集落形成实验分 别 将 sh-Col5A2 和 sh-NC
15、 转 染 的 细 胞（均500/mL）接种于 24 孔板，然后继续培养 2 周。加入 10 L 10%甲醇固定细胞2 min，0.1%结晶紫染色30 min，计数集落数量。6 迁移与侵袭能力 Transwell 分析将 Transwell 板上的膜用基底胶（60 mg/孔）包被（检测侵袭）或不包被（检测迁移）后，将 5000个细胞（100 L PBS 配置的细胞悬浮液）加入上室，下室加入 600 L 含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基作为化学引诱物，在 37 和 5 CO2下培养 24 h。用棉签擦除膜上表面的细胞，10%甲醇固定迁入至膜下表面的细胞2 min，用0.1%结晶紫染色30 m
16、in，显微镜下计数迁移和侵袭细胞。7 Western blot细胞用 RIPA 裂解液在冰上裂解 30 min，刮取裂解物并将其在 4 下用离心机以 12 000 r/m 离心20 min，收集蛋白上清液。用 BCA 法将蛋白上清液样品测定蛋白浓度后，分别取 15 g 蛋白按照常规Western blot 步骤行凝胶转印。用 5%脱脂奶封闭膜上蛋白 30 min，按1:2000 的比例孵育抗体（Col5A2、p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K 和 GAPDH），4 C 过夜。以TBST 洗涤后，室温孵育 HRP 标记羊抗兔 II 抗（1:2000）1 h。TBST 洗涤后利用化学发光成
17、像仪显影，并以相对光密度值对蛋白相对表达量进行评估。8 裸鼠荷瘤实验分别将 sh-Col5A2 和 sh-NC 转染的细胞接种至BALB/c 裸鼠皮下（每只小鼠按照 5106/100 L PBS注射），注射后 3 天肉眼可见瘤体（约 50 mm3）记为 Day 0，此后用游标卡尺每周测量瘤体大小（瘤体体积=长径 短径2/2）。锅红芬等.Col5A2 促进非小细胞肺癌细胞的增殖迁移侵袭并增强 PI3K/AKT 信号活性第 3 期 2479 免疫组织化学染色将临床样本组织以及裸鼠瘤体组织行石蜡包埋、切片（4 m 厚）。将切片按照常规程序脱蜡、入水、抗原修复以及 0.3%H2O2封闭内源性过氧化物酶
18、后，加第一抗体（p-AKT 和 p-PI3K；1:200 稀释）37 孵育 45 min；PBS 洗 3 次；按照 SP 试剂盒说明书，依次加生物素标记羊抗兔二抗（1:200 稀释）37 孵育 20 min，PBS 洗 3 次，HRP 标记链霉卵白素工作液 37 孵育 20 min，PBS 洗 3 次；DAB 显色后苏木素染核，并冲洗返蓝，脱水、透明和封固。10 统计学方法用 Graphpad Prism 软件对实验数据进行统计学分析。计数资料采用2检验，两组定量资料采用双侧t 检验，多组定量资料的比较采用方差分析。P0.05时，差异被认为具有统计学意义。结 果1 Col5A2 在 NSCLC
19、 组织中高表达并与 NSCLC 进展以及转移正相关免疫组织化学染色显示，癌旁非肿瘤组织中Col5A2 均阴性，NSCLC 组织中 Col5A2 阳性表达率为 81.67%（49/60），阴性表达率为 18.33%（11/60）（图 1 和表 1）。对 Col5A2 表达水平与 NSCLC 临床病理特征的相关性分析显示（表 1），Col5A2 表达与患者年龄、性别、吸烟与否、组织学分型以及组织学分级无关，但与临床分期和淋巴结转移有关，临床分期 III 期或淋巴结转移者 Col5A2 阳性比例增高。2 敲低 Col5A2 抑制 A549 细胞增殖迁移侵袭转染 sh-Col5A2 敲低 Col5A2
20、 表达后（图 2A、B），A549 细胞活性明显降低（图 2C），集落形成数明显减少（图 2D、E），迁移力（图 2F、G）和侵袭力（图 2H、J）明显降低。3 敲低 Col5A1 抑制 PI3K/AKT 信号活性Western blot检测显示，与转染sh-NC的A549细胞相比，转染 sh-Col5A2 的 A549 细胞中 p-PI3K（图3A、B）和 p-AKT（图 3C、D）水平显著降低，由此表明 Col5A2 具有增强 PI3K/AKT 信号活性。4 敲低Col5A2抑制A549细胞荷瘤生长和瘤体组织中 PI3K/AKT 信号活性分别在小鼠皮下注射转染了 sh-NC 或 sh-Co
21、-l5A2 的 A549 细胞，每周测量瘤体体积，发现敲低了 Col5A2 的 A549 细胞形成的移植瘤体积在注射后 2 周时明显小于未敲低 Col5A2 的对照 A549 细胞形成的移植瘤，第 3 周和第 4 周时差异更为明显（图 4A、B）。对瘤体组织进行免疫组织化学染色显示，对照 A549 细胞形成的移植瘤组织中 p-PI3K和 p-AKT 阳性染色范围广且染色强度高，而转染sh-Col5A2 的 A549 细胞形成的移植瘤组织中偶见 p-PI3K 和 p-AKT 阳性染色，且染色强度低，甚至部分视野未见阳性染色，提示敲低Col5A2能抑制瘤体内PI3K/AKT 信号活性。讨 论肺癌是
22、我国第一高发也是第一致死的恶性肿表 1 Col5A2 表达与 NSCLC 临床病理特征的关系Tab.1 The association between the expression of Col5A2 and clinicopathological characteristics of NSCLCCharacteristicsCol5A2 expressionP valueNegativePositiveAge(years)0.8275531555834Gender0.867Male939Female210Smoking status0.786Smoker729Non-smoker420His
23、tological type0.975Adenocarcinoma627Squamous cell carcinoma522Clinical stages0.041Stage I+II819Stage III330Lymph node metastasis0.028Yes435No714Histological grades0.974Well and moderate731Poor418中国组织化学与细胞化学杂志248第 32 卷瘤，且发病率还呈逐年增加趋势1。虽然早期肺癌可通过手术治疗达到长期生存的效果，但约2/3的患者被发现时已是晚期2-3。此时，有手术机会的晚期肺癌多采用手术+同步放化疗
24、的策略，但由于化疗耐药以及放疗抵抗的因素，造成患者的 5 年生存率依然很低2-5。小分子酪氨酸激酶抑制剂和免疫治疗的应用给肺癌患者带来了的生存益处但其并未见明显延长患者的生存时间4-5。造成上述现象的最终原因还是肺癌的转移以及继发性肿瘤的恶性增殖，因此探索肺癌恶性增殖以及转移机制以及其寻找其关键靶点是当前肺癌研究的重中之重。肿瘤的浸润与转移受到细胞外基质的调节。已有研究通过生物信息学研究表示 Col5A2 能与细胞外基质受体交联并促进肿瘤细胞粘附于细胞外基质16，此外研究显示Col5A2能增强肿瘤细胞的运动能力17。另外，先前的众多研究均已发现Col5A2在结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌和胃癌等多种
25、恶性肿瘤中阳性表达且与肿瘤分期、浸润深度和淋巴结转移图 1 NSCLC 组织和非癌性肺组织中 Col5A2 表达的免疫组化法检测。A，癌旁非癌性肺组织 Col5A2 阴性；B 和 C，肺鳞状细胞癌组织中Col5A2 阴性（B）和阳性（C）；D 和 E，肺腺癌组织中 Col5A2 阴性（D）和阳性（E）；比例尺，50 mFig.1 Immunohistochemical examination for expression of Col5A2 in NSCLC and non-cancerous lung tissues.A,Col5A2 negative in non-cancerous lu
26、ng tissue adjacent to the cancer;B and C,Col5A2 negative(B)and positive(C)in lung squamous cell carcinoma tissues;negative(B)and positive(C)expression of Col5A2 in lung squamous cell carcinoma tissues;D and E,Col5A2 negative(D)and positive(E)in lung adenocarcinoma tissues;scale bar,50 m锅红芬等.Col5A2 促
27、进非小细胞肺癌细胞的增殖迁移侵袭并增强 PI3K/AKT 信号活性第 3 期 249图 2 敲低 Col5A2 对 A549 细胞的增殖、迁移和侵袭的影响。A 和 B，sh-Col5A2 干扰效果鉴定的代表性 Western blot 检测（A）和定量分析（B）；C，Col5A2 基因敲除对细胞活性影响的 CCK-8 法检测；D 和 E，敲低 Col5A2 对细胞增殖影响的代表性集落形成实验检测（D）和定量分析（E）；FJ，敲低 Col5A2 对细胞迁移（F 和 G）和侵袭（H 和 J）影响的代表性 Transwell 分析与统计学分析。与 sh-NC 组比较：*P0.05；n=3。D，比例尺
28、=4.5 mm；F 和 H，比例尺=100 mFig.2 Effect of knockdown of Col5A2 on the proliferation,migration and invasion of A549 cells.A and B,representative Western blot assay(A)and quantitation for identification(B)of interference effect of sh-Col5A2;C,CCK-8 assay for the effect of Col5A2 knockdown on cell viabilit
29、y;D and E,representative clone formation assay(D)and quantitation(E)for the effect of Col5A2 knockdown on clone formation ability;F to J,representative Transwell assay and statistical analysis for the effect of Col5A2 knockdown on migration(F and G)and invasion(H and J);*P0.05 vs sh-NC group;n=3.D,s
30、cale bar,4.5 mm;F and H,scale bar,100 m有关8-11,18-20。但关于 Col5A2 在 NSCLC 中的作用，目前的研究还不是很清楚。本次研究表明Col5A2在人NSCLC样本中阳性表达，且其与肿瘤临床分期和淋巴结转移有关，提示Col5A2可能对肺癌的发展和转移起到了促进作用；通过基因沉默技术证明了敲低 Col5A2 表达可抑制 NSCLC 细胞 A549 的增殖、迁移和侵袭。本研究进一步探讨了敲低 Col5A2 抑制 A549的增殖、迁移和侵袭的机制。已有研究通过 KEGG富集分析方法发现 Col5A2 主要富集于 PI3K/AKT和 AMPK 激酶
31、方向13。PI3K/AKT 为 NSCLC 进展与转移的关键信号之一14-15。p-PI3K 和 p-AKT 为中国组织化学与细胞化学杂志250第 32 卷参考文献1 Skikov J,Kadlec B,Venclek O,et al.Lung cancer J.Cas Lek Cesk,2018,157(5):226-236.2 Garca-Campelo R,Bernab R,Cobo M,et al.SEOM clini-cal guidelines for the treatment of non-small cell lung cancer(NSCLC)2015 J.Clin Tra
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35、AKT 水平影响的代表性 Western blot 检测（C）和定量分析（D）；与 sh-NC 组比较，*P0.05；n=3Fig.3.Effect of knockdown of Col5A2 on activity of PI3K/AKT signaling.A and B,representative Western blot(A)and quantitative analysis(B)for the effect of knockdown of Col5A2 on p-PI3K level;C and D,representative Western blot(C)and quanti
36、tative analysis(D)for the effect of knockdown of Col5A2 on p-AKT level;*P0.05 vs sh-NC group;n=3PI3K/AKT 信号通路中关键蛋白，它们在人 NSCLC组织样本中高表达14。PI3K/AKT信号激动剂能增强NSCLC 细胞株增殖、迁移与侵袭，反之 PI3K/AKT信号抑制剂能抑制 NSCLC 细胞株增殖、迁移与侵袭15。因此，本研究在 sh-Col5A2 转染的 A549 细胞中检测 p-PI3K 和 p-AKT 的表达，结果显示敲低Col5A2能抑制p-PI3K和p-AKT的表达，证明了敲低Co
37、l5A2 能抑制 PI3K/AKT 活性。对 A549 细胞裸鼠移植瘤组织中 p-PI3K 和 p-AKT 表达的免疫组织化学检测也证明敲低Col5A2能抑制PI3K/AKT活性。因此，Col5A2 是促进 NSCLC 进展与转移的关键分子之一，Col5A2 可能通过增强 PI3K/AKT 活性促进 NSCLC 细胞增殖、迁移和侵袭，Col5A2 是NSCLC 检测和治疗的潜在靶点。锅红芬等.Col5A2 促进非小细胞肺癌细胞的增殖迁移侵袭并增强 PI3K/AKT 信号活性第 3 期 2517 Gupta AA,Kheur S,Palaskar SJ,et al.Deciphering the
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39、影响。A，敲低 Col5A2 对 A549 细胞裸鼠移植瘤生长影响的定量分析；*P0.05，n=6。B，皮下接种稳转 sh-NC 或 sh-Col5A2 的 A549 细胞的荷瘤小鼠的第 4 周瘤体大小肉眼观；C，敲低 Col5A1 对 A549 细胞裸鼠移植瘤组织中 PI3K/AKT 信号活性影响的代表性免疫组织化学检测；比例尺，100 mFig.4 Effect of knocking down Col5A2 on the growth of A549 cells transplanted in nude mice and the PI3K/AKT signaling activity i
40、n the tissues of A549 cell transplantation tumor in nude mice.A,quantitative analysis of the effect of knocking down Col5A2 on the growth of A549 cell xenograft tu-mors in nude mice;*P0.05，n=6.B,macroscopic observation of tumor size at week 4 in tumor bearing mice subcutaneously inoculated with A549
41、 cells stably transfected with sh-NC or sh-Col5A2.C,representative immunohistochemical detection of the effect of knocking down Col5A2 on PI3K/AKT signaling activity in A549 cell xenograft tumor tissue in nude mice;scale bar,100 m中国组织化学与细胞化学杂志252第 32 卷2021,14:2991-3002.9 Ding YL,Sun SF,Zhao GL.COL5A
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