眼源性蜡样芽孢杆菌溶血素BL基因及其体外生物活性检测.pdf

温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院 眼源性蜡样芽孢杆菌溶血素BL基因眼源性蜡样芽孢杆菌溶血素BL基因 及其体外生物活性检测及其体外生物活性检测 温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院 背景、目的和意义背景、目的和意义 结果结果 结论结论 内容内容 内容和技术路线内容和技术路线 温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院 蜡样芽孢杆菌( Bacillus cereus ) 污染菌？ 食物中毒？ 院内感染？ 眼内炎？ 极为严重，如果处 理不及时或不恰当 后果很可能是完全 丧失视力甚至是摘 除眼球。 外伤所致的细菌性眼内炎中 蜡样芽孢杆菌感染率仅次于 金黄色葡萄球菌，位居第二 研究背景、目的、意义研究背景、目的、意义 温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院 我们另一个研究的结果 观察24例患者，发现其中： 10例眼球摘除，病程进展非常快、临床表现最重、 预后最差， 10例行部分玻璃体切除术，最终视力为光感， 4例发病时间长、临床表现轻、预后最好，行异物 取出术或部分玻璃体切除术，预后视力为0.05，0.1， 0.5（2例） 温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院 进展迅速、急骤恶化（12h-48h） 眼组织呈咖啡样溶血状或前房可见咖啡样积脓 视网膜毁灭性损害 其他：明显肿胀、疼痛、角膜环形浸润及高热、白细胞增多 蜡样芽胞杆菌感染性眼内炎 温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院 温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院 温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院 温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院 致病机理 溶血素（HBL） 非溶血素（NHE） 磷脂酶C（PLC） 细胞毒素K（CytK） 其他毒力因子 咖啡样溶解物咖啡样溶解物？ 前房积脓？ 组织溶解？ 细胞坏死？ 免疫反应？ 温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院 蜡样芽胞杆菌溶血素HBL DOUGLAS J. BEECHER 等人通过体外实验，发现HBL可导致兔子视网 膜组织高度坏死。 HBL（成孔毒素 /肠毒素） 溶血亚 基L1 结合亚 基 溶血亚 基L2 温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院 已有研究表明，并非所有的蜡样芽胞杆 菌都表达这三种基因，且编码HBL的三种亚基 的基因即使存在，也不一定全部表达B、L1以 及L2。因此本研究中，我们对经API细菌鉴定 条所证实的眼源性蜡样芽胞杆菌的HBL进行基 因鉴定并提取HBL后进行毒理性实验。 温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院 研究内容和技术路线研究内容和技术路线 传统生物学鉴定 HBL基因鉴定 传统生物学鉴定 HBL基因鉴定 溶血素BL的提取、纯化与鉴定溶血素BL的提取、纯化与鉴定 API 20E API 50CHB 鉴定板条鉴定板条 PCR、凝胶电泳及测序、凝胶电泳及测序 盐析、阴离子交换柱提取盐析、阴离子交换柱提取HBL，， SDS-PAGE凝胶电泳鉴定凝胶电泳鉴定 利用三种细胞（绵羊红细胞、利用三种细胞（绵羊红细胞、 Vero细胞、细胞、Hela细胞）毒性试验、细胞）毒性试验、 小鼠致死实验小鼠致死实验 评估评估HBL毒力毒力 溶血素BL的毒性鉴定溶血素BL的毒性鉴定 温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院 结果结果 5株临床分离的蜡样芽孢杆菌，其编码HBL 的hblA、hblC、hblD 三个基因的扩增产物 分别为320、430和750 bp左右，扩增产物 经测序，确为蜡样芽孢杆菌相关基因片段。 蜡样芽孢杆菌溶血素BL溶血活性检测结果 表明，其溶血活性呈现明显的时间－剂量 依赖性。 温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院 97.2 66.4 KDa M 1 2 3 4 5 6 44.3 29.0 20.1 14.3 43.5KDa 38.2KDa 37.5KDa M12345 1000bp→ 700bp→ 500bp→ 400bp→ 300bp→ 200bp→ 100bp→ M12345 1000bp→ 700bp→ 500bp→ 400bp→ 300bp→ 200bp→ 100bp→ M12345 1000bp→ 700bp→ 500bp→ 400bp→ 300bp→ 200bp→ 100bp→ 温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院 PBS阴性对照PBS阴性对照 0.25HU/mlHBL 0.5HU/mlHBL 1HU/mlHBL 2HU/mlHBL 3HU/mlHBL HBL的溶血活性分析HBL的溶血活性分析 温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院 • 2.0 HU/ml浓度以上的溶血素BL对小鼠的 致死率为100%（5/5），1.0 HU/ml浓度 的致死率为60%（3/5），而低于1.0 HU/ml浓度以及生理盐水对照组的致死率 为0%（0/5），其致死率呈明显的剂量依 赖性。 温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院 溶血素BL浓度 （ HU/ml） 溶血素注射量 (µl) 小鼠（只） 致死率（%） 33005100（5/5） 23005100（5/5） 1300560（3/5） 0.530050（0/5） 0.2530050（0/5） 对照组（0.9%生理 盐水） 30050（0/5） 表6溶血素BL蛋白对小鼠的致死性 温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院 结论结论 临床分离的眼源性蜡样芽胞杆菌中编码HBL三种亚 基的基因均存在，且全部表达B、L1、L2三个片段。对 提取的溶血素进行体外活性试验，表明其具有较强的溶 血活性，较低浓度即可导致细胞及小鼠死亡。为眼部感 染该菌后病情发展迅速、预后较差的实际提供了理论依 据，同时为该病快速诊断和分子流行病学调查提供了新 的思路。 温州医科大学附属眼视光医院 浙江省眼科医院