1、天 津 中 医 药 23年11月第40卷第11期Nov.23,40 11冬凌草甲素联合免疫因子TRAF4对非小细胞肺癌细胞自噬和凋亡的影响及机制研究罗帅，陈勇（上海健康医学院附属崇明中心医院，上海202150）摘要：目的探讨冬凌草甲素联合免疫因子肿瘤坏死因子受体相关因子4（TRAF4）对非小细胞肺癌细胞自噬和凋亡的影响及机制研究。方法选择不同浓度的冬凌草甲素处理A549细胞，然后采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞的活力。体外培养A549细胞，将细胞分为对照组、冬凌草甲素组、si-NC组（转染si-NC）、si-TRAF4组（转染si-TRAF4）、冬凌草甲素+pcDNA组（转染pcDNA后，选择冬
2、凌草甲素浓度为20 mol/L处理）、冬凌草甲素+TRAF4组（转染TRAF4后，选择冬凌草甲素浓度为20 mol/L处理）。采用流式细胞术检测细胞凋亡；蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、微管相关蛋白1的轻链3（LC3）、/LC3、Beclin 1、自噬相关蛋白7（ATG7）和TRAF4蛋白表达；实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测TRAF4 mRNA表达量。结果不同浓度冬凌草甲素明显抑制细胞活力。冬凌草甲素组细胞凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3/LC3、ATG7蛋白表达明显高于对照组；TRAF4 m
3、RNA和蛋白表达、Bcl-2蛋白表达明显低于对照组。si-TRAF4组TRAF4 mRNA和蛋白表达、Bcl-2蛋白表达明显低于si-NC组；细胞凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3/LC3和ATG7蛋白表达明显高于si-NC组。冬凌草甲素+TRAF4组TRAF4 mRNA和蛋白表达、Bcl-2蛋白表达明显高于冬凌草甲素+pcDNA组；细胞凋亡率、Bax、Beclin1、LC3/LC3和ATG7蛋白表达明显低于冬凌草甲素+pcDNA组。结论冬凌草甲素通过下调TRAF4的表达抑制非小细胞肺癌细胞的凋亡和自噬。关键词：冬凌草甲素；TRAF4；非小细胞肺癌；自噬；凋亡中图分类号：R734.2文献
4、标志码：A文章编号：1672-1519（2023）11-1484-06DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2023.11.21作者简介：罗帅（1988-），男，住院医师，从事呼吸科临床诊疗工作。通讯作者：陈勇，E-mail：。引用格式：罗帅，陈勇.冬凌草甲素联合免疫因子TRAF4对非小细胞肺癌细胞自噬和凋亡的影响及机制研究J.天津中医药，2023，40(11)：1484-1489.根据病理表现可以将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌占肺癌全部的80%85%1。虽然医学上已经取得了进步，但是非小细胞肺癌的复发转移仍是当前其治疗的难点2-3。冬凌草又称为冰凌
5、草，性微寒，甘微苦，常用于治疗咽喉肿痛、蛇虫咬伤和扁桃体炎等疾病4，具有多种化学活性，如冬凌草甲素具有明显的抗肿瘤效果5。有研究结果显示，冬凌草甲素抑制肺癌细胞A549的增殖6，促进肺癌细胞的自噬小体的产生，并诱导细胞凋亡7。肿瘤坏死因子受体相关因子4（TRAF4）位于染色体17q11-12上，与肿瘤坏死受体家族信号转导密切相关8。有研究发现，miR-370通过靶向负调控TRAF4抑制肺癌细胞的增殖和促进细胞的凋亡9。但是关于冬凌草甲素是否能够联合TRAF4影响非小细胞肺癌的研究尚不明确，因此，本研究通过体外培养A549细胞，探讨冬凌草甲素联合TRAF4对细胞自噬和凋亡的影响。1材料与方法1.
6、1细胞和主要试剂A549细胞购自美国ATCC公司；冬凌草甲素购于成都普菲德公司；DMEM培养基和胎牛血清购于Hyclone公司；噻唑蓝（MTT）试剂盒购于北京索莱宝公司；Lipofectamine 2000试剂 盒 购 于 赛 默 飞 世 尔 公 司；si-NC、si-TRAF4、pcDNA、TRAF4购于广州锐博生物公司；凋亡试剂盒购于江苏凯基生物公司；B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）相关X蛋白（Bax）抗体、Bcl-2抗体、微管相关蛋白1的轻链3（LC3）抗体、LC3抗体、Beclin 1抗体、ATG7抗体、TRAF4抗体、GAPDH抗体购于美国Abcam公司；荧光定量试剂盒、逆转录试剂盒、T
7、rizol试剂购于Promega公司；引物购于上海吉玛公司。1484天 津 中 医 药 23年11月第40卷第11期Nov.23,40 11表 1不同浓度冬凌草甲素对 A549 细胞活力的影响（xs）Tab.1Effects of different concentrations of oridonin onA549 cell viability（xs）冬凌草甲素浓度细胞活力0 mol/L99.28.71 mol/L91.28.2*5 mol/L83.27.9*10 mol/L68.47.2*20 mol/L46.55.3*50 mol/L32.43.8*F124.516P0.000注：与0
8、mol/L组比较，*P0.051.2细胞培养在37、5%CO2培养箱中，A549细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基。细胞汇合率为80%时，采用胰蛋白酶进行消化传代。1.3噻唑蓝（MTT）检测细胞活力取对数生长期A549细胞并接种在96孔板中。过夜培养后，细胞与0、1、5、10、20、50 mol/L的冬凌草甲素孵育48 h。随后，细胞与MTT试剂孵育4 h，然后用二甲基亚砜（DMSO）试剂溶解结晶。利用酶标仪检测吸光度值，评估细胞活力。1.4细胞分组A549细胞接种6孔板内（1105个/mL），细胞贴壁生长后加入0、20 mol/L的冬凌草甲素，记为对照组、冬凌草甲素组。按照Lipo
9、fectamine2000说明书进行细胞转染。A549细胞转染si-TRAF4和si-NC，记为si-TRAF4组、si-NC组；将pcDNA和TRAF4转染至A549细胞后，采用20 mol/L的冬凌草甲素处理，记为冬凌草甲素+pcDNA组、冬凌草甲素+TRAF4组。1.5流式细胞术检测细胞凋亡取1.4各组A549细胞，取1 mL细胞液添加至500 L结合缓冲液内，用于制备细胞悬液。细胞与Annexin V-FITC和PI试剂孵育，利用流式细胞仪分析细胞凋亡率。1.6蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测蛋白表达取1.4中各组A549细胞4 裂解30 min，然后经过12 000 r
10、/min（离心半径为15 cm）离心10 min，收集细胞上清液，根据BCA法定量蛋白浓度，在95 变性7 min。取蛋白样品经过凝胶电泳处理，转膜，转膜结束后封闭培养1.5 h，洗膜3次，加入Bax、Bcl-2、LC3、LC3、Beclin 1、ATG7和TRAF4抗体于4 过夜培养，洗膜3次，加入二抗，室温培养1.5 h，滴加提前配置的显影液，显色、曝光。用ImageJ软件分析蛋白条带。1.7实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测mRNA表达利用Trizol试剂提取总RNA，分光光度计检测RNA样品的浓度和纯度。逆转录法合成cDNA，然后根据荧光定量试剂盒说明书进行PCR扩增反应。
11、以GAPDH为内参，分析采用2-Ct公式计算TRAF4 mRNA表达量。TRAF4上游引物为：5-CATCCACAGTGAGGAGGGCT-3，下游引物为：5-TTCATGGGGCAGCGATTAG-3；GAPDH上 游 引物为：5-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3，下游引物为：5-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3。1.8统计学方法采用SPSS 21.0软件分析实验数据。计量资料以均数标准差（xs）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1不同浓度冬凌草甲素对A549细胞活力的影响评估浓度为0、1、
12、5、10、20、50 mol/L的冬凌草甲素对A549细胞活力的影响。结果显示，A549细胞活力随着冬凌草甲素浓度的上升而逐渐下降（P0.05）。A549细胞半数抑制率（IC50）为22.4 mol/L，因此本研究选择20 mol/L进行后续实验。见表1。2.2冬凌草甲素对A549细胞凋亡的影响与对照组相比，冬凌草甲素组的细胞凋亡率、Bax水平显著升高（P0.05），Bcl-2水平显著下降（P0.05）。见图1、表2。2.3冬凌草甲素对A549细胞自噬的影响与对照组相比，冬凌草甲素组的Beclin 1、LC3/LC3和ATG7蛋白表达显著增加（P0.05）。见图2、表3。2.4冬凌草甲素对A5
13、49细胞中TRAF4表达的影响qRT-PCR和Western Blot检测结果显示，与对照组相比，冬凌草甲素组的TRAF4 mRNA和蛋白表达显著降低（P0.05）。见图3、表4。2.5干扰TRAF4对A549细胞凋亡和自噬的影响与si-NC组相比，si-TRAF4组的TRAF4 mRNA和蛋白表达显著降低（P0.05），细胞凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3/LC3和ATG7水平显著上升（P0.05），Bcl-2水平显示下降（P0.05）。见图4、表5。2.6冬凌草甲素联合免疫因子TRAF4对A549细胞凋亡和自噬的影响与冬凌草甲素+pcDNA组相比，冬凌草甲素+TRAF4组的TRAF
14、4 mRNA和蛋白表达显著增加（P0.05），细胞凋亡率、Bax、Beclin 1、LC3/LC3和ATG7水平显著下降（P0.05），Bcl-1485天 津 中 医 药 23年11月第40卷第11期Nov.23,40 11图 1冬凌草甲素对 A549 细胞凋亡的影响Fig.1Effect of oridonin on apoptosis of A549 cells表 2冬凌草甲素对 A549 细胞凋亡的影响（xs）Tab.2Effect of oridonin on the apoptosis of A549 cells（xs）组别细胞凋亡率（%）BaxBcl-2对照组7.50.90.230
15、.020.850.06冬凌草甲素组23.41.9*0.770.07*0.350.04*t22.68922.25220.801P0.0000.0000.000注：与对照组比较，*P0.05。表 3冬凌草甲素对 A549 细胞自噬的影响（xs）Tab.3Effect of oridonin on autophagy in A549 cells（xs）组别Beclin 1LC3/LC3ATG7对照组0.270.030.320.040.220.02冬凌草甲素组0.680.06*1.250.11*0.640.05*t18.33623.83723.398P0.0000.0000.000注：与对照组比较，*
16、P0.05。表 4冬凌草甲素对 TRAF4 水平的影响（xs）Tab.4Effect of oridonin on TRAF4 levels（xs）组别TRAF4 mRNATRAF4蛋白对照组0.950.070.710.07冬凌草甲素组0.410.04*0.330.03*t20.09414.969P0.0000.000注：与对照组比较，*P0.05。2水平显示上升（P0.05）。见图5、表6。3讨论冬凌草甲素是从冬凌草二萜类化合物内提取分离而来的，具有明显的抗肿瘤作用，如抑制细胞增殖和转移、促进细胞凋亡等10。吴楠等11研究结果显示，冬凌草甲素通过抑制TPX2促进前列腺癌细胞的凋亡，阻滞细胞周
17、期，抑制细胞的增殖。研究发现，冬凌草甲素在宫颈癌研究中可以抑制宫颈癌细胞的增殖，促进线粒体凋亡12。黄陈翼等13在研究骨髓瘤中发现，冬凌草甲素通过抑制磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路促进骨髓瘤细胞的凋亡和抑制细胞增殖。本研究采用不同浓度（0、1、5、10、20、50 mol/L）冬凌草甲素作用A549细胞，MTT实验检测细胞的活力，结果显示，冬凌草甲素呈剂量效应降低，因此本研究采用20 mol/L（接近IC50浓度）进行后续实验，检测冬凌草甲素作用A549细胞后的机制研究。凋亡在癌症的发展中具有重要的作用，Bax和Bcl-2是Bcl-2家族的成员，Bax在细胞发生凋亡时起
18、到促进作用，其过度表达可与Bcl-2拮抗促使细胞发生凋亡14。自噬在细胞代谢和生长发育中至关重要，是一个进化保守的饥饿应答过程，Beclin 1是一种转运蛋白，可将LC3自噬蛋白转移至自噬体膜内间接促进细胞的自噬15-16。LC3是自噬标志的相关蛋白，主要两种亚型LC3、LC3，LC3没有活图 2冬凌草甲素对 A549 细胞自噬的影响Fig.2Effect of oridonin on autophagy in A549 cells图 3冬凌草甲素对 TRAF4 蛋白水平的影响Fig.3Effect of oridonin on TRAF4 protein level1486天 津 中 医 药
19、 23年11月第40卷第11期Nov.23,40 11图 4干扰 TRAF4 对 A549 细胞凋亡和自噬的影响Fig.4Effect of interference TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells表 6冬凌草甲素联合免疫因子 TRAF4 对 A549 细胞凋亡和自噬的影响（xs）Tab.6Effects of oridonin combined with immunizing factor TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells（xs）组别TRAF4 mRNATRAF4蛋白细胞
20、凋亡率（%）BaxBcl-2Beclin 1LC3/LC3ATG7冬凌草甲素+pcDNA0.360.030.290.0222.72.10.820.070.330.030.720.061.290.130.680.06冬凌草甲素+TRAF40.680.07*0.520.04*14.31.2*0.470.05*0.660.05*0.470.04*0.850.07*0.400.04*t12.60515.42910.41912.20616.97810.4018.94011.649P0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000注：与冬凌草甲素+pcDNA组比较，*P0.
21、05。表 5干扰 TRAF4 对 A549 细胞凋亡和自噬的影响（xs）Tab.5Effects of interfering with TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells（xs）组别TRAF4 mRNATRAF4蛋白细胞凋亡率（%）BaxBcl-2Beclin 1LC3/LC3IATG7si-NC0.920.070.770.057.30.70.320.040.630.060.300.020.440.050.360.03si-TRAF40.370.04*0.350.03*22.42.1*0.590.06*0.340.03*0.610.0
22、5*1.320.13*0.650.06*t20.46621.60920.46411.23312.96917.27018.95412.969P0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000注：与si-NC组比较，*P0.05。性，LC3可与线粒体受体蛋白结合促进细胞的自噬；LC3与LC3比值可以反映自噬体情况17-18。此外，LC3-I被Atg7活化，然后在膜内与磷脂酰乙醇胺（PE）偶联生成被加工的LC3-。本研究结果图 5冬凌草甲素联合免疫因子 TRAF4 对 A549 细胞凋亡和自噬的影响Fig.5Effect of oridonin combined wi
23、th immunizing factor TRAF4 on apoptosis and autophagy in A549 cells1487天 津 中 医 药 23年11月第40卷第11期Nov.23,40 11显示，冬凌草甲素能促进细胞的凋亡率，上调Bax、LC3/LC3、Beclin 1、ATG7蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达，提示冬凌草甲素可以诱导A549细胞的凋亡和自噬。TRAF4在多种细胞高表达，是一种致癌基因，最早在乳腺癌内发现，可以广泛参与癌细胞的发展，通过抑制TRAF4抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡等19-20。陈刚等21研究结果显示，TRAF4在非小细胞肺癌细胞内表达上调
24、，生物信息学网站预测显示TRAF4是miR-615-5p的靶标，miR-615-5p通过靶向负调控TRAF4发挥在非小细胞肺癌中的作用。有研究发现，利用干扰沉默技术，干扰TRAF4通过抑制Notch1通路促进肺癌细胞的凋亡和抑制细胞增殖22。本研究结果显示，冬凌草甲素作用A549细胞后，TRAF4 mRNA和蛋白表达下调，抑制TRAF4明显增加细胞凋亡率，下调TRAF4 mRNA和蛋白表达，上调Bax、LC3/LC3、Beclin 1、ATG7蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达，说明抑制TRAF4可以促进A549细胞的凋亡和自噬。深一步研究结果显示，过表达TRAF4可以逆转冬凌草甲素对A549细
25、胞的凋亡和自噬的影响，提示冬凌草甲素通过联合TRAF4发挥在非小细胞肺癌中的作用。综上所述，冬凌草甲素能够促进非小细胞肺癌细胞的凋亡和自噬，其作用机制可能与下调TRAF4有关。本研究探究了冬凌草甲素靶向治疗非小细胞肺癌的分子理论基础，然而，其是否还有其他途径参与冬凌草甲素的抗癌作用仍需要深入探索。参考文献：1SUSTER D I，MINO鄄KENUDSON M.Molecular pathology of primarynon鄄small cell lung cancerJ.Archives of Medical Research，2020，51(8)：784-798.2SUN J J，WU
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36、O Shuai，CHEN Yong（Chongming Central Hospital Affiliated to Shanghai Medical College，Shanghai 202150，China）Abstract：Objective To investigate the effect of oridonin combined with immune factor TRAF4 on autophagy and apoptosis of non鄄smallcell lung cancer cells and its mechanism.Methods Different conce
37、ntrations of oridonin were selected to treat A549 cells，and then MTTmethod was used to detect cell viability.Culture A549 cells in vitro and divide the cells into control group，oridonin group，si鄄NC group（transfected with si鄄NC），si鄄TRAF4 group（transfected with si鄄TRAF4），oridonin+pcDNA group（after tra
38、nsfection of pcDNA，select theoridonin concentration of 20 mol/L for treatment），oridonin+TRAF4 group（after transfection of TRAF4，select the oridoninconcentration for treatment of 20 mol/L）.Flow cytometry was used to detect cell apoptosis；Western blot were used to detect the proteinexpression of Bax，B
39、cl鄄2，LC3/LC3，Beclin 1，ATG7 and TRAF4；qRT鄄PCR detection of TRAF4 mRNA expression.Results Cellviability was suppressed by different concentrations of oridonin.The cell apoptosis rate，Bax，Beclin 1，LC3/LC3，and ATG7 proteinexpression in oridonin group were significantly higher than those of the control g
40、roup；TRAF4 mRNA and protein expression，and Bcl鄄2protein expression were significantly lower than those of the control group.The expression of TRAF4 mRNA and protein，and theexpression of Bcl鄄2 protein in the si鄄TRAF4 group were significantly lower than those in the si鄄NC group；the apoptosis rate，Bax，
41、Beclin1，LC3/LC3 and ATG7 protein expression were significantly higher than those in the si鄄NC group.The expression of TRAF4 mRNAand protein and Bcl鄄2 protein in the oridonin+TRAF4 group was significantly higher than that of the oridonin+pcDNA group；theapoptotic rate，Bax，Beclin 1，LC3/LC3 and ATG7 pro
42、tein expression were significantly lower in the oridonin+pcDNA group.Conclusion Oridonin inhibits the apoptosis and autophagy of non鄄small cell lung cancer cells by down鄄regulating the expression ofTRAF4.Keywords：oridonin；TRAF4；non鄄small cell lung cancer；autophagy；apoptosis16 WU S H，SUN C B，TIAN D，e
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