1、麦类作物学报2 0 2 3，43（10）：130 41310Journal of Triticeae Crops网络出版时间：2 0 2 3-0 8-2 5网络出版地址：https：/lin k.c n k i.n e t/u r lid/6 1.1359.S.2 0 2 30 8 2 4.0 9 13.0 0 2doi:10.7606/j.issn.1009-1041.2023.10.11冬小麦miR172响应抗寒的特征分析王多佳，王政委，任志鹏，彭瞰看，田宇，张达，徐庆华，苍晶（东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150 0 30）摘要：东农冬麦1号（Dn1)是我国首个能在黑龙江省高寒地
2、区安全越冬的强抗寒冬小麦品种。为了解tae-miR172在Dnl抗寒中的调控机制，本研究克隆了Dnl中tae-miR172的前体pre-tae-miR172,根据生物信息学分析预测其靶基因为AP2dn1（T r a e s C S5D 0 2 G 48 6 6 0 0）。通过农杆菌介导的烟草瞬时表达试验，进一步证明tae-miR172靶向AP2dnl；利用qRT-PCR技术对大田越冬期Dnl分节中pre-tae-miR172和Ap2dnl的相对表达量进行分析。结果表明，pre-tae-miR172的表达量随温度降低呈先升后降的变化趋势，而靶基因Ap2dnl的表达量变化趋势则相反，说明tae-m
3、iR172负调控Ap2dnl的表达。关键词：冬小麦；tae-miR172；A P2 d n l；低温胁迫；表达模式中图分类号：S512.1;S330Analysis on the Characteristics of miR172 Responding toWANG Duojia,WANG Zhengwei,REN Zhipeng,PENG Kankan,TIAN Yu,ZHANG Da,XU Qinghua,CANG Jing(College of Life Science,Northeast Agriculture Universtiy,Harbin,Heilongjiang 150030
4、,China)Abstract:Dongnongdongmai 1(Dnl)is the first winter wheat variety in China that can survive the winter safely in the high and cold regions of Heilongjiang Province.In order to understand the regulatorymechanism of tae-miR172 in Dnl cold resistance,the pre-tae-miR172 of tae-miR172 precursor in
5、Dnlwas cloned,and AP2dnl(TraesCS5D02G486600)was predicted as the target gene according to bioin-formatics analysis,The negative regulation of AP2dnl was verified on transcription level by tae-miR172 through Agrobacterium mediated tobacco transient expression experiment.qRT-PCR wasused to analyze the
6、 relative expression of pre-tae-miR172 and AP2dnl in the tillering nodes of Dnlduring the overwintering period in the field.The results showed that the expression level of pre-tae-miR172 increased first and then decreased with decreasing temperature,while the expression level ofAp2dnl showed the opp
7、osite trend,indicating that tae-miR172 negatively regulated the expression ofAp2dnl.Keywords:Winter wheat;tae-miR172;AP2dnl;Low temperature stress;Expression pattern低温是影响小麦生长发育、分布及产量的重要因素之一。东农冬麦1号(Dn1)是我国首个能在黑龙江省高寒地区安全越冬（返青率 8 5%)的强抗寒性（可耐一30 低温)冬小麦品种 11,研究收稿日期：2 0 2 2-0 7-30基金项目：国家自然科学基金项目（3197 18 3
8、1）第一作者E-mail:通讯作者：苍晶（E-mail：1936 958 6 6 7 q q.c o m）文献标识码：ACold Resistance in Winter Wheat其响应低温胁迫的分子机制，对选育耐寒性小麦品种具有重要的理论意义。miRNA（m i c r o RNA)是一类来自真核生物自身基因组的非编码小分子RNA,长度一般为2 1修回日期：2 0 2 2-0 9-0 5文章编号：10 0 9-10 41(2 0 2 3)10-130 4-0 7第10 期25nt,在转录后调控基因表达，对植物的生长发育、非生物胁迫应答等过程均发挥重要作用 2 。miRNA家族中，miR17
9、2是最早被发现同时也是被研究最透彻的成员之一 3,其靶基因主要编码AP2/ERF（A PET A LA 2/e t h y le n e r e s p o n s iv efactor)类转录因子。AP2/ERF转录因子为植物所特有，几乎参与植物生长发育的各个环节。研究发现，miR172/AP2模块不仅参与植物生长发育过程（包括花器官发育、块茎、根瘤形成等 5-7 ），也参与植物衰老以及响应逆境等过程 8 。在小麦中，miR172不仅可通过控制驯化基因Q的表达调控穗型发育 9；也可负调控其靶基因AP2的表达，参与小麦渗透胁迫响应 10 。但有关miR172介导作物响应低温胁迫机制的研究鲜有报
10、道。Dnl作为强抗寒性冬小麦品种，含有大量与抗寒相关的miRNA。本课题组前期利用构建的不同温度（5、一10、一2 5）下 miRNA高通量测序数据库，获得了显著差异表达的miR172,本研究对其靶基因进行预测，并采用生物信息学、qRT-PCR、瞬时表达等技术分析Dnl中miR172/AP2模块调控小麦抗寒机制，以期为培育强抗寒性冬小麦品种提供帮助。1材料与方法1.1试验材料冬小麦品种为东农冬麦1号（Dn1），由东北农业大学小麦育种实验室提供。烟草品种为本氏烟，由东北农业大学植物生理与分子生物学研究室提供。大肠杆菌DH5、农杆菌EHA105和植物表达载体PBI121-GUS等由本课题组保存。1
11、.2大田取样将Dn1种子于2 0 18 年9 月8 日播种于东北农业大学试验地，种植方法参考田宇等 11的报道。待麦苗长至三叶期，大田自然降温连续10 d平均最低温度为5（对照温度，2 0 18 年10 月15日）、0（2 0 18 年11月0 2 日）、一10（2 0 18 年11月2 3日）和一2 5（2 0 19 年1月14日）时，选取长势一致的麦苗，剪取分节，置于一8 0 保存，备用。1.3Dnl 中tae-miR172的前体pre-tae-miR172及其靶基因Ap2的克隆与生物信息学分析1.3.1pre-tae-miR172及Ap2的克隆根据本实验室前期建立的DnlmiRNA数据库
12、与已公开的miRNA数据库miRBase（h t t p：/王多佳等：冬小麦miR172响应抗寒的特征分析:1305www.mirbase.org/)中的小麦miRNA数据，获得tae-miR172的前体和成熟体序列。从小麦基因组数据库 Wheat URGI(https:/wheat-urgi.versailles.inra.fr/）获取靶基因的DNA序列和蛋白序列。用PrimePrimer5.0软件设计克隆tae-miR172的前体pre-tae-miR172及其靶基因Ap2的特异性引物（表1）。利用Plant GenomicDNAKit(康为世纪，泰州）提取Dnl分节总DNA,以总 DNA
13、为模板,以pre-tae-miR172-F/R为引物，利用2 XTaq MasterMix(Dye)扩增pre-tae-miR172,PCR反应体系为2 0 L，包括DNA模版1L，上、下游引物各1L，2 T a q M a s t e rMix（D y e)10 L,ddH,O7L。PC R反应程序:945m in;9 430 s,56 30 s,7 2 1m in,35个循环;7 2 10 min。用UltrapureRNAKit试剂盒（康为世纪，泰州）提取Dnl分节总RNA,利用 Hi Script III 1st Strand cDNA Syn-thesis Kit（十gDNAwipe
14、r）试剂盒（诺唯赞，南京)将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，以Adnl-F/R为引物,利用2 XTaq Master Mix(Dye)扩增靶基因Ap2,PCR反应体系同上。PCR反应程序.9 45min;943 0 s,58 3 0 s,7 2 1min,35个循环;7 2 10 min。1.3.2生物信息学分析根据tae-miR172的前体和成熟体序列在小麦基因组数据库Wheat URGI获取 tae-miR172的染色体位置。利用WebLOGO（h t t p:/weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)对 miRNA成熟体序列进行碱基保守性分析。利用在线软件R
15、NAfold Web Sever(http:/rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)对miRNA前体进行茎环结构预测。利用psRNAtarget(http:/plant-grn.noble.org/psRNATarget/analysis）和PRND(http:/ tae-miR172 的潜在靶基因进行预测。利用Pfam数据库（http:/pfam.xfam.org/）分析其蛋白结构域。用ProtParam软件预测AP2蛋白的理化性质。下载pre-tae-miR172和AP2基因CDS上游2 0 0 0 bp的序列，利用PlantCARE分析启动子区
16、域的顺式作用元件。1.4植物表达载体的构建在扩增pre-tae-miR172和AP2的上、下游引物5 端加上包含酶切位点的15bp重组位点序列,分别为 5-ACGGGGGACTCTAGAGGATCC-13063和 5-GGACTGACCACCCGGGGATCC-3,以此新的引物进行PCR扩增，反应体系和反应程序同1.3.1。将PCR扩增产物进行胶回收。用BamHI对pBI121-GUS载体进行单酶切，使用诺唯赞公司的 ClonExpress?Ultra One Step Cloning Kit将pre-tae-miR172和Ap2分别连接到酶切后的pBI121-GUS表达载体上，转人大肠杆菌D
17、H5后进行摇菌，然后送哈尔滨博仕生物有限公司进行测序，最终构建pBI121-pre-tae-miR172和pBI121-AP2载体。1.5烟草瞬时表达试验参考彭瞰看 12 的方法将构建的表达载体pBI121-pre-tae-miR172和pBI121-AP2分别转化EHA105农杆菌。然后将含有PBI121-pre-tae-miR172、p BI 12 1-A P2 的农杆菌菌液以及含有重组质粒pBI121-pre-tae-miR172和pBI121-AP2的等体积混合农杆菌菌液（OD600分别为0.5)进行烟草叶片瞬时表达试验，以pBI121-GUS为对照。引物Primerpre-tae-m
18、iR172-Fpre-tae-miR17-RAdnl-FAdnl-RTaActin-FTaActin-RTaU6-FTaU6-RqAP2dn1-FqAP2dn1-Rtae-miR172-FmRQ 3 Primer1.7数据统计用MicrosoftExcel2018进行数据分析，用Graphpad Prisim 6.0软件进行 one-way或 two-way方差分析(ANOVA)。2结果与分析2.1tae-miR172前体pre-tae-miR172的克隆及生物信息学分析结果对pre-tae-miR172进行克隆并测序，发现pre-tae-miR172的长度为 39 6 nt(图1A)。U R
19、G I麦类作物学报进行烟草叶片注射时，选择生长状态良好且颜色深绿的植株顶端附近2 3片叶。用注射器（去掉针头)吸取1mL农杆菌菌液从叶片背部轻轻注射菌液。每次试验后更换手套以防污染。注射后，将幼苗在2 5下孵育5d。按照Jefferson等 13 的方法，对三种处理中的GUS进行组织化学染色和定量检测。所有处理均3次重复。1.6pre-tae-miR172 和Ap2dn1 的 qRT-PCR 分析用UltrapureRNAKit提取冬小麦分节RNA,用 miRNA lst stand cDNA Synthesis ikit试剂盒（Vazyme，南京）合成cDNA，用ChamQSYBR qPCR
20、 Master Mix(Vazyme,南京)对pre-ttae-miR172和Ap2进行qRT-PCR，分别以小麦U6和Actin为内参，以qAP2dnlF/R以及tae-miR172-F和 mRQ3Primer为引物（表1）。PCR反应体系和反应程序均参照试剂盒说明书，利用2-AC法计算pre-tae-miR172及Ap2的相对表达量。表1小麦qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence of wheat引物序列(5 一3)Sequence(5-3)TGCCGAGGGAGAGATTGGTTCCAGTGGCTGCAGGAAGTGTAGGGTGGGTCAA
21、GCGAGTTTCGAAACCAGCCTCAGCCAGTCCCTTAGTACCTTCCAACAGATGTCCAGACAACTCGCAACTTAGACTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGTGCCGGACAACTAGCTCTCTCAGCACCTCCAACACACACAAAGAATCTTGATGATGCTGCAT由Mir-XmiRNAFirst-Strand SynthesisKit提供Supplied by Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit第43卷用途Purposepre-tae-miR172的克隆Clone of pr
22、e-tae-miR172Ap2dnl的克隆Clone of Ap2dnlqRT-PCR数据库分析表明，tae-miR172位于小麦1B染色体上，其上、下游10 0 0 bp之间不存在mRNA，属于基因间miRNA。对Dnl 和中国春小麦的pre-tae-miR172序列进行比对，发现Dnl中该序列缺失2 1nt,推测是由于品种差异性造成的（图1B）。用WebLogo软件分析miR172成熟体序列的保守性，发现miR172序列非常保守（图1C）。RNAfold软件预测发现，pre-tae-miR172形成了一个稳定的二级茎环结构（图1D），其热力学系综合最小自由能为一113.10 kcalmol
23、-1。D n l 中第10 期miR172的这些序列特征与拟南芥中miR172的序列特征基本相似，说明miR172的功能非常保守。下载tae-miR172前体序列上游2 0 0 0 bp序列，利用PlantCARE预测启动子区域的顺式作用AM2000nt1 000 nt700nt500nt250nt100ntA:pre-tae-miR172的克隆结果；M:DL2000；l:p r e-t a e-m i R17 2;B:p r e-t a e-m i R17 2 测序结果对比；C:miR172碱基保守性分析；D:pre-tae-miR172的RNA二级结构。A:Amplicon of pre-
24、tae-miR172;M:DL2000;1:pre-tae-miR172;B:Sequence alignment of pre-tae-miR172;C:Motif analysis oftae-miR172;D:RNA secondary structure analysis of pre-tae-miR172.元件类别Element type核心启动子元件Corepromoterelement核心启动子元件Corepromoterelement脱落酸响应元件Abscisic acid response element茉莉酸响应元件Jasmonic acidresponse element
25、生长素响应元件Auxinresponsiveelement赤霉素响应元件Gibberellin responsive element厌氧诱导元件Anaerobic inductionelement干旱响应元件Drought response element光响应元件Photoresponsive element十：含有；一：不含有。+:Contain;:Notcontain.2.2tae-miR172靶基因的克隆及生物信息学分析结果psRNAtarget 和PRND在线软件预测发现,tae-miR172的靶基因登录号为TRIAECS5DO2G486600.2。从小麦基因组数据库WheatURG
26、I获取靶基因的DNA序列并设计引物Adn1-F/R。以Dnl王多佳等：冬小麦miR172响应抗寒的特征分析B10C01.0OCGAAUCUUCAUGAUGCUGCAM0.05图1pre-tae-miR172的克隆及生物信息学分析结果Fig.1 Cloning and bioinformatics analysis result of pre-tae-miR172表2 pre-tae-miR172和Ap2dn1启动子区域的顺式作用元件Table 2Analysis of cis-acting elements in promoter region of pre-tae-miR172 and Ap
27、2dn 1基因 GeneElement namepre-tae-miR172CAAT-box+TATA-box+ABRE+CGTCA-motifAuxRR-coreP-boxAREMBSATC-motif,Box 4G-boxMRESp1分节cDNA为模板，克隆靶基因序列，发现其长度为16 50 bp(图2 A)，其中CDS序列长度为1350bp（图2 B）。利用Pfam数据库分析其蛋白结构域，发现其含有两个AP2结构域（图2 C)，将该靶基因命名为AP2dnl。生物信息学分析表明，AP2dnl蛋白分子量为11.0 8 8 kDa，等电点1307元件，结果（表2)表明，tae-miR172启动
28、子区域除含有核心元件外，还含有响应激素（脱落酸、生长素和赤霉素)和逆境胁迫（干旱)以及与生长代谢（厌氧诱导和响应光）相关的元件。Identity=95.20%1201302.0-41714015016010170元件名称18015190WebLogo3.7.420020210220D+230240250AP2dn1+2601308为4.93。亚细胞定位预测发现，AP2dnl蛋白位于细胞核中。PlantcARE软件分析表明，与pre-tae-miR172启动子区域含有的元件相比，AP2dnl启动子区域含有茉莉酸响应元件CGTCA-motif和光响应元件spl，而不含有生长素响应元件AuxRR-c
29、ore和核心启动子元件CATT-box(表2）。2.3tae-miR172靶基因AP2dnl的烟草瞬时表达验证利用1%的琼脂糖凝胶对BamHI 酶切后的pBI121-GUS载体进行检测，以未酶切的载体为对照（图3A)，发现酶切后的载体比未酶切的载体小，证明该载体被线性化。随后将pre-tae-miR172和Ap2dn1连接到酶切后的PBI121-GUS载体上，利用1%的琼脂糖凝胶对重组载体pBI121-pre-tae-miR172 和 pBI121-AP2dnl 进行菌落PCR检测（图3B和3C），发现均获得了大小AM122.000 bp5901000bp700bp500bp250bp100b
30、pA：A P2 d n 1的克隆结果；B:AP2dn1测序结果比对；C:AP2dnl结构域预测。A:Amplicon of AP2dnl;B:Sequence alignment of AP2dnl;C:Domin prediction of AP2dnl.ACM一215000bp19000p2508500023001 000 bp250bp麦类作物学报正确的条带，表明两个片段已被正确插人。将测序正确的菌液重新活化，并提取质粒。利用农杆菌介导的遗传转化法，在烟草叶片上瞬时表达含有GUS基因的pBI121-GUS、pBI121-pre-tae-miR172和pBI121-AP2dn1载体。发现单
31、独接种含有pBI121-GUS载体的叶片经组织化学染色后显示为蓝色，有GUS表型；单独接种含有pBI121-AP2dnl载体的叶片，由于AP2dn1与GUS基因上游融合，表现出与pBI121-GUS载体相似的表型；在接种含有pBI121-pre-tae-miR172载体的叶片中，GUS基因由于被tae-miR172前体剪切，因此染色后的叶片没有观察到GUS表型；在pBI121-pre-tae-miR172和pBI121-AP2dn1共转化的叶片中，GUS的组织化学染色深度明显降低（图4）。这说明tae-miR172靶向AP2dn1。BIdentity-100.00%600610CFamilyA
32、P2Ap2 domainAP2Ap2.domain图2 AP2dnl基因的克隆及生物学分析结果Fig.2 Cloning and biological analysis results of AP2dnl geneB2.000 bp1000bp750bp500bp250bp100 bp第43卷1350620630DescriptionEntrytypeDomalhCL00811191691201682535439.75.0e-10DomainCL0081211262211261M12640cianStartEmdStartEndFromTofength535436.74.18-09M122.0
33、00 bp1 000 bp750bp500bp250bp100bp650AP2AP2EnvelopeAlignmient660670680HMNHHNitEvalue690700710Predictedactivesites720730Show/hidedignmentShowShowA：酶切载体电泳图；图A中，M:DL15000；1：未酶切的pBI121-GUS载体；2：酶切后的pBI121-GUS载体。B:pBI121-pre-tae-miR172的菌落PCR结果；C:pBI121-AP2dn1的菌落PCR结果。图B和C中，M为DL2000，1和2 为两个重复。A:Electrophore
34、sis of enzyme digested vector;In figure A,M is DL15000,1 is pBI121-GUS vector without digestion;2 is pBI121-GUS vector with digestion.B:Colony PCR results of pBI121-pre-tae-miR172;C:Colony PCR results of pBI121-AP2dnl.In figures Band C,M is DL2000,1 and 2 are two replicates.图3pBI121-GUS载体构建电泳图Fig.3C
35、onstruction of pBI121-GUS vector第10 期王多佳等：冬小麦miR172响应抗寒的特征分析1309ABCDA：p BI 12 1-G U S;B:p BI 12 1-p r e-t a e-m iR17 2;C:p BI 12 1-A P2 d n l;D:p BI 12 1-p r e-t a e-m iR17 2 和pBI121-AP2dn1的混合物。A:pBI121-GUS;B:pBI121-pre-tae-miR172;C:pBI121-AP2dnl;D:The mixture of pBI121-pre-tae-miR172 and pBI121-AP2
36、dnl.图4通过组织化学染色观察到的GUS表型Fig.4 GUS phenotype observed by histochemical staining2.4低温胁迫下 Dnl 中pre-tae-miR172 和AP2dnl的表达模式利用qRT-PCR技术分析pre-tae-miR172及AP2dn1在5、0、一10 和一2 5四个温度下的表达模式。结果表明，pre-tae-miR172的表达量随着温度的降低呈先升后降的变化趋势，0时表达量最高，一2 5时表达量最低（图5A）。AP2dnl的表达量变化趋势与pre-tae-miR172相反，随着温度的降低呈先降后升的变化趋势，在一25表达量最
37、高，0 表达量最低（图5B）。推测tae-miR172负调控AP2dnl的表达。3讨论miR172是一个非常保守的miRNA，参与植物不同生长发育过程。在拟南芥（Arabidopsis3.5A3.02.52.01.51.00.50.0*、*和*分别表示与对照温度（5)间在0.0 5、0.0 1和0.0 0 1水平上差异显著。*,*and*indicate significant difference compared with control temperature(5 C)at 0.05,0.01 and 0.001 levels,respectively.图5低温胁迫下Dnl分节中pre-
38、tae-miR172（A）和AP2dn1(B）的表达模式Fig.5 Expression patterns of pre-tae-miR172(A)and AP2dn1(B)in tiller nodes of Dnl under cold stress本研究通过生物信息学预测到tae-miR172的靶基因为AP2家族基因AP2dnl，通过烟草瞬时表达试验，说明tae-miR172负向调控AP2dnl基因的表达，这与Jung等 5 和梅林等 19 的研究结果一致。利用qRT-PCR技术分析AP2dnl在thaliana）中，miR172与miR156相互作用，通过调控拟南芥中SPB和AP2基因
39、的表达来控制发育时间-15。在大岩桐（Sinningia speciosa）中，miR172通过调控AP2基因的表达来影响花器官的发育 16 。另外，miR172在植物抗逆过程中也具有重要作用，如拟南芥miR172参与对干旱胁迫的响应；大豆（Glycinemaa）m i R17 2 调控根系对盐胁迫的敏感性 17 ；香蕉（Musa nana）m i R17 2参与对寒冷胁迫的响应 18 。迄今为止，小麦miR172响应低温胁迫的研究尚未见报道。在本研究中，tae-miR172前体pre-tae-miR172的表达量随着温度的降低呈先升后降的趋势，在0 时达到峰值，随后逐渐下降，到一2 5时最低
40、，说明Dnl中tae-miR172对低温胁迫的响应非常灵敏，推测在Dn1抗寒过程中起调节作用。2.5B*2.01.51.00.50.050温度Temperature/*-10-255不同温度下的表达模式，发现AP2dn1与冬小麦抗寒有关，并起正向调控作用。由于Dnl中AP2dn1响应低温胁迫的过程也可能受细胞内激素、光照、温度、水分等因素的调控，具体调控机制有待进一步探究。0温度Temperature/-10-25:1310根据低温胁迫程度的不同，低温胁迫可以划分为冷害（0 2 0)和冻害（0）。两种低温胁迫都会改变植物的细胞结构、生理代谢以及蛋白活性等，从而影响植物的生长发育 2 0 。植物
41、在应对冷害胁迫和冻害胁迫时存在不同的调控模式，本研究Dnl中miR172/AP2的调控模式在两种低温胁迫下存在差异，推测抗寒小麦品种Dn1中miR172/AP2模块响应冷害和冻害的机制不同，需要进一步验证。参考文献：1佟明耀，郑家兰，李卓夫，等.高寒地区超强抗寒新品种“东农冬麦1号”的选育 J.东北农业大学学报，2 0 10，41(7)：1.TONG M Y,ZHENG J L,LIZ F,et al.Research on breedingnew winter wheat cultivar“Dongnongdongmai 1 of super-freezing tolerance in fr
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