1、林彩霞，苏伟，母应春，等.洞酿酱香酒五轮次酿造过程中微生物与挥发性风味物质的相关性 J.食品工业科技，2023，44（21）：127136.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120114LINCaixia,SUWei,MUYingchun,etal.StudyontheCorrelationbetweenMicrobeandVolatileFlavorSubstancesinFiveRoundsofBrewingProcessofDongniangSauce-flavorBaijiuJ.ScienceandTechnologyofFoodIndustry,202
2、3,44(21):127136.(inChinesewithEnglishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120114 生物工程 洞酿酱香酒五轮次酿造过程中微生物与洞酿酱香酒五轮次酿造过程中微生物与挥发性风味物质的相关性挥发性风味物质的相关性林彩霞1，苏伟1,2,*，母应春1，任婷婷1，潘和勇3，王家琴3（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025；3.贵州洞酿洞藏酒业有限公司，贵州遵义564622）摘要：堆积发酵是酱香白酒生产过程中至关重要的环节，其微生物多样
3、性与挥发性风味物质间的关系复杂多变。为了更好地了解洞酿酱香酒在五轮次堆积发酵酒醅中微生物与风味代谢物质间的相关性，利用高通量测序技术（HTS）与顶空固相微萃取气相色谱质谱联用技术（HS-SPME/GC-MS）对五轮次堆积发酵酒醅中微生物菌群多样性和挥发性风味化合物进行检测，并计算二者之间 Pearson 相关系数，绘制可视化相关性网络图。结果显示：共鉴定出 55 种挥发性风味物质，分别为 25 种酯类、5 种醇类、7 种醛类、4 种酸类、4 种酚类、3 种烷烃类与 7 种其他类，其中乳酸乙酯、苯乙醇、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯为关键挥发性成分。从菌群结构上看，枝芽孢杆菌属、Kroppenstedt
4、ia、芽孢杆菌属、海洋芽孢杆菌、嗜热真菌属、接合酵母菌属、嗜热子囊菌属等为优势菌群。其中，Kroppenstedtia、红曲霉属、芽孢杆菌属与接合酵母菌属是对风味物质影响显著的微生物属。本研究旨为洞酿酱香酒品质提升提供理论依据。关键词：洞酿酱香酒，五轮次，微生物多样性，风味化合物，相关性本文网刊:中图分类号：TS262.33文献标识码：A文章编号：10020306（2023）21012710DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022120114StudyontheCorrelationbetweenMicrobeandVolatileFlavorSubstancesin
5、FiveRoundsofBrewingProcessofDongniangSauce-flavorBaijiuLINCaixia1，SUWei1,2,*，MUYingchun1，RENTingting1，PANHeyong3，WANGJiaqin3（1.SchoolofWineMakingandFoodEngineering,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China；2.KeyLaboratoryofFermentationEngineeringandBiologicalPharmacyofGuizhouProvince,GuizhouUniversity,G
6、uiyang550025,China；3.GuizhouDongniangDongcangWineIndustyLimitedCompany,Zunyi564622,China）Abstract：Stackingfermentationisacrucialstepinproducingsauce-flavorBaijiu.Therelationshipbetweenmicrobialdiversityandvolatileflavorsubstancesiscomplexanddynamic.Tobetterunderstandthecorrelationbetweenmicroor-gani
7、smsandflavorsubstancesinDongniangsauce-flavorBaijiuduringthefive-roundstackingfermentationofJiupei,high-throughput sequencing(HTS)technology and headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spect-收稿日期：20221214基金项目：2022 年自然科学基金地区科学基金项目（32160554）；遵义市创新人才团队培养项目（遵义科人才 20209）；贵州省发酵工程与白酒酿
8、造人才基地（黔人领发20183 号）；梅花鹿及黑山羊屠宰分割与产品精深加工技术研究集成（黔科合服企 20204009（006）。作者简介：林彩霞（2001）（ORCID：0000000186860818），女，硕士研究生，研究方向：食品加工与安全，E-mail：。*通信作者：苏伟（1974）（ORCID：0000000223553527），男，博士，教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：。第44卷第21期食品工业科技Vol.44No.212023年11月ScienceandTechnologyofFoodIndustryNov.2023rometry(HS-SPME/GC-MS)were
9、usedtoidentifythemicrobialfloradiversityandvolatileflavorcompounds.Inaddition,thePearsoncorrelationcoefficientwascomputed,andavisualizablecorrelationnetworkdiagramwasdrawnbasedonthedetectionresults.Theresultsidentified55volatileflavorcompounds,including25esters,5alcohols,7aldehydes,4acids,4phenols,3
10、alkanes,and7others.Themainvolatilecomponentswereethyllactate,phenylethylalcohol,ethylphenylacetate,and phenethyl acetate.The dominant microorganism genera in the floral structure were Virgibacillus,Kroppenstedtia,Bacillus,Oceanobaciillus,Thermomyces,Zygosaccharomyces,andThermoascus.Kroppenstedtia,Mo
11、nascus,Bacillus,andZygosaccharomycessignificantlyaffectedflavorsubstancesamongtheflora.Overall,thepurposeandsignificanceofthisstudyaretoprovideatheoreticalfoundationforenhancingthequalityofDongniangsauce-flavorBaijiu.Keywords：Dongniangsauce-flavorBaijiu；five-round；microbialdiversity；flavorcompounds；
12、correlation白酒是一种起源于中国的蒸馏酒，以其古老的酿造工艺和独特的风味而闻名，是世界上七大著名蒸馏酒之一1，酱香型白酒是最常见的四种基本风味类型之一2。由于酿造原料、酒曲种类、环境和制作工艺的不同，影响着酿酒微生物菌群的形成3。酱香型白酒酿造的地域要求严格、生产需求大4，而由贵州喀斯特地貌形成的天然古溶洞龟仙洞，溶洞常年恒温、恒湿，洞口通风条件良好，为酿酒藏酒所需的微生物提供繁衍与生产的温床，是经基尼斯认证的目前全球最大的天然溶洞白酒酿藏基地5。洞酿酱香酒与传统酱香型白酒一致经过“12987”过程完成一个周期，“12987”即为一年一个生产周期，需经过两次投料、九次蒸煮、八次发酵和
13、七次取酒过程2，但洞酿酒整个生产过程均在天然溶洞内进行。洞酿酒研究中张超等6通过平板计数法探索不同季节浓香型白酒微生物菌群在整个发酵周期的动态变化情况，发现 3 个季节微生物消长变化无明显差异，由此说明洞酿车间能够为有益微生物提供适宜的生长环境，维持正常代谢。而目前对于天然溶洞酿造酱香型白酒的研究鲜见报道。发酵分为堆积发酵和窖池发酵。堆积发酵是指原料或酒醅经过高温蒸煮糊化后，加入高温大曲收拢成椎体，在地面堆积发酵 27d7。堆积发酵富集到了大量的微生物和产生大量风味前体物质，对酱香白酒品质至关重要8。因此评价堆积发酵过程中微生物菌群多样性对于其在洞酿酱香白酒生产中的功能和价值以及提高工艺效率具
14、有重要意义。Dai 等9对利用高通量测序对三四五轮次酱香型白酒的微生物多样性进行研究，并且结合相应的理化特性与感官品评结果发现，三四五轮次白酒质量最佳。张春林等10采用高通量测序技术对茅台镇酱香型白酒二轮次堆积发酵酒醅样品中微生物结构多样性及其风味之间的关系进行研究，结果发现芽孢杆菌属、裸胞壳属、海洋芽孢杆菌属等是酱香型白酒堆积过程中的主要微生物，对酱香型白酒的风格形成有重大贡献。目前，已经有了许多堆积发酵过程中微生物对代谢物影响的研究，但大多都是在车间内进行，而针对洞内发酵的研究较少。由于五轮次作为酱香型白酒中酒质最好的轮次之一，因此本研究主要集中在洞酿酱香酒五轮次堆积发酵过程，通过系统分析
15、五轮次酒醅微生物区系的动态变化和风味物质及其相关性，探讨风味物质形成机制。旨在为推进洞酿酱香酒的稳定发展提供基础理论和科学依据。1材料与方法1.1材料与仪器样品取自某洞内第五轮次堆积发酵酒醅，洞内温度 25，相对湿度 80%90%，堆子高 1.7m、长2m。五轮次堆积发酵三天后下窖，参考任婷婷等11洞口一轮次的采样方法与堆子温度变化情况（024h 升温速率最快，48h 到达顶峰后趋于稳定，72h后堆积发酵结束），将取样时间选择为 0、24、48、72h，在每个时间节点分别采集酒醅上、中、下三个层次样品，每个层面分别采集中间及四周边缘位置（如图 1）混合后作为一个层面的酒醅样，随后将 3 个层面
16、的酒醅样混合均匀作为一个样，混合样立即装入无菌密封袋，每个样品取三次平行，置于80 下保存用于高通量测序及风味分析；脱氧核糖核酸试剂盒（deoxyribonucleicacid，DNA）抽提试剂盒美国 MPBiomedicals 公司；2%琼脂糖凝胶西班牙 Biowest公司；FastPfu 聚合酶北京全式金生物技术股份有限公司；AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒美国 Axygen公司；正反引物深圳市英俊生物技术有限公司；缓冲液：PhusionHigh-FidelityPCRMasterMixwithGCBuffer美国 NewEnglandBiolabs 公司；环己酮（99.5%，GC）、
17、正构烷烃（C7C40）上海安谱实验科技股份有限公司。1.7 m30 cm1 m30 cmAABCBLHDFMIEG K OJN图1堆积发酵取样示意图Fig.1Samplingdiagramofaccumulationfermentation注：A：堆积发酵发酵堆取样正视图；B：发酵发酵发酵堆取样俯视图。HS-SPME/GC-MS（Trace1300-TSQ8000）美国赛默飞世尔科技公司；NanoDrop2000 超微量分光128食品工业科技2023 年11月光度计美国 ThermoFisherScientific 公司；DYY-6C电泳仪北京市六一仪器厂；ABIGeneAmp9700型 PC
18、R 仪美国 ABI 公司；IlluminaMiseqMISEQ测序仪美国 Illumina 公司。1.2实验方法1.2.1总 DNA 提取与 PCR 扩增根据 FastDNASPINKitforSoil试剂盒（MPBiomedicals，USA）对酒醅样品进行总 DNA 提取。对细菌 V3V4 可变区用基因上游引物 338F（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3）与下游引物 806R（5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）以及真菌 ITS1 区域引物 ITS1（5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3）与 ITS2R（5-GCTGCGTTCTTCATCGAT
19、GC-3）进行扩增。扩增程序为：95 预变性 3min；95 变性 30s，55 退火 30s，72 延伸 45s，循环 35 次。PCR扩增总体积为 20L，包括 ForwardPrimer（5mol/L）0.8L，ReversePrimer（5mol/L）0.8L，2.5mmol/LdNTPs2L，5FastPfuBuffer2L，FastPfuPoly-merase0.2L，BSA0.2L 和样本 TemplateDNA10ng 的反应体系。1.2.2文库构建和 IlluminaMiseq 测序使用 2%琼脂糖凝胶回收 PCR 产物，利用 AxyPrepDNAGelExtractionK
20、it（AxygenBiosciences,UnionCity，CA，USA）进行纯化，Tris-HCl 洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用 QuantiFluor-ST（Promega，USA）进行检测定量。根据 IlluminaMiSeq平台（Illumina，SanDiego，USA）标准操作规程将纯化后的扩增片段构建 PE2300 的文库。利用 Illumina 公司的 MiseqPE300 平台进行测序。1.2.3IlluminaMiseq 数据统计分析用 QIIMEtoo-lsimport插件，将原始序列 fastq 文件，导入为可进行 QIIME2 后续处理的文件格式。然后运用 QII
21、ME2dada2 插件进行质控、修剪、去噪、拼接以及去除嵌合体后，得到了最终的特征序列表格接着，运用 QII-ME2feature-classifier 插件将 ASV 的代表序列比对到预先训练好的 13_8 版本 99%相似度的 GREENG-ENES 与 GreengenesDatabase13_8 版本数据库（根据 338F/806R 引物对将数据库修剪到 V3V4 的区域），得到了物种的分类信息表12。基于细菌和真菌群落的组成，在门和属两个水平上进行样品的多样性分析。1.2.4GC-MS 测定挥发性风味物质称取 1g 已磨碎混匀的酒醅样品放入 20mL 的顶空瓶内，加入2g 氯化钠和
22、7mL 的纯净水，再加入 10L 环己酮（20g/mL）作为内标物，并用 PTFE 隔膜紧密覆盖。使用已老化的 50/30mDVB/Carboxen/PDMS 萃取头在 40 下振摇并提取 180min。提取完成后，立即将 SPEM 纤维插入进样端口，并在 230 下解析分离 5min13。色谱条件：毛细管柱为 DB-WAX（30m0.25mm，0.25m），氦气（99.999%）为载气，流速为 1.0mL/min，无分流模式。升温程序：在 40 下保持 5min，然后以 5/min 的速率上升到 150，保持在 150下 3min，最后以 5/min 的速率升至 240，保持5min。质谱条
23、件：电子轰击离子源（EI），电子能量为70eV，传输线温度为 280，离子源温度为 230，在 50450amu 的范围内采集数据，速率为 1scan/s13。1.2.5挥发性风味物质的数据分析定性分析：参考王涵钰13的分析方法，将实验结果与数据库（NIST）进行比较，筛选出匹配度大于 800 的挥发性化合物。在相同条件下运行 C7C40 的正构烷烃混合标准液以确定化合物的保留系数（RI），计算公式如下：RI=100n+100Rt(x)Rt(n)Rt(n+1)Rt(n)式中：Rt（x）、Rt（n）、Rt（n+1）分别为待测的挥发性成分、含 n 个碳原子正构烷烃和含 n+1 个碳原子的正构烷烃保
24、留时间。定量分析：采用内标法对挥发性成分进行相对定量分析，计算公式如下：Ci=CisAiAisCis式中：Ci为任一组分的质量浓度（gkg1）；为内标的质量浓度（gkg1）；Ai任一组分的色谱峰面积；Ais为内标的色谱峰面积。1.3数据处理所有统计分析均采用 SPSS（26.0）进行分析，采用单因素方差分析（ANOVA）确定差异显著性（P800 共鉴定出 55 种挥发性化合物，分为 6 类，分别为 25 种酯类、5 种醇类、7 种醛类、4 种酸类、4 种酚类、3 种烷烃类，其余 7 种风味物质归为一类。酯类物质是酱香型白酒中重要的挥发性香味物质25。在检测的 25 种酯类化合物中，含量较高的有
25、乳酸乙酯、苯乙酸乙酯、十六酸乙酯（棕榈酸乙酯）、油酸乙酯、乙酸苯乙酯和（Z,Z）-9,12-十八烷二烯酸乙酯。其中油酸乙酯（89.97214.53gkg1）属于高级脂肪酸乙酯，孙优兰等26对清酱型白酒风味特征研究中发现，系列酒中高级脂肪酸乙酯含量越高其酱香风味越明显，同时能保持酒的酱香和空杯留香的风格特征27。从优势细菌属看，在整个堆积发酵期间存在片球菌属与乳酸杆菌属，片球菌属与乳酸杆菌属能与乙醇发生酯化反应生成乳酸乙酯，因此乳酸乙酯在发酵期间含量较高28。苯乙酸乙酯（70.8484.67gkg1），乙酸苯乙酯（46.8670.77gkg1），二者都属于芳香族化合物，芳香族化合物香味突出且具有
26、阈值低、沸点高、难挥发的特点，这是使酒体优雅、醇厚等风味形成的关键29。醇类化合物是酱香型白酒中的重要风味物质，第44卷第21期林彩霞，等：洞酿酱香酒五轮次酿造过程中微生物与挥发性风味物质的相关性131表2五轮次洞酿酱香酒发酵过程中挥发性风味物质含量的变化Table2DynamicchangesofvolatileflavorcompoundsinfiveroundsofDongniangsauce-flavorBaijiu序号保留时间化合物名称含量（gkg1）0h24h48h72h酯类（24种）（25种）（24种）（25种）Z17.19乳酸乙酯112.66.52a102.139.65b75.
27、7710.2b108.3525.1aZ214.12正己酸乙酯30.730.99a27.095.97a23.655.13aZ316.05DL-2-羟基-4-甲基戊酸乙酯18.232.81a13.740.9b10.710.6c14.271.04bZ416.17乙酰丙酸乙酯1.620.35a0.630.63b0.180.06b0.060.05bZ516.41乳酸异戊酯11.042.15a9.182.09ab7.070.52b9.62.27abZ619.92丁二酸二乙酯23.031.09a18.230.6b14.950.53c231.32aZ720.28己酸丁酯1.380.17bc1.990.23a0
28、.970.31c1.730.28abZ820.45辛酸乙酯6.920.69a6.250.52a4.70.54b7.270.45aZ921.78苯乙酸乙酯70.843.91b66.077.8b56.113.64bc84.676.19aZ1022.13乙酸苯乙酯46.863.49b44.853.71b40.633.94b70.770.87aZ1122.83戊二酸二乙酯1.210.15a1.140.07a0.830.07b1.110.16aZ1223.29壬酸乙酯1.350.28a1.220.18a1.010.24a1.290.19aZ1324.733-苯丙酸乙酯8.71.31b8.80.55b7.
29、220.9b10.570.3aZ1425.03丙位壬内酯10.330.46a7.780.61b6.61.19b9.950.63aZ1525.55反式-4-癸烯酸乙酯4.360.99ab4.191b3.630.48b6.211.4aZ1625.97癸酸乙酯7.131.26a6.980.82a6.571.62a8.90.81aZ1732.04月桂酸乙酯8.10.43b7.970.3b7.781.68b10.591.06aZ1837.61十四酸乙酯11.932.85b15.963.41ab15.354.33ab204.53aZ1939.94十五酸乙酯2.931.33b4.611.34ab4.221.
30、31ab5.631.2aZ2041.19邻苯二甲酸二丁酯0.060.02ab0.030.02bc0.110.04aZ2141.629-十六碳烯酸乙酯10.724.78b17.583.02ab16.344.64ab22.395.06aZ2242.11十六酸乙酯370.21140.39b0.990.24c482.196.42ab643.3999.22aZ2344.07十七烷酸乙酯0.280.09b0.570.24ab0.530.23ab0.750.22aZ2445.32（Z,Z）-9,12-十八烷二烯酸乙酯80.0735.86b138.4543.43ab146.948.93ab214.5449.7
31、9aZ2545.45油酸乙酯89.9742.49b172.3840.78a152.836.76ab214.5343.1a醇类（4种）（5种）（5种）（5种）C14.71异戊醇0.230.12c2.570.32b5.860.72aC28.74糠醇15.963.6b15.812.4b21.250.86b30.763.42aC315.26苄醇12.581.54bc12.070.85c14.410.82b19.70.44aC417.9苯乙醇509.7719.67b472.1842.39bc448.6829.5c708.557.03aC528.08十二醇2.080.33a2.261.37a2.012.2
32、4a4.432.53a醛类（7种）（7种）（7种）（6种）Q17.89糠醛52.8914.37a36.137.63b1.820.45cQ212.73苯甲醛14.492.05a11.740.98b6.890c8.430.54cQ315.6苯乙醛24.853.1a20.181.9b12.380.46c12.580.42cQ420.74癸醛3.740.22ab3.510.54ab2.570.73b4.451.53aQ522.53-亚乙基-苯乙醛2.740.08b3.360.22b3.240.48b4.320.45aQ626.38十二醛0.690.01b0.750.4b0.930.22b1.520.3
33、2aQ735.59十五醛0.540.23b0.760.11b0.490.06b1.10.14a酸类（4种）（4种）（4种）（3种）S15.79乙酸3.040.85a1.810.3b0.760.25cS216.8庚酸3.970.54a4.750.6a3.180.75a4.161.19aS319.75辛酸8.321.28b8.430.71b8.192.4b13.181.82aS441.37棕榈酸5.192.47b8.862.49b9.532.42b15.671.3a酚类（4种）（4种）（3种）（3种）F119.454-乙基苯酚2.360.13b2.110.12b1.980.52b4.10.66aF
34、222.664-乙基-2-甲氧基苯酚11.621.52b10.410.59b9.821.59b17.740.79aF323.684-乙烯基-2-甲氧基苯酚1.710.06a1.340.23bF429.022,4-二叔丁基苯酚12.323.01b19.585.42a15.440.33ab15.653.03ab烷类（3种）（3种）（3种）（3种）W126.14正十四烷3.661.15a4.41.51a3.810.8a6.481.96a132食品工业科技2023 年11月也是形成酒体爽口、醇厚、助香的主要成分。在洞酿酱香酒五轮次堆积发酵过程中共检测出 5 种醇类，分别是异戊醇、糠醇、苄醇、苯乙醇、十
35、二醇。从优势真菌属看，接合酵母属与毕赤酵母属随着发酵的进行，相对丰度逐渐升高，研究表明苯乙醇是由酵母菌在发酵过程中通过转化发酵液中的苯丙氨酸产生的，或者从发酵初始开始产生30。因此在本研究中苯乙醇含量随着发酵时间的进行从 509.77gkg1上升 708.55gkg1，同时其具有柔和、愉快而持久玫瑰花香。异戊醇呈杂醇油香、糠醇呈焦糖甜香、苄醇呈苦杏仁气味31-32。十二醇作为一种高级醇，一方面衬托酯香，另一方面可使酒体口感丰满柔和、醇厚，给人愉快舒适的感觉33。这些醇类在酿造过程中含量逐渐升高，能够增加酒体的风味和口感34。醛类物质也是构成酱香型白酒的重要风味物质，主要来源于脂肪氧化与氨基酸降
36、解35。在堆积发酵过程中共检测出 7 种醛类。分别为：糠醛、苯甲醛、苯乙醛、癸醛、-亚乙基-苯乙醛、十二醛、十五醛。在 0h 时糠醛含量最高 52.89gkg1，其次是苯乙醛；但随着发酵进行到 72h 时，糠醛含量降至 0，原因可能是随着发酵的进行，其作为反应的前体物质转化为酸类或醇类13。发酵后期苯乙醛含量相对其他醛类含量最高，但对比 0h 阶段含量降至一半，可能是随着发酵的进行通过苯丙氨酸经 Strecker 降解产生醛后还原生成苯乙醇36。另外还检测到 4 种酸类物质和 4 种酚类物质。酸类物质是形成酯类化合物的前体物质，产生的酯类物质赋予酱香型白酒特殊的香气。其中，乙酸、辛酸分别为乙酸
37、乙酯、辛酸乙酯的前体。酚类物质中 4-乙烯基-2-甲氧基苯酚只存在于发酵前期，可能是由于毕赤酵母属能够利用还原酶将酒醅中 4-乙烯基-2-甲氧基苯酚还原为 4-乙基愈创木酚37。2.4微生物与挥发性风味代谢物之间的相关性分析为了研究洞酿酱香酒五轮次堆积发酵过程中微生物群与挥发性风味物质之间的关系，选取相对丰度大于 1%的优势微生物属与 55 种挥发性风味物质进行相关性分析。基于 Pearson 相关性分析结果显示出共有 935 个两两之间的相关性，通过相关系数|r|0.7 和 P0.05 两个条件同时满足筛选出 75 个两两强相关，通过 Ctyoscape 对其进行可视化。如图 6所示，其中共
38、有 47 个正相关（蓝色实线）和 28 个负续表2序号保留时间化合物名称含量（gkg1）0h24h48h72hW228.89十五烷3.150.42b3.710.53b3.461.07b6.020.46aW335.21正十七烷1.660.32b1.710.46b1.310.26b2.830.54a其他（6种）（6种）（7种）（7种）T110.074-（2-氨基乙基）苯-1-磺酰基氟化物1.951.74a2.183.55a0.020.01a3.833.83aT213.37倍他司汀2.930.58a2.650.51a2.50.33a3.260.32aT321.29苯并噻唑2.31.8a3.181.3
39、1aT423.06茴香脑3.650.35b3.560.75b2.570.64b60.69aT523.934-乙基-1,2-二甲氧基苯1.70.09a1.480.12a1.520.37a1.730.05aT625.251,2,4-三甲氧基苯1.90.29b1.930.24b2.060.63b3.110.19aT735.122-十五烷酮0.730.03b10.31ab0.950.28ab1.310.23a注：同一行的不同字母表示具有显著差异（P1）与挥发性物质之间的相关性分析Fig.6Correlationanalysisbetweenmiccroorganisms(VIP(pred)1)andv
40、olativecompoundswithsignificantdifferenceduringthefermentationofDongniangsauce-flavorBaijiu注：Pearson 相关系数（|r|0.7）表明相关性较强，差异有统计学意义（P0.7，P0.05）和负相关（r0.7，P0.5，P0.05）。张艳等43研究发现乳酸菌通过分泌乳酸形成弱酸性培养环境，促进酵母菌生长。研究表明，在葡萄酒发酵过程中乳酸菌与酵母菌共同培养时，可增加水果香气44及与乳酸乙酯相关的奶油香气。相反，乳酸杆菌属抑制了毕赤酵母属的生长，罗青春等45对酿酒酵母、毕赤酵母、布氏乳杆菌和耐酸乳杆菌进行纯
41、培养和共培养对比研究发现，乳酸菌代谢合成乳酸使环境中 pH 下降，抑制毕赤酵母的生长和乙醇代谢。另外，枝芽孢杆菌属与复膜孢酵母菌属呈极显著正相关（P0.01），芽孢杆菌属与接合酵母菌属呈正相关（P0.05），基本上所有的芽孢杆菌都可以适应 pH 在 5.59.0 的生长环境46，并已被证明在酱香型白酒风味的形成起重要作用。由此可知，不同酵母属受环境 pH 的影响不同，但由于本研究乳酸菌的丰度较低，酵母菌的丰度较大，因此枝芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、接合酵母菌属属于优势菌。VirgibacillusLactobacillusSaccharopolysporaPediococcusCarnimonas
42、KroppenstedtiaAcetobacterOceanobacillusBacillusThermoactinomycesAspergillusThermomycesThermoascusSaccharomycopsisPichiaZygosaccharomycesMonascus1.51.50.50.5图7优势细菌属与优势真菌属相关性热图Fig.7Heatmapofthecorrelationbetweendominantbacteriaanddominantfungalgenera注：颜色刻度表示相关性系数，黑色表示正相关，灰色表示负相关；*表示显著相关（P0.05），*表示极显著相
43、关（P0.01）。3结论本研究对第五轮次洞酿酱香酒堆积发酵过程中微生物群多样性、挥发性风味物质以及二者之间的潜在相关性进行分析。高通量测序分析结果显示，细菌属以枝芽孢杆菌属、Kroppenstedtia、芽孢杆菌属、海洋芽孢杆菌、高温放线杆菌属、醋酸杆菌属、糖多孢菌属、乳酸杆菌属、片球菌属为主。真菌属以嗜热真菌属、接合酵母菌属、嗜热子囊菌属、曲霉菌属、毕赤酵母属、红曲霉属、复膜孢酵母属为主。采用HS-SPME/GC-MS 共检测出 55 种挥发性风味物质，分别为 25 种酯类、5 种醇类、7 种醛类、4 种酸类、4 种酚类、3 种烷烃类及其他 7 类。基于皮尔逊相关性分析五轮次洞酿酱香酒堆积发
44、酵过程中微生物菌群与挥发性风味物质以及优势真菌属与优势细菌属134食品工业科技2023 年11月之间的相关性，结果显示 Kroppenstedtia、红曲霉属、芽孢杆菌属与复膜孢酵母菌属对乳酸乙酯、十四酸乙酯、乙酸苯乙酯、糠醇等风味物质的形成起关键作用。本研究对加强洞酿酱香型白酒香味特性的了解具有重要的研究意义，为提高产品生产品质提供理论。参考文献1CAIW,WANGY,WANGW,etal.Insightsintothearom-aprofileofsauce-flavorBaijiubyGC-IMScombinedwithmultivari-atestatisticalanalysisJ.
45、JournalofAnalyticalMethodsinChem-istry，2022，2022：114.2DUANJ,YANGS,LIH,etal.Whythekeyaromacom-poundofsoysaucearomatypeBaijiuhasnotbeenrevealedyet?J.LWT，2022，154：112735.3WANGW,XUY,HUANGH,etal.Correlationbetweenmi-crobialcommunitiesandflavorcompoundsduringthefifthandsixthroundsofsauce-flavorBaijiuferme
46、ntationJ.FoodResearchInter-national，2021，150：110741.4杨国华,邱树毅,黄永光.酱香白酒生产中产香微生物研究J.中国酿造，2011（4）：2427.YANGGH,QIUSY,HUANGYG.MicrobiologyresearchofliquorproductionJ.ChinaBrew-ing，2011（4）：2427.5贺卫,李坡.贵州喀斯特洞穴资源特征及开发利用J.贵州师范大学学报（自然科学版），2016，34（3）：16.HEL,LIP.Re-sourcesfeaturesofGuizhouKarstcaveanddevelopment
47、andutiliza-tionJ.JournalofGuizhouNormalUniversity（NaturalSciences），2016，34（3）：16.6张超,田鹏,徐秋硕,等.浓香型白酒生态洞酿糟醅中微生物的变化研究J.酿酒科技，2019（9）：6567.ZHANGC,TIANP,XUQY,etal.MicrobialchangeinfermentedgrainsofNongxiangBaijiuincavefermentationJ.Liquor-MakingScience&Technol-ogy，2019（9）：6567.7WANGH,HUANGY,HUANGY.Microbi
48、omediversityandevolutioninstackingfermentationduringdifferentroundsofJiang-flavouredBaijiubrewingJ.LWT，2021，143：111119.8杨漫江.堆积发酵对酱香型白酒风味物质形成的影响J.酿酒科技，2011（7）：7273.YANGMJ.Effectsofstackingfer-mentationontheformationofflavoringcomponentsofMaotai-fla-vorliquorJ.Liquor-MakingScience&Technology，2011（7）：7
49、273.9DAIY,TIANZ,MENGW,etal.Microbialdiversityandphysicochemical characteristics of the Maotai-flavoredliquor fer-mentationprocessJ.JournalofNanoscienceandNanotechnology，2020，20（7）：40974109.10张春林,杨亮,李喆,等.酱香型白酒酒醅堆积微生物多样性及其与风味物质的关系J.食品科技，2022，47（4）：111118.ZHANGCL,YANGL,LUJ,etal.Microbialcommunityandits
50、relationshipwithvolatilecompoundsinMoutai-flavorBaijiustack-ingfermentationprocessJ.FoodScienceandTechnology，2022，47（4）：111118.11任婷婷,苏伟,母应春,等.洞口酱香酒第一轮次堆积发酵过程中微生物群落结构及其与理化因子关联性分析J.食品与发酵科技，2023，59（1）：3038.RENTT,SUW,MUYC,etal.Ana-lysisofmicrobialcommunitystructureanditscorrelationwithphysi-cochemicalpr
