1、.869.文章编号：1001-8689(2023)08-0869-10收稿日期：2022-06-20基金项目：国家自然科学基金(No.81770004；No.82073894)和解放军总医院杰出青年科学家培养项目(No.2020-JQPY-004)作者简介：闫开成，男，生于1988年，在读硕士研究生，医师，主要研究方向为抗感染药物合理应用，E-mail:epoch_*通信作者，E-mail:caicai_低频超声在抗感染领域的应用现状闫开成1,2 陈丽3 刘晓丽4 梁文馨2 蔡芸2,*(1 解放军医学院，北京 100853；2 解放军总医院医疗保障中心药剂科药物临床研究室，北京 100853；
2、3 解放军总医院医疗保障中心信息科 北京 100853；4 解放军总医院第一医学中心皮肤科，北京 100853)摘要：抗菌药物的不合理使用，导致耐药菌感染成为影响人类健康的一大危机，虽然近些年研发了一些新型抗菌药物，但耐药趋势并未逆转，目前急需替代疗法来应对这一危机。低频超声作为一个安全且有应用前景的物理方法，在抗感染领域的应用越来越被受到重视，与抗菌药物联合应用能产生协同杀菌作用，杀菌机制包括热效应、机械效应和空化效应。本文综述了体内外低频超声联合抗菌药物在抗浮游菌和生物被膜、促进植入物药物释放和临床应用的特点，旨在对低频超声进一步研究和未来在抗感染领域的应用提供指导。关键词：低频超声；抗感
3、染；空化效应；浮游菌；生物被膜；植入物中图分类号：R978.1 文献标志码：AApplication status of low-frequency ultrasound in the field of anti-infection Yan Kaicheng1,2,Chen Li3,Liu Xiaoli4,Liang Wenxin2,and Cai Yun2(1 Medical School of Chinese PLA,Beijing 100853;2 Center of Medicine Clinical Research,Department of Pharmacy,Medical Su
4、pplies Center,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853;3 Department of Information,Medical Supplies Center,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853;4 Department of Dermatology,the First Medical Center,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853)Abstract The irrational use of antibiotics has le
5、d to the infection of drug-resistant bacteria,which has become a major crisis affecting human health.Although some new antibiotics have been developed in recent years,the trend of drug resistance has not reversed.At present,there is an urgent need for alternative therapy to deal with this crisis.As
6、a safe and promising physical method,low-frequency ultrasound has attracted more and more attention in the field of anti-infection.Combined with antibiotics,it can produce synergistic bactericidal effects.The bactericidal mechanism includes thermal effects,mechanical effects and cavitation effects.T
7、his review summarizes the characteristics of low-frequency ultrasound combined with antibiotics in anti-planktonic bacteria and biofilm,promoting implant drug release and clinical application in vivo and in vitro,in order to provide guidance for the further research of low-frequency ultrasound and i
8、ts application in the field of anti-infection in the future.Key words Low-frequency ultrasound;Anti-infection;Cavitation effect;Planktonic bacteria;Biofilm;Implants一，而抗菌药物依旧是目前治疗相关感染的最有效方法。但是在过去的几十年中，由于不谨慎地使用1 背景细菌感染仍然是人类社会面临的主要挑战之中国抗生素杂志2023年8月第48卷第8期.870.低频超声在抗感染领域的应用现状 闫开成等抗菌药物导致细菌耐药性的流行急剧增加，耐药菌感
9、染仍然是人类健康的严重威胁1。在这种情况下，抗菌药物联合应用已成为治疗耐药菌感染的一种选择，因为它具有广泛的覆盖范围和协同效应，但也提高了药物不良反应风险，最终导致治疗失败、抗菌药物使用量增加以及可能加速多重耐药菌产生2。生物被膜是指细菌黏附于接触表面或形成聚集体，并显示出对抗菌药物和宿主防御的极端耐受性，抗菌药物消除细菌生物被膜所需的药量是根除浮游菌所需用量的5005000倍，这远远超出了人体的承受能力3。因此，抗菌药物治疗通常无法完全根除生物膜，导致复发性生物被膜相关感染4。为了应对这些挑战，有必要寻求一种辅助方法来协助去除细菌生物被膜和缓解细菌耐药趋势。物理方法是疾病治疗的一个重要辅助手
10、段，其中低频超声(low frequency ultrasound，LFU)作为一个安全且有应用前景的物理方法，已经在临床研究和诊断中应用了很多年。LFU指频率范围在20 kHz1 MHz，具有长波长的声波，这种声波在各种组织中具有很强的穿透力，可以引起热效应、机械效应和空化效应5。关于超声治疗的最早报道可以追溯到19世纪50年代，氢化可的松软膏联合超声“按摩”治疗手指关节炎和手滑囊炎，与单纯注射氢化可的松相比疗效更佳，在后来的研究中也得到了类似的结果，证实了超声可以增强药物的皮肤渗透性6-7。随着对这些作用机制的深入研究，LFU在治疗中的潜力逐渐显现。针对多种临床疾病进行了充分研究，包括促进
11、组织再生、疼痛管理、神经调节、抗感染和抗癌症治疗8。LFU在抗感染领域的应用也越来越受到重视，多项研究表明，LFU与抗菌药物联合应用能产生协同杀菌作用，可以提高抗菌药物对浮游细菌、细菌生物被膜、真菌和其他生物体的杀菌作用9。因此，根据现有的体内和体外的研究数据，综述LFU的作用机制及应用效果，旨在评估LFU协同抗菌药物在抗感染领域的应用现状，为未来的临床实践提供指导。2 LFU的生物学机制2.1 热效应一般认为，LFU的抗菌效果取决于其生物学影响，包括热效应和非热效应。LFU的热效应也称为热疗效应，当超声波穿过组织时，组织颗粒介质界面会产生摩擦，介质吸收这些能量并将其转化为热能，引起生物体的某
12、些变化10。LFU的热效应与超声参数和组织密度有关，超声的受阻和衰减度决定了组织中产生的热量水平，这些热量随后对机体的血管舒张、氧合功能和营养交换等生理现象发挥作用。当LFU强度10 W/cm2会产生大量热量，高强度聚焦超声是一种新的无创治疗技术，可以瞬间将靶组织加热到60，导致蛋白质变性或凝固性坏死，因此，高强度聚焦超声主要用于抗癌和消融12。相比之下，低频低强度超声(0.02至1 W/cm2)随着时间的推移产生的热量相对较少13，具体取决于频率、波长和治疗持续时间，许多研究已经验证了低强度脉冲超声和低强度连续超声在组织再生、疼痛缓解、血栓形成、抗微生物、骨折愈合和骨关节炎等疾病治疗中的潜在
13、有效性，可见LFU在低强度下对抗炎、抗菌、修复和再生等有积极疗效。2.2 机械效应机械效应是超声波的最基本的效应，当超声波在体液介质中产生驻波时，悬浮在介质中的微粒在机械力的作用下凝聚，发生位移，这些作用力包括空化效应、微束流和辐射力。而LFU最重要的生理效应是产生空化效应，当超声波在机体传播时，使组织中的液体形成微小气泡核(空化核)，这些空化核闭合时会发生一系列动态过程，包括振荡、膨胀、收缩和崩溃。当声压达到一定数值时，气泡迅速膨胀，然后突然关闭，随后的冲击波可以诱导周围空化核的形成以及细胞膜和质膜的破裂。LFU的这种空化和微流特性归因于惯性流体中微泡的连续压缩和折射循环，引发细胞膜和质膜的
14、局部扩展松动，从而增加营养物质的交换或促进药物输送14。空化效应通常分为稳定型和惯性型，在低强度下，空化核围绕平衡半径周期性振荡，产生辐射压力和微束，微束可以在气泡表面附近产生高剪切力，然.871.后气泡变形和破裂，影响相邻的组织结构并使周围的细胞或血管壁破裂。随着频率的降低，共振气泡的大小和因振荡而被迫移动的液体体积也会增加，这表明微束在低频下可能具有更重要的作用15。当强度增加时，空化气泡在负压下迅速膨胀，在正压下急剧收缩内爆，称为惯性空化。在此过程中，气泡振荡比较剧烈，从剧烈膨胀到急剧塌陷再到瞬间破裂，惯性空化对超声强度呈总体依赖性，超声强度必须高于阈值强度，并且超声频率越高，惯性空化的
15、阈值强度越大。Tezel等16发现惯性空化增强通常与空化的能量密度相关，而与强度和频率无关。这些数据表明惯性空化在低频超声中起着重要作用。LFU的生理效应受多因素影响，其效应机制也是多样复杂的，生物学效应可能主要归因于机械振动，因为一般在低强度下对组织和细胞水平上的热效应很小17。在过去的几十年中，LFU应用取得了重大进展，随着对超声生物效应的了解不断增加，已经确定机械效应可以增强超声化学效应，在促进药物渗透中，LFU介导的微束流和内吞作用可能具有协同作用；在抗肿瘤和抗感染的治疗中，LFU的热效应和空化效应也是相辅相成的；多数研究发现LFU的空化作用在多种治疗作用中具有主导作用18。3 LFU
16、的协同抗菌效应3.1 对浮游菌的作用LFU对浮游菌作用效果的相关文献大多是体外研究，尽管有些研究表明单独使用LFU可以降低细菌的数量19-20，但这样的杀菌效果并不明显，设定的强度也较高，容易产生热损伤。本课题组胡杏等21通过体内小鼠肺炎模型，考察了LFU对小鼠肺炎克雷伯菌肺炎的作用效果，设定频率为29.36 kHz，强度为0.250.3 W/cm2，发现对小鼠活体肺组织中发光肺炎克雷伯菌荧光强度无影响。因此，LFU在抗感染领域的应用主要表现为和抗菌药物的协同作用，Pitt等22首次证实了LFU联合庆大霉素对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和葡萄球菌的协同抗菌作用，吸引了很多学者对LFU在抗感染方面的
17、探索。LFU对浮游菌的联合作用主要是在体外孔板中进行，容易操作和孵育，作用时间短且不易生成生物被膜(表1)。Runyan等23使用70 kHz的LFU在不同强度下联合头孢硝噻吩作用于铜绿假单胞菌，在0.54.7 W/cm2范围内，杀菌效果随着超声强度增强而增高，进一步研究发现LFU作用于铜绿假单胞菌时，会增大细菌的孔膜，可以使大分子的-内酰胺酶从细胞中排出，而小分子头孢硝噻吩更容易进入细菌内，从而杀死细菌。其他研究也证实了LFU增强了一些抗菌药物对某些特定细菌的活性，特别是氨基糖苷类对革兰阴性菌的活性，Zhu等28运用LFU介导的微泡法进一步增强了庆大霉素对大肠埃希菌的抗菌活性，透射电镜下显示
18、细菌细胞膜比单用药物组破坏更严重。此外，Liu等26发现LFU联合左氧氟沙星或环丙沙星可增强其杀死大肠埃希菌的有效性，LFU可以激活氟喹诺酮类药物产生活性氧，主要包括超氧自由基阴离子和羟基自由基。研究发现一些革兰阳性菌也容易受到LFU的作用，使得病原菌对抗菌药物更敏感，甚至能降低耐药性，Ayan等24发现LFU可以增强金黄色葡萄球菌对青霉素、替考拉宁、红霉素等多种抗生素的敏感性，对细菌的形态学和遗传学都产生了改变。LFU联合苯唑西林不仅减少了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的菌落数，使得细胞壁破裂，并且
19、改变MRSA的菌落特征，包括对甲氧西林的耐药性25。除了常规抗菌药物，LFU还可以增强新型抗菌物质对病原菌杀伤能力，比如金属氧化物纳米颗粒、生物聚合物和绿原酸27,29-30。3.2 对生物被膜的作用与浮游菌相比，生物被膜内的细菌对多种抗菌药物表现为耐药，耐药性的增加是由于细菌代谢特征和基因表达的变化。除了表型变化外，生物被膜本身可能会结合或减缓抗菌药物的运输，从而保护内部的细菌免于接触致死水平的抗菌药物。大多细菌在繁殖过程中都会产生生物被膜，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌产生的生物被膜更常见、耐药性更强。很多研究报道了LFU在体外和体内可有效增强某些抗菌药物杀灭细菌生物膜的作用，体
20、内模型大多为兔子和大小鼠皮下植入物模型(表2)。Rediske等32报道LFU作用于家兔皮下的载有中国抗生素杂志2023年8月第48卷第8期.872.大肠埃希菌的聚乙烯圆盘，皮下在超声作用前注射庆大霉素，治疗24 h后分别测量圆盘载菌量，研究分为8个组别，分别设置了阴性对照组、阳性对照组、单用药物组、单用LFU组以及不同强度的LFU组。在24.48 kHz频率下，单用强度0.1 W/cm2 的LFU未见杀菌效果，而与单用药物组相比，LFU联合庆大霉素在0.1 W/cm2时，细菌活力未见明显降低；在0.3 W/cm2时，细菌平均活力从2.94降低到 0.99 lgCFU/cm2；在0.6 W/c
21、m2时，细菌平均活力从2.93降低到1.69 lgCFU/cm2，结果显示在强度为0.3 W/cm2时联合庆大霉素有更好的杀菌效果，这也提示并不是超声强度越高越好，在实际应用中需要探索合适的作用强度，才可能产生更好地杀菌效果。同样，Carmen等34研究了LFU联合庆大霉素在不同强度下作用于体外大肠埃希菌和铜绿假单胞菌被膜，随着作用强度的增加LFU显著增加了庆大霉素穿过生物膜的量，使得庆大霉素在生物被膜下处于较高浓度。对于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物被膜的治疗主要是协同万古霉素，LFU增强了万古霉素在体内外对葡萄球菌生物膜的抑菌作用，特别是对于MRSA42，这种联合作用更具杀菌效果，且对动
22、物无明显危害，其他研究也显示多次LFU联合抗菌药物组合对细菌生低频超声在抗感染领域的应用现状 闫开成等表1 LFU联合抗菌药物对浮游菌的作用效果Tab.1 The effect of LFU combined with antibiotics on planktonic bacteria作者(年)研究类型病原菌频率/强度/作用时间联合药物结果Runyan(2006)23体外浮游菌铜绿假单胞菌70 kHz/0.54.7 W/cm2/3 min头孢硝噻吩LFU对头孢硝噻吩的水解能力随着超声强度的增加而增强Ayan(2008)24体外浮游菌金黄色葡萄球菌 1 MHz/0.03 0.161 W/cm2
23、/20 min青霉素、苯唑西林、替考拉宁、红霉素、克林霉素、左氧氟沙星、环丙沙星与单独使用抗菌药物组相比，LFU联合用药组的细菌菌落数量显着减少，电子显微镜下可观察到细菌细胞壁的部分破坏或解体Conner-Kerr(2010)25体外浮游菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌35 kHz/2 W/cm2/0.5,1,3 min苯唑西林LFU减少了细菌的菌落数，使得细菌破裂或细胞壁断裂，并改变耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的菌落特征，包括对甲氧西林的耐药性Liu(2011)26体外浮游菌大肠埃希菌40 kHz/1 W/cm2/15,30,45 min左氧氟沙星 环丙沙星LFU联合左氧氟沙星和环丙沙星可增强其杀死大
24、肠埃希菌的有效性。LFU可以激活氟喹诺酮类药物产生活性氧，主要包括超氧自由基阴离子和羟基自由基Seil(2012)27体外浮游菌金黄色葡萄球菌30 kHz/15 W/cm2/1 min氧化锌纳米粒子 与单独使用氧化锌纳米粒子相比，LFU联合组使得菌落数进一步减少了76%。氧化锌纳米粒子在超声波存在下通过产生更多的过氧化氢来降低金黄色葡萄球菌的功能Zhu(2014)28体外浮游菌大肠埃希菌46.5 kHz/0.1 W/cm2/24 h占空比1:3庆大霉素微泡介导的LFU可以进一步增强庆大霉素的抗菌功效，透射电子显微镜图像显示，与其他组相比，微泡介导的LFU中细菌细胞膜的破坏更严重Guo(2020
25、)29体外浮游菌大肠埃希菌20 kHz/255 W/cm2/9 min精油纳米乳液LFU和精油纳米乳液的联合处理改变了大肠埃希菌细胞膜的通透性，使得这些细胞释放大量核酸和蛋白质Xie(2020)9体外细胞研究结核分枝杆菌42 kHz/0.13 W/cm2/10 min左氧氟沙星纳米颗粒LFU显着促进了巨噬细胞对左氧氟沙星纳米颗粒的吞噬作用，促进巨噬细胞产生活性氧，巨噬细胞的凋亡率显着高于对照组。与游离药物相比，LFU联合组对巨噬细胞内的结核分枝杆菌的抗菌活性高出10倍Sun(2021)30体外浮游菌金黄色葡萄球菌50 kHz/800 W/cm2/5,10,20,30,60 min绿原酸LFU联
26、合绿原酸处理导致金黄色葡萄球菌细胞膜通透性急剧增加和严重破坏，导致ATP和核酸释放，并降低金黄色葡萄球菌中的胞外多糖含量Sun(2022)31体外浮游菌肠炎沙门氏菌 荧光假单胞菌50 kHz/400 W/cm2/5,10,20,30，60 min绿原酸LFU和绿原酸联合处理显着增加了肠炎沙门氏菌和荧光假单胞菌细胞膜的通透性，使得核酸和ATP渗漏，相关呼吸链脱氢酶活性急剧下降.873.表2 LFU联合抗菌药物对生物被膜的作用效果Tab.2 The effect of LFU combined with antibiotics on biofilm作者(年)研究类型病原菌频率/强度/作用时间联合药
27、物结果Rediske(2000)32体内兔子模型大肠埃希菌28.48 kHz/0.3 W/cm2/24 h占空比1:3 28.48 kHz/0.6 W/cm2/24 h占空比1:6庆大霉素当LFU强度在300 mW/cm2时，细菌平均活力从2.94降低0.99 lgCFU/cm2，当强度在600 mW/cm2时，细菌平均活力从2.93降低到1.69 lgCFU/cm2Carmen(2004)33体内兔子模型表皮葡萄球菌28.48 kHz/0.5 W/cm2/24 h，48 h占空比1:3万古霉素LFU增强了万古霉素对植入的表皮葡萄球菌生物膜的抗菌活性。与单用药物组相比，联合作用组在48 h生物
28、膜中活菌数量下降了2.08 lgCFU/cm2Carmen(2004)34体外生物被膜大肠埃希菌 铜绿假单胞菌70 kHz/1.9和2.9 W/cm2作用于大肠杆菌，1.5和2.5 W/cm2作用于铜绿假单胞菌/15,30,45 min庆大霉素LFU显着增加了庆大霉素穿过生物膜的量，使得庆大霉素在生物被膜下处于较高浓度Carmen(2005)35体内兔子模型铜绿假单胞菌 大肠埃希菌28.5 kHz/0.5 W/cm2/24 h，48 h占空比1:3庆大霉素与单用庆大霉素相比，LFU联合治疗组使得大肠埃希菌生物膜中的活菌数从(2.290.40)lgCFU/cm2降低至(0.0111.02)lgC
29、FU/cm2。但24或48h的超声波联合庆大霉素未能显著增强对生物膜中铜绿假单胞菌的杀菌效果Seth(2013)36体内兔子模型铜绿假单胞菌非接触式LFU，根据MIST治疗系统的说明，每天或每隔一天治疗3 min环丙沙星LFU联合环丙沙星可显著减少活菌数量，改善伤口愈合度和提高宿主抗炎能力Zhu(2013)37体外生物被膜表皮葡萄球菌 金黄色葡萄球菌80 kHz/1 W/cm2/10 min人-防御素3LFU联合人-防御素3，生物膜密度、活细胞百分比和从生物膜中回收的两种萄球菌的活菌数显着降低。LFU可以通过同时促进相关基因表达来增强人-防御素3活性，从而抑制葡萄球菌耐药基因的表达Li(201
30、5)38体内小鼠模型表皮葡萄球菌 金黄色葡萄球菌80 kHz/0.2 W/cm2/20 min人-防御素3LFU联合人-防御素3，小鼠体内生物膜密度、活细胞百分比和活菌数显着降低Liu(2016)39体外生物被膜泛耐药鲍曼不动杆菌40 kHz/0.6 W/cm2/30 min占空比1:3多黏菌素+万古霉素在孵育12 h后，LFU联合多黏菌素+万古霉素比单用药物组细菌载量降低2 lg CFU/mL。在孵育24 h后，细菌计数持续下降，联合组比单药组减少了3.77 lg CFU/mLDong(2017)40体外生物被膜表皮葡萄球菌1 MHz/0.5 W/cm2/5 min万古霉素与暴露于万古霉素的
31、生物膜相比，LFU处理后的生物膜对万古霉素更敏感，活菌数量减少。超声联合微泡可以通过机械和生化机制增强抗菌药物和中性粒细胞对生物膜的活性Dong(2018)41体内兔子模型表皮葡萄球菌300 kHz/0.5 W/cm2/5 min万古霉素与对照组相比，LFU微泡联合万古霉素治疗组使得生物膜中的活菌数从6.440.03 lgCFU/cm2降低至3.490.02 lgCFU/cm2。超声微泡增强了万古霉素在体内对表皮葡萄球菌生物膜的抑菌作用，且对动物无明显危害Wang(2018)42体外生物被膜耐甲氧西林金黄色葡萄球菌40 kHz/0.092.36 W/cm2/单次或3次每天，5或15 min万古
32、霉素利奈唑胺左氧氟沙星多次LFU联合万古霉素处理对MRSA生物膜具有协同杀菌作用，协同作用表明万古霉素具有浓度依赖性，但在所有单次LFU组合组中均未观察到协同作用。多次LFU联合抗菌药物组合对MRSA生物膜的协同作用优于单次LFUFu(2019)43体外生物被膜鲍曼不动杆菌1 MHz/3 W/cm2/5 min多黏菌素B负载脂质体LFU微泡法与2 g/mL多黏菌素B联合可以完全消除生物膜中的活菌并达到最大的抗菌效果Hou(2019)44体外生物被膜超广谱-内酰胺酶大肠埃希菌42 kHz/0.66 W/cm2/30 min妥布霉素LFU联合妥布霉素处理后生物膜的细菌活力明显下降，抑菌圈直径明显增
33、大，联合处理后生物膜的形态结构发生了显着变化，特别是在减少厚度和松散结构方面。LFU和妥布霉素的组合可以对大肠杆菌形成的生物膜发挥协同杀菌作用Yang(2019)45体外生物被膜 体内大鼠模型白色念珠菌42 kHz/0.6 W/cm2/15 min负载两性霉素B的聚乳酸-乙醇酸共聚物纳米颗粒连续7 d用LFU和两性霉素B联合治疗后，生物被膜的载菌量显着减少，扫描电子显微镜图像显示导管表面的生物膜基本消除，生物膜的形态也发生了显着变化，特别是在减少厚度和松散结构方面Liu(2020)46体外生物被膜肺炎克雷伯菌40 kHz/0.092.36 W/cm2/单次或3次每天，5 min美罗培南 替加环
34、素 磷霉素 阿米卡星 多黏菌素在单次LFU或多次LFU与美罗培南、替加环素和磷霉素组合中观察到协同效应。然而，阿米卡星和多黏菌素与单次LFU或多次LFU均未显示出协同作用。单次LFU和磷霉素组合仅在超声后显着降低细菌计数，而多次LFU可将协同作用延长至24 h。LFU与抗菌药物联用对肺炎克雷伯菌生物膜具有协同作用，与单次LFU相比，多次LFU可能延长协同作用效果中国抗生素杂志2023年8月第48卷第8期.874.物膜的协同作用优于单次LFU46。另外，人-防御素3抗菌肽对于葡萄球菌具有杀菌效果，LFU可以通过同时促进细菌相关基因表达来增强人-防御素3活性，从而抑制葡萄球菌耐药基因的表达，在80
35、 kHz时体内外都有明显的协同杀菌作用37-38。LFU协同杀死有生物被膜的细菌，一是可能增加了细胞的通透性，提高了抗菌物质通过生物膜的效率；二是LFU作用后的局部温度升高和细胞内活性氧的产生增多。3.3 促进植入物抗菌药物释放临床植入物的的使用越来越广范，心脑血管和骨科每年有大量的手术都涉及医疗器械植入人体，这就导致这些“外来品”容易造成局部或全身感染，并且细菌在植入物表面更易形成生物被膜。近年来，人们致力于通过制备生物相容性材料来抑制细菌及生物被膜的形成，以防止或减少生物被膜的感染。其中一种策略是在器械或材料中加入抗菌药物，通过药物缓慢释放来预防植入部位的细菌感染以及生物被膜的形成，当感染
36、发生时，LFU可促进这些预制抗菌药物的加速释放而起到积极的效果47。目前相关研究主要集中在体内外模拟预制骨水泥抗菌药物的释放，而主要的病原菌和临床感染相似，以常见的金黄色葡萄球菌为主(表3)。Cai等51模拟髋关节置换术预制万古霉素丙烯酸骨水泥，置入家兔髋关节部位，然后人为造成金黄色葡萄球菌急性感染，加用LFU后测量髋部抽取物的细菌载量，LFU组012 h的髋部抽吸物菌量减少了1.62 lg CFU/mL，LFU组1224 h的髋部抽吸物菌量减少了2.77 lg CFU/mL。LFU增强骨水泥抗菌效果可能归因于促进释放的药物浓度始终高于最低抑菌浓度，以及超声引起的相关生物声学效应。在预防植入物
37、葡萄球菌引发的感染主要以预制万古霉素和庆大霉素骨水泥为主50,55，而对于革兰阴性菌大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的植入物感染，LFU主要联合环丙沙星或庆大霉素48-49，LFU可促进相应抗菌药物的释放，使得水凝胶上的生物膜累积量显著减少。LFU的这种可靶向或控制药物释放能力，使得在感染发生时能够低频超声在抗感染领域的应用现状 闫开成等表3 LFU促进植入物抗菌药物释放Tab.3 LFU promotes implant antibiotics release作者(年)研究类型病原菌频率/强度/作用时间联合药物结果Norris(2005)48体外水凝胶聚合物基质研究铜绿假单胞菌43 kHz/20 m
38、in环丙沙星与对照组中生物膜生长状态相比，LFU促进环丙沙星的释放，使得水凝胶上的生物膜累积量显着减少Ensing(2005)49体内骨水泥兔模型大肠埃希菌28.48 kHz/0.167 W/cm2/2472 h 占空比1:3庆大霉素LFU联合庆大霉素的应用降低了所有3组中生物膜的活力，减少幅度在58%69%之间，而组织病理学检查未见皮肤损伤Ensing(2006)50体外骨水泥研究大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 凝固酶阴性葡萄球菌 铜绿假单胞菌46.5 kHz/0.167 W/cm2/40 h 占空比1:3庆大霉素 庆大霉素+克林霉素与不应用超声的抗菌药物释放相比，LFU促进抗生素骨水泥的抗菌药
39、物释放，会降低浮游生物和生物膜细菌的活力Cai(2007)51体内骨水泥兔模型金黄色葡萄球菌46.5 kHz/0.3 W/cm2/12 h 占空比2:1万古霉素LFU组012 h的髋部抽吸物菌量减少为1.62lg CFU/mL，LFU1224 h的髋部抽吸物菌量减少为2.77lg CFU/mL。超声增强骨水泥抗菌效果可能归因于高于最低抑菌浓度的时长和超声引起的生物声学效应Yan(2007)52体外丙烯酸骨水泥研究 体内骨水泥兔模型金黄色葡萄球菌25 kHz/0.1-0.3 W/cm2/30 min万古霉素与体外对照相比，LFU使药物洗脱增加了2.57%27.44%。体内LFU组治疗感染的髋关节
40、细菌活力降低，炎症减轻，万古霉素的尿液消除增加109.56 mgLin(2015)53体外聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥研究 体内骨水泥兔模型金黄色葡萄球菌1 MkHz/0.3 W/cm2/424 h 占空比3:10万古霉素体外研究表明，万古霉素+超声+微泡组洗脱的万古霉素对浮游金黄色葡萄球菌的作用明显优于其他任何研究组。体内研究表明，植入万古霉素+超声+微泡圆柱体后存活的金黄色葡萄球菌的存活数显着低于其他每个研究组Shi(2018)54体外磷酸钙骨研究金黄色葡萄球菌46.5 kHz/0.3 W/cm2/120 min万古霉素LFU组各时间点万古霉素浓度及累积释放率均高于对照组。LFU组万古霉素浓度超
41、过最低抑菌浓度水平的持续时间显着延长Shi(2018)55体外磷酸钙骨研究金黄色葡萄球菌46.5 kHz/0.2 W/cm2/24h 占空比1:3庆大霉素LFU组各时间点庆大霉素瞬时浓度和累积释放百分比均高于对照组。与对照组相比，LFU组庆大霉素浓度超过最低抑制浓度水平的持续时间显着延长.875.使预制骨水泥大量释放抗菌药物，局部药物浓度高于最低抑菌浓度，有效杀灭感染菌，此外，LFU可以更有效地让药物透过深层组织，发挥更大疗效。3.4 临床应用LFU作为一种新型的物理辅助抗感染手段，目前研究大多处于体外和动物实验阶段，临床研究主要集中在表皮清创术后的康复和慢性伤口愈合，具有减少抗菌药物的使用时
42、间、降低感染复发率和促进组织再生等功效。相关研究主要以临床病例回顾性为主，主要针对葡萄球菌，抗菌药物全身使用，部分是局部协同用药，LFU局部治疗时间一般较长，3个月左右(表4)。表4 LFU的临床应用Tab.4 Clinical applications of LFU作者(年)研究类型病原菌频率/强度/作用时间联合药物结果Breuing(2005)56病例报告耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 嗜麦芽单胞菌 棒状杆菌25 kHz/每天2次，共3个月17个不同类型的伤口随访至少3个月，9个伤口(47%)基本愈合或清创程度足以进行皮肤移植或皮瓣手术，6例(29%)伤口愈合大于50%，其余2个伤口(1例镰状细
43、胞性贫血患者的1个伤口和1例静脉瘀血溃疡)愈合至原伤口面积的20%30%Carmo(2015)57队列研究表皮葡萄球菌 奇异变形杆菌 大肠埃希菌26 kHz/(167.7)d替考拉宁 左氧氟沙星 亚胺培南13名患者接受了超声清创治疗，而不用移除移植物(8例)或部分切除和假体移植物原位重建(5例)，LFU被证明是治疗感染移植物和医疗条件差的患者的有效方法Tewarie(2015)58病例回顾对照 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 大肠埃希菌25 kHz/3540 W/cm2/3 d一次LFU应用组较对照自术后抗菌药物使用时间较短，感染复发率较低，超声清创是治疗胸骨皮肤瘘感染的有效方法Tewarie(
44、2018)59病例回顾对照 65.2%革兰阳性菌 17.4%革兰阴性菌25 kHz/3540 W/cm2/3 d一次应用LFU 3次清创后，超声清创组95.7%的微生物培养结果为阴性，而对照组54.5%。超声组抗菌药物治疗时间和住院时间明显缩短。LFU清创系统是一种有效、微创技术来对抗伤口感染Tewarie等59回顾性对比了胸骨切开术后心脏手术患者胸骨皮肤瘘使用超声辅助治疗的效果，设定超声频率为25 kHz，强度3540 W/cm2，LFU辅助伤口组18人，常规治疗组19人，61%为革兰阳性菌，16.5%为革兰阴性菌，10.5%白色念珠菌，结果显示LFU辅助治疗组伤口愈合时间和患者住院时间明显
45、缩短，抗菌药物使用时间减少，感染复发率降低。LFU辅助伤口清创系统是一种能够破坏细菌生物被膜、优先清除坏死组织、减少细菌数量、减少出血量和相对无痛的清创方式。在胸骨深部感染及下肢血管移植术后感染，LFU辅助清除促进了表面和深部坏死物质的分离和脱落，而不损害周围正常的组织56-57。除了外科手术的优势外，LFU辅助技术在伤口清创和促进愈合等方面，将通过缩短住院时间和降低抗微生物治疗的时间来节约成本，提高疗效。4 总结根据近20年的体外和体内研究数据，可以得出LFU在对浮游菌和细菌生物被膜的联合治疗中起到了很好的辅助作用。对于含药植入物，LFU可以促进抗菌药物的释放，达到最佳疗效，但也有报道显示，
46、经LFU处理会降低负载万古霉素的丙烯酸骨水泥的界面剪切强度和稳定性60。另外，LFU与抗菌药物联合治疗的临床应用可能还有很长的路要走，因为临床应用除了考察其有效性外，安全性是放在首位的，目前虽然对LFU的作用机制有一定了解，但作用频率、强度及应用时间在体外研究中尚存在很大差异，能够使用于临床的参数还需要进一步评估。人们对一种新生事物的研究总会经历一个漫长的过程，从理论到实践都是必经之路，从目前来看，LFU这一物理抗感染手段在未来应对细菌耐药及抗生物被膜是很有前景的。参 考 文 献1 Kong Q,Yang Y.Recent advances in antibacterial agentsJ.B
47、ioorg Med Chem Lett,2021,35(6):127-134.2 Wang Y,Li H,Xie X,et al.In vitro and in vivo assessment of the antibacterial activity of colistin alone and in combination with other antibiotics against Acinetobacter baumannii and Escherichia coliJ.J Glob Antimicrob Resist,2020,20(3):351-359.3 Maszewska A,M
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49、egiesJ.Diagn Microbiol Infect Dis,2015,81(3):192-200.5 Schoellhammer C M,Srinivasan S,Barman R,et al.Applicability and safety of dual-frequency ultrasonic treatment for the transdermal delivery of drugsJ.J Control Release,2015,202(37):93-100.6 Fellinger K S J.Klinik and therapies des chromi-schen ge
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