1、中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023，39（8）：1522-1528杂志网址：http:/低氧预处理间充质干细胞来源外泌体的应用进展*卓海涛1，张浩群1，赵贵芳1，2（1广州医科大学附属第六医院，清远市人民医院，广东 清远 511518；2吉林医药学院病理学教研室，吉林 吉林 130013）Advances in application of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cell-derived exosomesZHUO Haitao1，ZHANG Haoqun1，ZHAO Guif
2、ang1，2（1The Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Qingyuan Peoples Hospital，Qingyuan 511518，China；2Department of Pathology，Jilin Medical University，Jilin 130013，China.E-mail：Z）ABSTRACT Mesenchymal stem cells（MSCs）primarily secrete physiologically functional exosomes via paracrine
3、 effects that act on various adjacent and distant cells，thus exerting their therapeutic effects.In recent years，hypoxic preconditioning，as a novel MSC culture mode，has emerged as a research hotspot.Many previous studies have shown the role and underlying regulatory mechanisms of hypoxic precondition
4、ing in various diseases，which has provided sufficient reference materials for the MSC research field.Therefore，this review summarizes the progress in application of hypoxia-preconditioned MSC-derived exosomes that substantially increases and improves the biological activity of specific molecules，suc
5、h as microRNA.关键词 低氧预处理；间充质干细胞；外泌体；微小RNAKEY WORDS hypoxic preconditioning；mesenchymal stem cells；exosomes；microRNA中图分类号 R54；R741 文献标志码 A doi：10.3969/j.issn.1000-4718.2023.08.022间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种具有自我更新和分化特性的多能细胞，分布于人体许多部位，包括骨髓、脂肪组织、牙髓、脐带和胎盘等。干细胞疗法已经在许多临床前研究中得到了很好的证明，但其植入率低、植入副作用多
6、的弱点促使人们寻找改进方法。外泌体是目前干细胞领域较热门的方向之一。外泌体是直径 30150 nm的生物纳米囊泡，由不同类型的细胞分泌，含有信使分子，包括编码和非编码RNA，可以调节细胞近端和远端的功能1。“近端”指的是细胞内部的功能，例如代谢和信号传递等生物过程；而“远端”指的是细胞外部的功能，例如细胞间通讯和组织修复等过程。因此，间充质干细胞来源外 泌 体（mesenchymal stem cell-derived exosomes，MSC-Exos）的作用是调节和影响细胞内部和外部的功能，以维持组织稳态和促进组织修复，同时也具有与邻近区域和远程区域内的多种细胞类型相互作用以引发适当的细胞
7、应答的能力。尽管外泌体因具有低毒性、高稳定性、低免疫原性和高效转运供体细胞等特性2，但外泌体的治疗用途因其来源细胞有限和分泌成分不同而受到阻碍。因此，如何有效优化MSC-Exos的治疗作用，是当前MSC-Exos应用领域所遇到的科研瓶颈。近年来的研究提示，低氧预处理MSCs是一种有效的策略，可以通过旁分泌作用释放文章编号 1000-4718（2023）08-1522-07 收稿日期 2022-11-28 修回日期 2023-06-08*基金项目 广东省中医药局科研项目（No.20231411）；吉林省科技厅项目（No.20210101216JC）；清远市科技计划项目（No.2022KJJH02
8、6）；广州医科大学2023-2024年度大学生科技创新项目（No.2022A144）通讯作者 Tel：15943011466；E-mail：Z1522具有更多生物功能的外泌体，从而调节其治疗潜力。根据组织来源不同，预设置MSCs培养所需的低氧浓度，在规定时间内提取经低氧预处理MSCs所得到的外 泌 体，称 为 低 氧 MSC-Exos（hypoxic MSC-Exos，HypMSC-Exos）。本文就 HypMSC-Exos 的应用进展进行综述。1 HypMSC-Exos概述外泌体是直径 30150 nm 的脂质双层囊泡，携带的物质包括脂质、代谢物、蛋白质、微小RNA（microRNA，miR
9、NA，miR）、mRNA、长链非编码 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）和DNA3。早期研究表明，HypMSC-Exos增加了几种重要的细胞因子如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子的mRNA表达和分泌，但值得一提的是，这种低氧预处理方式不会对任何其他细胞因子的释放产生不利影响4。后期有研究表明，低氧预适应增加了MSC-Exos对未来低氧损伤组织的保护因子，例如低氧诱导因子 1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）、血管生成因子（VEGF、血管生成素 1
10、和红细胞生成素）、生存蛋白（P65、P50和P105）和抗凋亡蛋白（Bcl-xL和Bcl-2）的表达5。目前大量研究显示，低氧预处理MSCs调节了特定分子的表达并增强了 MSC-Exos的治疗效果，其中miRNA由于在基因表达调控上有着重要作用而受到更多的关注。有研究显示，与常氧外泌体相比，HypMSC-Exos中有 215个 miRNA 上调，369个miRNA表达下调6-7。其中，HypMSC-Exos显著增加了具有确切功能的miRNA的表达，提示miRNA可能发挥联合作用8。因此，这些研究提示外泌体中的miRNA在细胞内信号传递、运输和细胞体外治疗中发挥重要作用9-10。2 低氧预处理M
11、SCs的条件大量证据表明，MSCs的特性会受到环境条件变化的影响，大气中的氧气浓度可能会导致细胞DNA损伤并导致遗传不稳定11，从而可能导致治疗效果的差异。在体外培养过程中，MSCs通常暴露在常氧（21%O2）条件下。然而，已知MSCs在人体内处于低氧生态位，大多数MSCs存在于体内氧气含量为2%8%（甚至更低）的环境中12。因此，低氧环境下培养MSCs会更接近其生理环境。越来越多证据表明，将MSCs保持在低氧分压下可能有助于保持它们的特性，并提高治疗潜力。例如，氧气供应减少是受损组织的一种常见情况，MSCs一旦迁移到缺氧区，其旁分泌效应就会产生大量的治疗性旁分泌因子来修复受损的组织13。另外
12、，有研究证明了在体外低氧预处理或激活 HIF-1的表达可减少体外培养的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）凋亡从而在BMMSCs移植后的存活中起重要作用14。因此，低氧预处理可通过改善MSCs的生长环境以及促进MSCs分泌更多具有生理功能的外泌体来发挥治疗作用（图1）。3 HypMSC-Exos的作用3.1促进血管生成与修复研究显示，HypMSC-Exos在血管生成与修复领域中起到了重要的作用，其机制可能是通过改变 miRNA 和蛋白质组谱并调控多个信号通路来促进血管生成与修复。一项早期的研究显示低氧预处理可以增强低氧脂肪间充质
13、干细胞来源外泌体（hypoxic adipose mesenchymal stem cell-derived exosomes，HypADSC-Exos）对移植脂肪组织新生血管的促进作用15。基于这一实验结果，对HypMSC-Exos的组成进行检测，结果显示低氧环境通过改变 MSC-Exos的蛋白质组图谱来增强其血管生成潜能16。目前大量研究显示，HIF-1 或 VEGF13信号通路是HypMSC-Exos增强血管生成作用的下游靶点通路，其关键信号分子和上游信号通路正在处于研究进程中。例如，HypMSC-Exos中高迁移率族盒蛋白1（high mobility group box 1，HMGB
14、1）上调表达，介导c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路激活，诱导HIF-1/VEGF的表达，从而促进血管Figure 1.Flow chart of hypoxic pretreatment of mesenchymal stem cells（MSCs）to produce hypoxic MSC-derived exosomes（HypMSC-Exos）.图1低氧预处理MSCs产生HypMSC-Exos的流程图1523生成17-18。另外，低氧黏膜MSCs的细胞外囊泡通过抑制肿瘤蛋白 53（tumor protein 53，Tp53）来介导m
15、iR-612的上调，并诱导HIF-1/VEGF通路的表达，从而促进人脑微血管内皮细胞的生成19。另外研究表明，HypADSC-Exo可能通过激活蛋白激酶A信号通路和促进 VEGF通路的表达而促进血管生成12。HIF-1是低氧环境下MSCs重要的转录因子，研究显示低氧条件可能通过HIF-1的作用介导miR-210和中性鞘磷脂酶2的激活来显著增强MSC-Exos的促血管生成作用2。然而，少数文章也报道了 HypMSC-Exos调控的其他信号通路。据报道，研究显示低氧预处理的人乳脱落牙齿干细胞来源的外泌体内let-7f-5p 和 miR-210-3p 表达上调，通过 let-7f-5p/AGO1（a
16、rgonaute RISC component 1）/VEGF 通 路 或 miR-210-3p/ephrinA3通路促进血管生成20，这表明它们可能成为HypMSC-Exos促血管生成治疗的一种新的信号通路。低氧预处理可以作为一种有效的方法来丰富MSC-Exos中的促血管生成因子，HypMSC-Exos可能通过上调 LOXL2（lysyl oxidase-like 2）、CXCR4（C-X-C chemokine receptor 4）和SDF-1（stromal cell-derived factor-1）的表达，促进血管生成16，但具体的分子机制仍需进一步研究。上述研究结果提示，HIF-
17、1可能在HypMSC-Exos在调节信号通路过程中发挥重要作用，但低氧如何调节MSC-Exos释放的机制还不完全清楚。总体而言，HypMSC-Exos可增强血管生成的效果，接下来应该将研究重心放在研究miRNA和蛋白质等分子的上下游信号通路调控机制上。3.2促进损伤心肌的修复心肌梗死后产生的心力衰竭负担仍然是临床实践中的一个主要问题。越来越多研究表明，HypMSC-Exos明显改善缺血心肌细胞凋亡，促进其重塑，并保护心功能。张蘋等21发现，低氧脐带间充质干细胞外泌体（hypoxic umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes，Hy
18、pUCMSC-Exos）明显促进了SD大鼠心肌梗死后损伤心肌的修复。目前在心肌损伤修复的机制研究中，HypMSC-Exos内miRNA和lncRNA的变化是重要的关键调控信号。低氧BMMSC外泌体（hypoxic BMMSC-derived exosomes，HypBMMSC-Exos）通过上调 miR-24 抑制急性心梗大鼠心肌细胞凋亡22。此外，HypMSC-Exos中的miR-125b-5p通过抑制P53和BAK1（BCL2 antagonist/killer 1）的表达来抑制心肌细胞凋亡，从而促进缺血性心脏修复23。另外，HypBMMSC-Exos内的miR-98-5p通过激活PI3K
19、/Akt信号通路介导靶向TLR4抑制心肌缺血再灌注损伤24。也有研究显示，HypMSC-Exos 上 调 表 达 lncRNA-UCA1 通 过 抑 制miR-873-5p 来激活 XIAP（X-linked inhibitor of apoptosis protein）发挥心脏保护作用25，提示外泌体 lncRNA-UCA1可能是一种很有前途的新生物标志物。此外，Liu 等26发现，HypUCMSC-Exo 可通过 PI3K/Akt/mTOR途径调节自噬，从而抑制低氧及血清剥夺诱导的心肌H9C2细胞凋亡。也有少量文章报道了HypMSC-Exos 对阿霉素诱导的心肌损伤的研究，HypMSC-E
20、xos 通 过 lncRNA-MALAT1/miR-92a-3p/ATG4a（autophagy related 4a cysteine peptidase）或Trx1（thioredoxin 1）/mTORC1 信号通路对抗阿霉素诱导的心肌细胞损伤及衰老，协助心脏恢复27-28，进一步体现了HypMSC-Exos对于急性心脏毒性的治疗潜力。综上所述，HypMSC-Exos是一种很有前途的组织缺血以及心脏毒性损伤的治疗方法，然而外泌体针对缺血心脏的特异性靶向仍然是一个挑战。3.3促进骨性修复与再生HypMSC-Exos 对激素性股骨头坏死29、生物活性纤维环修复30、肌腱-骨隧道愈合31等骨性
21、损伤中具有显著的治疗效果，然而促进治疗作用的确切分子机制还有待研究。Liu等32研究表明低氧环境可能通过 HIF-1的作用介导miR-126的上调从而显著提高了治疗骨折愈合的潜力。在软骨再生工程中，水凝胶包埋 HypMSC-Exos 通过上调 miR-205-5p 表达，激活 PTEN/AKT 通路途径促进软骨再生33，这提示 HypMSC-Exos 与silk fibroin水凝胶的复合在软骨再生中具有广阔的应用前景。同时，生物信息学分析表明，低氧预处理MSCs 来源细胞外囊泡可能通过 miR-18-3p/JAK/STAT或miR-181c-5p/MAPK信号通路刺激软骨细胞的增殖和迁移，抑
22、制软骨细胞的凋亡，从而促进软骨修复34。近期研究显示，HypADSC-Exos和肌腱细胞分泌的外泌体通过向细胞外基质释放再生介质，从而引发自分泌/旁分泌反应，保护肌腱基质免受损伤35。该研究还显示上述2种外泌体内一些mRNA和蛋白质水平存在动态平衡，参与了多种涉及细胞外基质的信号通路，值得人们进一步研究保护肌腱基质免受损伤的具体机制。综上所述，低氧预处理是优化 MSC-Exos治疗骨性修复与再生作用的一种有效而有前景的方法。3.4促进神经修复与再生神经损伤可导致严重的运动和感觉功能障碍，致残率和死亡率高。早期一项研究观察到HypMSC-Exos可促进小鼠局灶性脑缺血后脑重塑和神经功能恢复36。
23、然而，神经损伤的治疗策略在于小胶质细胞的极化转型，并抑制有害的过度神经炎症。目前已有研究表明，HypMSC-Exos在小胶质细胞的极化转型中起到更加有效的治1524疗效果，并为神经损伤领域提供了一个有前景的治疗靶点。例如：（1）HypBMMSC-Exos富含miR-216a-5p通过抑制TLR4/NF-B通路，激活PI3K/Akt信号通路，促进小胶质细胞从 M1 表型转变为 M2 表型37。（2）在 HypADSC-Exos中 lncRNA-Gm37494的表达上调，通过抑制 miR-130b-3p 和促进 PPAR 的表达而促进小胶质细胞 M1/M2 极化38。（3）HypADSC-Exos
24、通过传递circ-Epc1介导TREM2的表达，降低了miR-7703p的表达来改变小胶质细胞M1/M2极化，改善阿尔茨海默病小鼠的认知能力39。（4）HypADSC-Exos通过递送circ-Rps5包裹抑制miR-124-3p促进SIRT7的表达减轻急性缺血性卒中所致脑损伤并促进小胶质细胞 M1/M2极化40。与此同时，HypMSC-Exos在神经元损伤凋亡方面也显示较强的保护作用。例如：（1）HypBMMSC-Exos 通过抑制 NLRP3 炎症小体介导的 caspase焦亡来修复氧糖剥夺诱导的神经元损伤41。（2）HypADSC-Exos 内 miR-499-5p 通过负调控JNK3/
25、MAPK10/c-Jun信号通路在调节神经细胞凋亡中发挥关键作用，减少大鼠神经细胞的凋亡8。（3）HypUCMSC-Exos 内 circOXNAD1 通过包裹抑制miR-29a-3p，激活FOXO3a表达，提高神经元活力，抑制细胞死亡和炎症42。在材料工程中，HypMSC-Exos和3D-CS支架的联合使用可促进脑外伤后神经再生，同时可以抑制慢性神经炎症和神经细胞凋亡43。这提示在HypMSC-Exos治疗的基础上，再结合载体材料，是治疗脑外伤的一种新的思路。3.5促进皮肤损伤的修复皮肤创伤愈合不良可能危及生命，是世界范围内的重大公共卫生问题。在前期研究中，Qiu等44研究初步显示 MSC-
26、Exos对皮肤创面愈合具有更强的治疗作用，为皮肤损伤的无细胞治疗提供了一种有前景的策略。在皮肤损伤类型中，糖尿病难愈合性创面可因缺氧而引起持续性炎症和愈合延迟。HypADSC-Exos通过激活PI3K/Akt通路促进成纤维细胞的增殖和迁移，可加快糖尿病创面愈合速度，提高创面愈合质量，同时抑制炎症反应45。Zhang 等46研究表明，HypUCMSC-Exos 内miR-125b 上调通过靶向并抑制 TP53INP1（tumor protein p53 inducible nuclear protein 1）促进创伤愈合过程中内皮细胞的存活和迁移。此外，HypADSC-Exos 通过传递 cir
27、c-Snhg11 并激活 miR-144-3p/HIF-1 通路而促进糖尿病小鼠伤口愈合47。总之，HypMSC-Exos在糖尿病伤口愈合中有着探究价值的热点，提示下一步研究方向应放在探究 HypMSC-Exos更多的信号通路机制。3.6促进炎症的调控诸多研究证实，与常氧外泌体相比，HypMSC-Exos在调控炎症的基础研究上同样显示出更加积极的治疗效果。Yang等48研究显示，HypBMMSC-Exos能上调HIF-1的表达并激活超氧化物歧化酶抗氧化信号，以减轻顺铂的耳毒性，减轻过度的氧化应激反应。此研究表明，HypMSC-Exos对严重的氧化应激反应可能具有潜在的预防作用。HypBMSC-
28、Exo 内 上 调 miR-182-5p 通 过 调 节FOXO1/TLR4信号通路促进巨噬细胞极化，从而突出了HypMSC-Exos在肝再生中的治疗潜力49。最新研究显示，一方面 HypADSC-Exos 中上调 miR-216a-5p通过调节 HMGB1/TLR4/NF-B 轴促进巨噬细胞 M2型极化，减轻结肠炎的过度炎症50；另一方面通过HIF-1调控肠道上皮细胞活性氧积累、DNA损伤和免疫稳态，减轻溃疡性结肠炎的黏膜损伤51。这表明HypMSC-Exos是优化结肠炎治疗的一个有前途的途径。另外，Cao 等52进一步观察证实 HypADSC-Exos高度表达的mmu_circ_00012
29、95改善了脓毒症小鼠的结局并抑制脓毒症所致的肾损伤。此研究阐明了 MSC-Exos作为治疗脓毒症所致肾损伤的新靶点的可行性。4 总结与展望本文梳理了低氧预处理对MSC-Exo治疗作用的应用进展，大量研究表明HypMSC-Exos在促进血管生成与修复、心肌修复、骨性修复与再生、神经修复与再生等方面存在极大的治疗潜力（图2），提示探索低氧预处理MSCs的最佳条件是一种增强MSC-Exos生物学功能的有效策略，而这有助于提高外泌体治疗的效果。然而，低氧预处理在MSC-Exos中的应用仍处于起步发展阶段，仍存在许多问题需要解决。例如：（1）针对不同组织来源的MSCs，如何探索其最适的低氧浓度？（2）不
30、同组织来源的MSCs在相同低氧预处理条件下分泌的外泌体存在什么差异？是否在各种治疗中发挥的效果也不尽相同？（3）目前大部分研究 HypMSC-Exos 的实验仅在细胞水平上，HypMSC-Exos在动物实验中仍需要探究给药方式及剂量。（4）目前对HypMSC-Exos的研究多集中于其内含的miRNA，而其分泌的蛋白质、脂质和其他非编码RNA的生物潜能仍需要进一步阐明。（5）全身给药后，探究HypMSC-Exos对目的器官、组织及细胞的特异性靶向机制仍是一个挑战。此外，HypMSC-Exos作为纳米载体活性因子或小分子在组织工程和再生医学中可能发挥潜力，值得进一步探究。总之，深入探讨上述存在的相
31、关问题，将促进HypMSC-Exos在临床外泌体治疗疾病中更好的发挥其作用。1525参考文献1Lai RC，Yeo RW，Lim SK.Mesenchymal stem cell exosomes J.Semin Cell Dev Biol，2015，40：82-88.2Zhu J，Lu K，Zhang N，et al.Myocardial reparative functions of exosomes from mesenchymal stem cells are enhanced by hypoxia treatment of the cells via transferring mic
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36、W，Huang M，et al.Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease：role of exosomal microRNA transfer J.Circulation，2014，130（11 Suppl 1）：S60-S69.Figure 2.Molecular mechanisms of HypMSC-Exos regulation of related disease progression.HMGB1：high mobility group box 1；JNK：c-Jun N-term
37、inal kinase；HIF-1：hypoxia-inducible factor-1；VEGF：vascular endothelial growth factor；Tp53：tumor protein 53；PKA：protein kinase A；nSMase2：neutral sphingomyelinase 2；AGO1：argonaute RISC component 1；LOXL2：lysyl oxidase-like 2；CXCR4：C-X-C chemokine receptor 4；SDF-1：stromal cell-derived factor-1；PI3K：phos
38、phatidylinositol 3-kinase；TLR4：Toll-like receptor 4；ATG4a：autophagy related 4a cysteine peptidase；BAK1：BCL2 antagonist/killer 1；Trx1：thioredoxin 1；mTORC1：mammalian target of rapamycin complex 1；MARK：mitogen-activated protein kinase；JAK：Janus kinase；STAT：signal transducer and activator of transcripti
39、on；PTEN：phosphatase and tensin homolog；NLRP3：NOD-like receptor family，pyrin domain containing 3；Epc1：enhancer of polycomb homolog 1；TREM2：triggering receptor expressed on myeloid cells 2；SIRT7：sirtuin 7；FOXO3a：forkhead box O3；PPAR：peroxisome proliferator-activated receptor；TP53INP1：tumor protein p53
40、 inducible nuclear protein 1.图2HypMSC-Exos调节相关疾病进展的分子机制152610 Gray WD，French KM，Ghosh-Choudhary S，et al.Identification of therapeutic covariant microRNA clusters in hypoxia-treated cardiac progenitor cell exosomes using systems biology J.Circ Res，2015，116（2）：255-263.11 Estrada JC，Albo C，Benguria A，e
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