1、生态与农村环境学报，（）：收稿日期：基金项目：国家重点研发计划（）：苏一鸣，王英刚，蔺昕，等低温条件下恩诺沙星的微生物降解研究生态与农村环境学报，（）：，（）：低温条件下恩诺沙星的微生物降解研究苏一鸣，王英刚，蔺 昕，李晓军（沈阳大学环境学院，辽宁 沈阳；中国科学院沈阳应用生态研究所，辽宁 沈阳）摘要：在我国高纬度和高海拔地区，低温微生物污染介质的长期高效稳定修复的应用前景广阔，但特定场景下的菌种资源挖掘还处于初期阶段。以污染土壤中常见的喹诺酮类抗生素恩诺沙星为目标污染物，从低温地区畜禽粪便堆放地土壤中筛选得到 株恩诺沙星低温高效降解菌（，普罗威登斯菌属）、（，肠杆菌属）、（，普罗威登斯菌属）
2、、（，产碱杆菌属，嗜盐菌），并评估了这 种菌株的降解效率。结果表明，种菌株在中性或低碱环境（畜禽粪便堆放地）、的温度范围内均能生长；低温较常温条件下显著抑制了 株菌的生长和对恩诺沙星的降解。、条件下无菌对照组恩诺沙星的自然降解率分别为 、和。条件下，投加量 为的、和 对恩诺沙星的降解率在第天达到峰值，分别为 、和 。在 条件下，、和 对恩诺沙星的降解率在第 天达到峰值，分别为、和；则在第 天达到峰值。种菌株均可用于低温区恩诺沙星污染介质的修复。该研究可为我国高纬度和高海拔地区抗生素污染土壤修复提供技术支撑。关键词：畜禽粪便；恩诺沙星；低温降解菌；生物修复；土壤；降解中图分类号：文献标志码：文章
3、编号：（），（，；，）：，（），（），（）（），（），（），：；第 期 苏一鸣等：低温条件下恩诺沙星的微生物降解研究 恩诺沙星（，）是一种人工合成的动物专用喹诺酮类抗生素，具有抗菌谱广、活性强等特点，常用于畜禽感染性疾病的预防和治疗。进入畜禽体内的抗生素不会被全部吸收，约有会随着尿液或粪便排出至环境中。是一种两性分子（，），正常环境下亨利定律常数极低，挥发损失可忽略不计，但其辛醇水分配系数（）较低，易在土壤中积累和迁移，检出率高，威胁生态系统安全。研究发现，在我国畜禽粪便中最常检出的抗生素为喹诺酮类，其中猪粪中 平均检出含量达 。我国农田土壤中 的检出率高，残留含量范围为 ，均值介于 之间，最
4、大值接近澳大利亚农田土壤标准值（）的 倍。长三角典型城郊地区农田、林地和园地的 检出率高达 以上，农田的检出率达。邰义萍等调查了东莞市 个区镇 个代表性蔬菜基地土壤中喹诺酮类抗生素的含量，结果表明 种喹诺酮类抗生素的检出率均在 以上，以恩诺沙星（平均含量 ）为主，部分含量超过了抗生素生态毒害效应触发值（）。邰义萍等研究珠江三角洲地区长期施用粪肥的无公害蔬菜生产基地发现，土壤中喹诺酮类抗生素平均含量为 ，恩诺沙星的检出率为，平均含量为 。微生物修复是解决土壤抗生素污染问题的有效手段。王强锋等从重金属污染的土壤中分离筛选出 株能降解土霉素、诺氟沙星、磺胺二甲嘧啶的真菌菌株，其中菌株 在初始质量浓度
5、为 、条件下避光培养 后，对土霉素和诺氟沙星的降解率分别达到 和 。等从加拿大土壤中分离出有效降解磺胺二甲嘧啶的微杆菌（）菌株。研究发现，苍白杆菌属（）、双头菌属（）和戈登氏菌属（）对磺胺甲恶唑的降解率为 ；而从菜地土壤中分离得到的埃希氏菌属（）和假丝酵母属（）对强力霉素的降解率分别高达 和 。史艳可研究发现，菌株 培养 后，对土霉素的平均降解率可达 。可以看出，微生物能够有效降解抗生素，但目前针对低温条件下的菌株筛选和评估工作还不多见。我国北方地区秋冬季气温低，持续时间长，较大限制了中高温菌的应用，因此增强低温降解菌的研究对于低温地区的土壤抗生素污染治理具有重要意义。邢慧珍研究发现，菌株 的
6、最适生长温度为 ，培养 后秸秆降解率为 ，时达 。郭平筛选出 株低温石油降解菌，均能在 降解石油烃，其中菌株 在 、原油初始质量浓度为、菌液接种量 条件下降解 后生物降解率可达 。畜禽粪便堆放地土壤通常具有较高的含盐量和抗生素含量，因此筛选耐盐的恩诺沙星降解菌十分必要，目前关于适应北方低温耐盐环境的恩诺沙星降解菌还鲜见报道。笔者以污染土壤中常见的喹诺酮类抗生素恩诺沙星为目标污染物，利用低温地区畜禽粪便堆放地土壤，筛选出恩诺沙星低温高效降解菌，在明确降解菌的生长和降解特征基础上，研究低温对菌株生长和恩诺沙星降解能力的影响，为适用于北方低温地区抗生素污染土壤生物修复技术的构建提供基础。材料与方法
7、实验材料 试剂与培养基无机盐（）培养基：水、（）、葡萄糖，值为 。培养基：水、胰蛋白胨、酵母粉、，值为 （固体培养基加 琼脂）。恩诺沙星储备液：准确称取恩诺沙星标准品 ，用（乙腈）（水）超声溶解并定容于 容量瓶中，配制成 为 的恩诺沙星标准液，在 冰箱中避光保存，个月内使用。实验中用到的各浓度梯度标准液（）均用甲醇（甲酸）稀释。低温恩诺沙星降解菌的筛选考虑到高纬度和高海拔地区的低温特点，采集辽宁省海城市和青海省西宁市某畜禽养殖场粪便堆放区土壤，应用梯度驯化培养技术，分离筛选出低温高效恩诺沙星降解菌。称取 冷鲜土样置于装有 无机盐（）培养基的锥形瓶中，按 接种量进行梯度驯化培养，将恩诺沙星储备液
8、稀释至 后，加入培养基各 、，使培养基中恩诺沙星浓度分别为、，生 态 与 农 村 环 境 学 报第 卷、避光振荡，依次培养 。经 次梯度培养后，选择 浓度下能够耐受恩诺沙星的混合菌液转接到含有 恩诺沙星的固体 培养基上进行划线培养，避光条件下每隔 对生长出来的微生物进行转接，共转接 次，使得培养基中菌株得以分离纯化，最终获得若干单一菌株。将分离纯化的单一菌株以 接种量接种到恩诺沙星含量为 的 培养基中进行降解实验，、避光振荡培养 ，测定培养基中恩诺沙星的含量，最终筛选出 株恩诺沙星高效降解菌、用于后续实验。上述菌株经上海生物工程有限公司鉴定，为普罗威登斯菌属（），为肠杆菌属（），为普罗威登斯菌
9、属（），为产碱杆菌属（）。菌株生长和降解特征 菌株的生长曲线向 液体培养基中加入 种菌悬液 （不投加恩诺沙星），、避光振荡培养 ，分别在、取样测定菌液浓度。值对菌株生长的影响针对 种菌株，向 液体培养基中加入菌悬液各 ，每株菌利用 或 溶液再设置不同的 值处理（、），每种处理均设置 个重复，、避光振荡培养，由菌株生长曲线可知，培养 菌液 达到峰值，因此培养 后取样测定 种菌株在不同 值处理浓度菌液下的。菌株对恩诺沙星的降解能力考虑到北方秋冬季气温在 以下，因此测定 环境下菌株对恩诺沙星的降解能力。向 液体 培养基中加入恩诺沙星标准储备液 ，使恩诺沙星的浓度为 ，再加入 种菌悬液 ，、避光振荡培
10、养，为排除细菌吸附作用对恩诺沙星浓度的影响，分别设置不接菌的培养基和灭活菌液的对照处理，分别在、取样测定培养基中恩诺沙星的含量，每个处理设置 个重复。低温对菌株生长及其对恩诺沙星降解能力的影响 低温对菌株生长的影响向 液体 培养基中加入 种菌悬液，在、温度下，避光振荡培养 ，分别在、取样测定菌液浓度，直到菌株死亡，每种处理设置 个重复。低温对菌株恩诺沙星降解能力的影响鉴于实际水体中恩诺沙星的检出量多在 以下，因此选择 为恩诺沙星初始浓度。向 液体 培养基中加入恩诺沙星标准储备液 ，使恩诺沙星的质量浓度为，再加入 种菌悬液 ，分别在、温度下 避光振荡培养，不接菌的空白培养基作为对照。由低温对菌株
11、生长的影响结果可知，种菌液在培养 时菌液浓度 达到峰值，对恩诺沙星的降解效果最好，因此选在第 天取样测定培养基中恩诺沙星的浓度，每个处理设置 个重复。样品检测与分析菌液浓度（）测定：用分光光度计测定细菌培养液在 处的吸光值（）。超过，则稀释适当倍数后测定。样品前处理：实验样品取样测定时，取 摇匀的待测菌液，用 孔径无菌滤膜过滤至 液相进样瓶中，避光保存于 冰箱。恩诺沙星浓度测定：利用超高效液相三重四级杆质谱联用仪（，美国 ）进行测定。色谱条件：采用 （，）色谱柱，柱温 ，柱平衡时间 ，流速 ，进样量 。流动相为 乙酸铵溶液（含 甲酸）乙腈，梯度为 （相，相）、（相，相）、（相，相）、（相、相）
12、、（相、相）。质谱条件：采用三重四级杆质谱检测器、电喷雾离子源（）、多反应离子监测（）模式。辅助气体 ，喷雾电压 ，气帘，蒸汽温度 ，恩诺沙星母离子 为 ，子离子 为 ，碰撞电压，锥孔电压 。在 浓度范围内基准曲线的 ，回收率测定采用实际样品加标的回收率，测得加标回收率为 ，相对标准偏差（）低于，空白对照组中均未检出恩诺沙星。数据处理方法恩诺沙星降解率（）计算公式为 第 期 苏一鸣等：低温条件下恩诺沙星的微生物降解研究（）。（）式（）中，为接菌处理的恩诺沙星浓度，；为 不 接 菌 对 照 处 理 的 零 时 恩 诺 沙 星 浓 度，。运用单因素方差分析（）比较各数据间的差异性，所有统计分析均在
13、 中完成，运用 进行图表绘制，图表中数据为平均值标准差。结果与分析 菌株的特征 菌株的生长特征图 表明了 种菌株在 条件下培养的生长过程差异。种菌株的生长过程均经历先上升后达到稳定的过程，同一菌株不同培养时间 具有显著性差异（）。不同菌株达到稳定的时间存在差异，和 菌生长极为迅速，接近稳定期，分别达到峰值 和 ，随后略有下降，但两者间无显著性差异（）；菌初期生长速率显著低于 和（），接近稳定期，达到峰值 ；菌培养初期生长速率极为缓慢，显著低于其他 株菌（），接近稳定期，达到峰值 ，显著高于其他 株菌（），随后略有下降。图 种菌株的生长曲线 培养基 值对菌株生长的影响图 表明了 值对 种菌株生长
14、的影响。在 范围内，、的生长不受 值的影响，值在不同 值间无显著性差异（）。的生长状况优于，其 值显著高于。更适于中性偏碱性环境，其 值在 的处理之间无显著差异，在酸性环境中的值显著低于碱性环境，且 值越低，其 值越低。更适于中性环境，其在 时生长良好，达到 ，酸性和碱性环境中的 值显著小于 时的 值，且碱性越强，受抑制程度越强。直方柱上方英文大写字母不同表示同一菌株不同 值间差异显著（）；英文小写字母不同表示同一 值不同菌株间 差异显著（）。图 种菌株在不同 值的 菌株对恩诺沙星的降解图 表明了 条件下灭活菌株的对照组对恩诺沙星的吸附能力，随着培养时间的增加，灭活后的 和 对恩诺沙星的吸附率
15、具有显著差异（），和 对恩诺沙星的吸附率则无显著变化，其中 在培养 达到峰值 。可以看出，培养过程中 种菌株对恩诺沙星的吸附作用并不明显。直方柱上方英文大写字母不同表示同一菌株不同降解时间吸附率差异显著（）；英文小写字母不同表示同一降解时间不同菌株间吸附率差异显著（）。图 条件下 种灭活菌株对恩诺沙星的吸附能力 种菌株对恩诺沙星具有较好的降解能力，对恩诺沙星的降解率随培养时间的增长呈上升趋势。图 表明了 条件下 种菌株对恩诺沙星的降解过程。在 培养过程中，不接菌对照处理中恩诺沙星含量有所下降，自降率为 。、生 态 与 农 村 环 境 学 报第 卷 对恩诺沙星的降解率在 达到最高，分别为、和 ；
16、对恩诺沙星的降解率则在 达到最高，为 ，显著高于其他 株菌（）。可以看出，在整个降解过程中 和 对恩诺沙星具有更好的降解能力，其中 在培养的前期降解能力更强，而 在培养的后期降解能力不断提升。低温对菌株生长及恩诺沙星降解的影响 不同低温条件下菌株的生长情况与图 的生长曲线对比可知，恩诺沙星抑制了菌株的生长。株菌在 的温度范围内均能生长，但低温会在生长前期显著抑制微生物生长。温度越低，菌株前期生长越缓慢。条件下 株菌生长迅速，的菌密度显著高于 和 。以后 株菌不同温度之间的生长状况趋于一致（图）。直方柱上方英文大写字母不同表示同一菌株不同降解时间降解率差异显著（）；英文小写字母不同表示同一降解时
17、间不同菌株间降解率差异显著（）。图 条件下 种菌株对恩诺沙星的降解能力 图 低温对 种菌株生长的影响 不同菌株对低温的响应特征不同。和 生长特征趋于一致，和 条件下生长速度均显著低于 。时 个温度条件下的菌密度趋于一致。和 不同温度下的生长规律相似，但 个温度下 的 均在 达到最大值，随后持续下降，且 个温度下的 依然存在显著差异（）；而 的 值在、和 达到峰值的时间点分别为、和 ，后 和 的 值无显著差异。不同低温条件下恩诺沙星的降解情况图 表明不同低温条件培养 后菌株对恩诺沙星的降解情况（不包含自然降解率）。、条件下无菌对照组恩诺沙星的自然降解率分别为 、，说明低温抑制了恩诺沙星的非生物降
18、解，同时低温显著抑制了菌株对恩诺沙星的降解效果，温度越低降解效果越差。但即使在低温情况下，菌株对恩诺沙星依然有降解效果。条件下，、和 对恩诺沙星的降解率在 第 期 苏一鸣等：低温条件下恩诺沙星的微生物降解研究 达 到 峰 值，分 别 为 、和 。讨论 菌株的特征要实现污染物的微生物降解，微生物必须具备 个条件：能够接触到污染物和能够降解污染物。而要实现持续高效降解，则需要微生物降解目标污染物的效率高并保持足够的量。研究结果表明，条件下、生长极为迅速，接近稳定期，达到峰值，随后略有下降。向培养基投加 恩诺沙星后明显抑制了菌株的生长。菌培养 后 达到峰值 ，显著高于其他 株菌。直方柱上方英文大写字
19、母不同表示同一菌株不同温度条件降解率差异显著（）；英文小写字母不同表示同一温度条件不同菌株间降解率差异显著（）。图 低温对 种菌株的恩诺沙星降解的影响 要实现高效降解微生物的现场应用，构建合适的复合菌剂是低温条件下提高降解效率的有效途径。研究发现，、菌的生长趋势相似，存在拮抗关系；但两者与 和 菌的生长速率具有差异性，且均能在低温下生长，对恩诺沙星耐性良好。韩婉雪等研究发现，畜禽粪便堆放地土壤属于中性或偏碱环境。该研究的目的是筛选出适于该环境的降解菌，同时明确筛出菌对 值的适应区间。结果表明，在 时，、的生长不受 值的影响，更适于中性偏碱性环境，更适于中性环境，说明 种低温菌株在畜禽污染场地具
20、有应用潜力。因此，可以考虑将、菌组合成复合菌系，以达到对恩诺沙星更好的降解效果。过去关于微生物降解恩诺沙星的研究多适用于常温条件。梅瀚杰等研究发现，菌株 在 、初始 、接种量、条件下可使恩诺沙星的降解率达到 。潘兰佳等利用嗜热菌 在高温（）条件下降解 种典型的喹诺酮类抗生素（诺氟沙星和恩诺沙星），降解率为。谷雪维研究发现，周丛生物膜对于恩诺沙星具有良好去除效果，去除率均在 以上。王振方等以绿藻门的胶网藻（）为对象，通过 室内培养实验，发现胶网藻对于恩诺沙星的去除具有显著促进作用。可以看出，目前针对低温条件下的恩诺沙星降解菌还不多见。在该研究中，筛选出的 株菌在 时对恩诺沙星均有较好的降解能力。
21、对恩诺沙星的降解率随培养时间的增长呈上升趋势，、对恩诺沙星的降解率在 时达到最高，分别为 、；对恩诺沙星的降解率则在 时达到最高，为。条件下，、和 对恩诺沙星的降解率在 时达到峰值，分别为 、和 。低温对菌株生长及恩诺沙星降解的影响温度是影响菌株生长和菌株发挥降解作用的重要因素，尤其在高纬度地区温度严重影响着微生物的降解速率。目前在微生物修复中高温菌占主体，而在我国北方地区寒冷而漫长的冬季，低温会强烈抑制中高温菌对污染物的降解效率。低温显著抑制了菌株对恩诺沙星的降解效果，温度越低降解效果越差，但即使在 条件下，与不接菌对照相比，菌株对恩诺沙星依然有降解效果。许多学者也从其他低温环境中分离出低温
22、降解菌，马文成等从冬季活性污泥中筛选得到具有高生物活性的耐冷细菌，张鑫等筛选得到的复合菌系 在 条 件 下 能 够 高 效 降 解 玉 米 秸 秆。等从 个北极土样和 个高纬度北方土样中分离出对有机物具有高效降解率的优势菌株。以上结果表明，增强低温降解菌的研究对于我国低温地区的土壤污染治理具有重要意义。结论微生物降解可以有效降低抗生素生态环境风险。低温微生物对恩诺沙星具有降解作用，即使在 条件下，株菌对恩诺沙星的降解率依然达到以上，但总体随着温度降低降解效果削弱。其中 菌株和 菌株在低温条件下（）对恩诺沙星具有更好的降解能力，在培养前期降解能力更强，而 在培养后期降解能力不断提升，这为我国北方
23、和高纬度地区抗生素污染土壤修复提供了一定的技术支撑。生 态 与 农 村 环 境 学 报第 卷参考文献：，（），（）：，（）：，：，：，（）：蓝贤瑾，刘益仁，吕真真，等氟喹诺酮类抗生素在我国农田土壤中残留及其风险研究进展江西农业学报，（）：，（）：，（）：赵方凯，陈利顶，杨磊，等长三角典型城郊不同土地利用土壤抗生素组成及分布特征环境科学，（）：，（）：邰义萍，莫测辉，李彦文，等长期施用粪肥土壤中喹诺酮类抗生素的含量与分布特征中国环境科学，（）：，（）：邰义萍，莫测辉，吴小莲，等绿色和有机蔬菜基地土壤中喹诺酮类抗生素的污染特征农业环境科学学报，（）：，（）：王强锋，朱彭玲，夏中梅，等三种农用抗生素
24、降解真菌的筛选及其降解性能农业资源与环境学报，（）：，（）：，：，：，：史艳可土霉素高效降解菌 的降解特性及耐药性初探杭州：浙江农林大学，：，邢慧珍玉米秸秆低温降解菌的筛选及复合菌系构建天津：河北工业大学，：，郭平海洋低温石油降解菌筛选与细菌群落对石油污染响应研究大连：大连海事大学，：，赵慧男集约化蔬菜种植区土壤中喹诺酮类抗生素的残留动态及其健康风险济南：山东大学，：，郭欣妍，王娜，郝利君，等超高效液相色谱 串联质谱法同时测定水、土壤及粪便中 种抗生素分析化学，（）：，（）：高星爱，王鑫，解娇，等低温秸秆降解复合微生物菌剂的研究进展生物技术通报，（）：，（）：韩婉雪，王凤花，柏兆海，等畜禽粪便
25、堆放地土壤中抗生素抗性基因和细菌群落的垂直分布特征中国生态农业学报，（）：，（）：梅瀚杰，陈喜鸿，胡文锋，等一株降解恩诺沙星菌株的筛选鉴定及其降解条件的优化食品工业科技，（）：第 期 苏一鸣等：低温条件下恩诺沙星的微生物降解研究，（）：潘兰佳，李杰，李春星，等嗜热栖热菌降解氟喹诺酮类抗生素环境工程学报，（）：，（）：谷雪维周丛生物对恩诺沙星和磺胺的生物降解研究上海：上海海洋大学，：，王振方，韩子玉，王梦雪，等胶网藻对水体中恩诺沙星的毒性响应及去除作用 环境科学，（）：，（）：马文成，韩洪军混合耐冷菌群的优化筛选及应用研究环境工程学报，（）：，（）：张鑫，青格尔，高聚林，等玉米秸秆低温降解复合菌
26、的筛选及其菌种组成农业环境科学学报，（）：，（）：，（）：作者简介：苏一鸣（），女，辽宁沈阳人，主要研究方向为污染土壤修复。：（责任编辑：陈 昕）录用定稿网络首发启事为了以规范的网络期刊出版方式更快更好地确立作者的科研成果首发权，全面提高学术论文的传播效率和利用价值，本刊已与中国学术期刊（光盘版）电子杂志社有限公司（简称电子杂志社）签署 网络首发学术期刊合作出版协议，通过中国学术期刊（网络版）（）正式出版本刊网络版。凡经本刊审定录用的稿件（录用定稿）均将首先以本刊网络版形式首发，后视编排情况发布排版定稿和整期汇编定稿，最后以本刊印刷版形式出版。录用定稿网络首发之后，在后续的排版定稿、整期汇编定
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