1、第 44卷 第5期2023 年 9月Vol.44 No.5September 2023中山大学学报（医学科学版）JOURNAL OF SUN YATSEN UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES）丁香酚增强MSCs对肝星状细胞炎性活化的抑制作用吴逐宇1，汪显耀1，陈艳2，何志旭3（1.遵义医科大学免疫学教研室，贵州 遵义 563099；2.贵州省儿童医院/遵义医科大学附属医院小儿内科，贵州 遵义 563099；3.遵义医科大学/教育部组织损伤与再生医学协同创新中心，贵州 遵义 563099）摘要：【目的】研究丁香酚对人脐带间充质干细胞（HUC-MSCs）抑制肝星状细胞（HSCs
2、）炎性活化以及巨噬细胞促炎表型作用的影响及其相关机制；【方法】体外培养并鉴定HUC-MSCs，并采用MTT法评估丁香酚对HUC-MSCs的毒力作用；体外划痕实验探究丁香酚对HUC-MSCs迁移能力的影响；丁香酚处理HUC-MSCs后的旁分泌产物（EU-MSCs-CM）、HUC-MSCs旁分泌产物（MSCs-CM）处理经TGF-1处理活化的LX-2细胞，WB实验检测LX-2的-SMA、COL1A1、Smad2/3、p-Smad2/3表达的变化。EU-MSCs-CM、MSCs-CM处理经脂多糖（LPS）诱导的THP-1巨噬细胞，流式细胞术检测THP-1巨噬细胞表面标志物CD11b、CD86、CD2
3、06的表达情况，qPCR检测THP-1巨噬细胞促炎基因TNF-、IL-1、IL-6的表达情况。【结果】MTT法结果显示在0、7.5、15 g/mL浓度处理细胞24 h、48 h后，细胞活力保持在90%以上；体外划痕显示，丁香酚处理可以增强HUC-MSCs迁移能力。WB结果显示，与MSCs-CM处理相比，EU-MSCs-CM处理对活化状态的HSCs的-SMA、COL1A1、Smad2/3、p-Smad2/3表达抑制作用更加显著。流式细胞术实验结果显示，与MSCs-CM处理，EU-MSCs-CM处理对THP-1巨噬细胞M1型极化标志物CD86的抑制作用更加显著；qPCR实验结果显示，与MSCs-C
4、M处理，EU-MSCs-CM处理更加显著的抑制THP-1巨噬细胞促炎基因TNF-、IL-1、IL-6的表达。【结论】丁香酚增强了HUC-MSCs对HSCs炎性活化抑制作用，可能是通过调节TGF-1/Smads信号通路抑制HSCs的活化；丁香酚增强了HUC-MSCs对巨噬细胞促炎表型的抑制作用；促炎表型巨噬细胞可以促进HSCs炎性活化。关键词：人脐带间充质干细胞；肝纤维化；肝星状细胞；巨噬细胞；条件培养基中图分类号：R392.9 文献标志码：A 文章编号：1672-3554（2023）05-0784-08DOI：10.13471/ki.j.sun.yat-sen.univ（med.sci）.20
5、23.0509Experimental Study on the Inhibitory Effect of Eugenol on Inflammatory Activation of Hepatic Stellate Cells by MSCsWU Zhu-yu1，WANG Xian-yao1，CHEN Yan2，HE Zhi-xu3（1.Department of Immunology，Zunyi Medical University，Zunyi 563099，Guizhou，2.Department of Pediatric Medicine，Guizhou Childrens Hospi
6、tal/Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Zunyi 563099，China；3.Collaborative Innovation Center of Tissue Injury and Regenerative Medicine，co-sponsored by the Chinese Ministry of Education/Zunyi Medical University，Zunyi 563099，China）Correspondence to：HE Zhi-xu；E-mail：Abstract：【Objective】Thi
7、s study aimed to investigate the effects of eugenol on inhibiting the inflammatory activation of human umbilical cord mesenchymal stem cells（HUC-MSCs）and the pro-inflammatory phenotype of hepatic stellate cells（HSCs）in liver fibrosis，and to explore their underlying mechanisms.【Methods】HUC-MSCs were
8、cultured and identified in vitro，and the toxicity of eugenol to HUC-MSCs was evaluated by MTT method.The effect of eugenol on the migration ability of HUC-MSCs was investigated by in vitro scratch test.The expression of-SMA，COL1A1，Smad2/3 and p-基础研究 收稿日期：2023-03-17基金项目：省部共建协同创新中心项目（教科厅函 2020 39）作者简介
9、：吴逐宇，第一作者，E-mail：；何志旭，教授，博士生导师，研究方向：干细胞研究，E-mail：第5期吴逐宇，等.丁香酚增强MSCs对肝星状细胞炎性活化的抑制作用Smad2/3 of LX-2 cells activated by TGF-1 treated with EU-MSCs-CM and MSCs-CM were detected by WB assay.EU-MSCs-CM and MSCs-CM treated THP-1 macrophages stimulated with Lipopolysaccharide（LPS）were analyzed for the expre
10、ssion of surface markers CD11b，CD86，and CD206 by flow cytometry.Additionally，the expression of pro-inflammatory genes TNF-，IL-1，and IL-6 in THP-1 macrophages was detected by qPCR.【Results】The results of MTT method showed that the viability of the cells remained above 90%after 24 h and 48 h treatment
11、 at 0，7.5，15 g/mL.In vitro scratches showed that eugenol treatment enhanced HUC-MSCs migration.WB results showed that compared with MSCs-CM treatment，EU-MSCs-CM treatment significantly inhibited the expression of-SMA，COL1A1，Smad2/3，and p-Smad2/3 of activated HSCs.Flow cytometry showed that compared
12、with MSCs-CM treatment，EU-MSCs-CM treatment had a more significant inhibitory effect on CD86，a M1-type polarization marker in THP-1 macrophages.The results of qPCR experiment showed that compared with MSCs-CM treatment，EU-MSCs-CM treatment more significantly inhibited the expressions of TNF-，IL-1 an
13、d IL-6 of THP-1 macrophage proinflammatory genes.【Conclusions】Eugenol enhances the inhibitory effect of HUC-MSCs on inflammatory activation of HSCs，possibly by regulating TGF-1/Smads signaling pathway.It also enhances the inhibitory effect of HUC-MSCs on the pro-inflammatory phenotype of macrophages
14、.Proinflammatory macrophages can promote inflammatory activation of HSCs.Key words：human umbilical cord mesenchymal stem cells；liver fibrosis；hepatic stellate cells；macrophage；conditioned mediumJ SUN Yatsen Univ（Med Sci），2023，44（5）：784-791肝纤维化是由各种致病因素（如酒精、病毒、自身免疫性疾病等）造成的慢性肝脏损伤演变而来1，流行病学数据显示，全球每年有超过1
15、00万人死于肝纤维化相关疾病2。HSCs活化过度产生细胞外基质是肝纤维化的主要特征性事件3，转化生长因子-1（transforming growth factor-1，TGF-1）具有很强的促纤维化活性，可以刺激静止状态HSCs活化，分泌大量一型胶原蛋白（COL1A1，Type 1 collagen）、-平滑肌肌动蛋白（-smooth muscle actin，-SMA）等细胞外基质4。在肝损伤时，活化的HSCs分泌TGF-1，通过Smad2/Smad3形成正反馈环路促进纤维化形成，而Smad7则是该途径的抑制因子5-7。当肝脏发生炎症时，活化的肝脏内的巨噬细胞（Kupffer cells，K
16、Cs）通过释放各种细胞因子如 TNF-、IL-1、IL-6 等，诱导静止状态 HSCs活化8-9，M1型巨噬细胞在肝纤维化进展期发挥促炎和促纤维化的作用；而M2型巨噬细胞可以在肝纤维化恢复期发挥抗炎和抗纤维化作用10。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有自我更新能力、趋化迁移特性和跨胚层分化潜能等特性，是组织工程的理想种子细胞11。MSCs通过旁分泌产生多种细胞因子，这些旁分泌因子具有调节免疫反应、促进血管生成、促进组织修复和再生等作用12，通常将这种含有大量细胞因子及生长因子的培养基称为条件培养基（conditioned medium，CM）13。新近报
17、道显示，在暴发性肝衰竭大鼠模型中，MSCs-CM对肝细胞死亡有直接抑制作用，对肝细胞再生有促进作用14。有学者发现肝纤维化小鼠注射MSCs-CM可以抑制肝细胞凋亡、促进其再生，抑制中性粒细胞浸润和KCS激活15。值得注意的是，通过不同方法（包括药物处理、促炎细胞因子刺激、缺氧处理等）处理MSCs可以调节其生物学功能（比如：自我更新、迁移和分化潜能等）16-17。丁香酚是一种具有广泛药理作用的化合物，在过去的十年中受到了广泛的关注，具有抗氧化、抗炎、免疫调节等作用18-19。有研究发现用丁香酚处理小鼠骨髓 MSCs，通过上调 Sox2、Rex1 和 Tex10 来增强MSCs增殖以及自我更新能力
18、20。作为前人研究成果的延伸，本研究旨在探究丁香酚对HUC-MSCs抑制肝纤维化进展的关键因素（HSCs炎性活化）作用的影响。1 材料与方法1.1HUC-MSCs的分离培养及鉴定。脐带组织取自遵义医科大学附属医院产科，健康足月新生儿，经过产妇知情同意，产妇乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋、梅毒等检查均为阴性；采集好标本后，将其放入含 2%双抗的 DMEM培养基中，低温运送至细胞间无菌超净台进行后续分离培养。在超净台中用无菌PBS清洗脐带并去除两根脐静脉和一根脐动脉，分离出脐带中的华通氏胶组织并剪785第44卷中山大学学报（医学科学版）碎，铺于T75细胞培养瓶中，加入90%DMEM低糖培养基（Gibco
19、，USA）、10%FBS（USA，New Zealand）和 1%双抗（Gibco，USA），在 37C，体积分数 5%CO2湿度培养箱中培养，定期更换培养基。培养7 d可见 HUC-MSCs 逐渐从组织块中爬出，到 80%-85%融合度时，用胰蛋白酶化，传代至第四代，然后将细胞制备为细胞悬液以待使用。通过流式细胞 术 鉴 定 HUC-MSCs，鉴 定 HUC-MSCs 表 面 的MSCs 标志物（CD73、CD90、CD105）和造血标志物（CD34、CD45、CD19、CD11b、HLA-DR）。1.2MTT检测细胞活力为了评估丁香酚对HUC-MSCs的细胞活力的影响，将HUC-MSCs铺
20、在96孔板（5103 cells/well）中，12 h后，用不同浓度（0、7.5、15、30、60、120、240 g/mL）的丁香酚处理HUC-MSCs，24 h和48 h后，小心吸去上清，加入 90 L新鲜培养液，再加入10 L MTT（Solarbio，China）溶液，继续培养 4 h；然后吸掉上清，每孔加入110 L Formazan 溶解液，置摇床上低速震荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm 处测量各孔的吸光值。1.3体外划痕实验为了评估丁香酚对HUC-MSCs迁移能力的影响，将2105 cells/well HUC-MSCs接种在六孔板中，12 h后，
21、当HUC-MSCs贴壁后，使用200 L枪头尖端从细胞单层中心垂直划痕，然后用PBS清洗以去除刮下的细胞。用含 10%FBS的 DMEM 2 mL，丁香酚15 g/mL，37 C，体积分数5%CO2，处理细胞24 h；通过倒置显微镜观察HUC-MSCs从划痕边缘迁移到中央区域并拍照，在Image J软件中进行分析，来评估细胞的迁移能力。1.4条件培养基的制备将HUC-MSCs铺在6孔板中加入完全培养基，待到细胞融合度70%时加入15 g/mL丁香酚处理细胞24 h，然后将完全培养基换成DMEM基础培养基继续培养细胞 24 h，然后吸取上清，在 4C、1 000g 下离心 10 min，吸取上清
22、即为 Eu-MSCs-CM，在-80 保存，以备后续使用。对照组不丁香酚处理HUC-MSCs，其余操作步骤一致。1.5Western Blotting 实验将收集到的细胞，通过添加1：100蛋白酶抑制剂（Solarbio，China）的 RIPA 裂解液（强）（Solarbio，China）裂解细胞。采用 BCA蛋白检测试剂盒（Solarbio，China）进 行 蛋 白 定 量。样 品 通 过 SDS-PAGE凝胶分离，转移到PVDF膜（Millipore）上。用5%脱 脂 牛 奶 封 闭 膜 2 h，4 下 用 一 抗：anti-COL1A1（1：2 000，ab138492，abcam）
23、、anti-SMA（1 g/mL，ab5694，abcam）、anti-Smad2/3（1：1 000，ab202445，abcam）、anti-p-Smad2/3（1：1 000，ab254407，abcam）、GAPDH（1：2 000，GB11002，Servicebio）孵育过夜。清洗3次后，用酶标兔二抗在室温下孵育2 h。使用Immobilon Western HRP（GeneBank；USA）曝光；并用Image J软件中进行分析。1.6流式细胞术分析收集THP-1细胞，PBS重悬。加入流式细胞抗体 CD86（invitrogen，2400629，USA）、CD11b（invitr
24、ogen，2414642，USA）和 CD206（invitrogen，2344972，USA），在室温下黑暗孵育 30 min，然后用 PBS 清洗。最后用流式细胞仪检测。1.7实时荧光定量PCR（qRT-PCR）向THP-1巨噬细胞中加入1mL TRNzol（Takara，Japan）提取总RNA，然后，用RT Master Mix将提取的RNA反向转化为cDNA进行qPCR（Takara，Japan）。Real-time PCR 采用 Applied Biosystems ViiA6 Real-time PCR 系统，采用 SYBR Green qPCR Master Mix（Takar
25、a，Japan）。PCR引物序列：TNF-：FORWARD：AGC TGG TGG TGC CAT CAG AGG，REVERSE：TGG TAG GAG ACG GCG ATG CG；IL-1：FORWARD：TGG CTT ATT ACA GTG GCA ATG AGG ATG，REVERSE：TGT AGT GGT GGT CGG AGA TTC GTA；IL-6：FORWARD：GGT GTT GCC TGC TGC CTT CCG，REVERSE：GTT CTG AAG AGG TGA GTG GCT GTC。1.8统计学分析数据数值均采用均数标准差表示。数据处理两样本间比较采用t检
26、验。多组数据比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），多组数据比较差异有统计学意义后，对于不同浓度处理组检测结果和对照组比较采用Dunnett s t检验；所有数据均采用Graphpad Prism version 8.20软件统计。P0.05 表示差异具有统计学意义。2 结 果2.1体外培养HUC-MSCs从遵义医科大学附属医院产科取回脐带标本，去除一根脐静脉和两根脐动脉后剥离出脐带中的786第5期吴逐宇，等.丁香酚增强MSCs对肝星状细胞炎性活化的抑制作用华通氏胶组织并剪碎，组织贴壁法培养7 d左右在低倍镜下可观察到细胞与组织块分离，贴壁细胞形成为多边形、短纤维状或梭形，也有圆
27、形细胞（图1），培养两至三周细胞融合度达到80%，可见成纤维状细胞集落生长。2.2HUC-MSCs的鉴定收集对数生长期 P4 代 HUC-MSCs，通过流式细胞术检测其表面标志物 CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD19、CD11b、HLA-DR 的表达，流式分析结果显示：MSCs 表面标志物 CD73、CD90、CD105 阳性率均接近 100%，而造血细胞标志物CD34、CD45、CD19、CD11b和HLA-DR几乎不表达（图 2），符合MSCs基本生物学特征。2.3丁香酚对HUC-MSCs细胞活性的影响为了评估丁香酚处理对HUC-MSCs的细胞活力的影响，我们采用
28、0、7.5、15、30、60、120 和 240 g/mL的丁香酚分别处理HUC-MSCs 24 h和48 h后，用MTT法检测各组吸光度，计算HUC-MSCs的细胞活力 计算公式：细胞活力（%）=（每组平均吸光度值/对照组平均吸光度值）100。结果显示：0、7.5、15、30 g/mL浓度丁香酚处理HUC-MSCs，细胞活力在90%以上（图 3），因此，后续实验选取15 g/mL丁香酚处理HUC-MSCs进行实验。2.4丁香酚处理增强了HUC-MSCs的细胞迁移能力我们采用体外划痕实验探究了丁香酚对HUC-MSCs的迁移能力影响，倒置显微镜拍照，Image J软件分析不同处理前后划痕面积的改
29、变。结果显示：未用丁香酚处理组（MSCs组）的细胞迁移率为（422.8）%（图4A），而用15 g/mL丁香酚处理组（Eu-MSCs组）的细胞迁移率为（831.6）%（图 4B）（MSCs 组 VS Eu-MSCs 组 t=7.018 P=0.002 4）。结果表明，丁香酚处理可以增强HUC-MSCs的细胞迁移能力。2.5TGF-1诱导LX-2细胞活化在本研究中，我们用 10 ng/mL TGF-1处理LX-2细胞24 h使其活化，倒置相差显微镜观察显示：未经TGF-1处理组【TGF-1（-）】的LX-2细胞呈多角形或短梭形；TGF-1 处理 24h 组【TGF-1The surface ma
30、rkers of CD73,CD90,CD105,CD34,CD45,CD19,CD11b and HLA-DR of HUC-MSCs were detected by flow cytometry.One representative data from three independent experiments is presented.n=3 in every group.图2HUC-MSCs的鉴定Fig.2Identification of HUC-MSCsA：On the seventh day,HCU-MSCs climbed out of Umbilical cord tiss
31、ue of Waldorfs glue;B：Morphology of human umbilical cord mesenchymal stem cells in P3 generation.n=3 in every group.Bar=200 m图1倒置显微镜下HUC-MSCs的形态Fig.1Morphology of HUC-MSCs under an inverted microscopeThe cell viability of HUC-MSCs treated with eugenol at 0,7.5,15,30,60,120,240 g/mL for 24 h and 48 h
32、 was detected by MTT assay.n=3 in every group.图3丁香酚对HUC-MSCs细胞活力的影响Fig.3Effect of eugenol on the viability of HUC-MSCs cells787第44卷中山大学学报（医学科学版）（+）】，LX-2细胞呈纺锤形或梭形，细胞形态向成纤维细胞样细胞转变（附图1A）；收集细胞提取总蛋白，WB实验检测LX-2细胞-SMA、COL1A1的表达情况，结果显示：TGF-1处理后-SMA、COL1A1表达显著上调（-SMA t=5.705 P=0.004 7，COL1A1 t=6.73 P=0.025）
33、；根据LX-2细胞形态与WB结果，表明LX-2细胞被TGF-1活化。2.6丁香酚预处理增强了 HUC-MSCs 对 HSCs细胞活化的抑制作用为了探究Eu-MSCs-CM、MSCs-CM对HSCs活化的影响，我们用 10 ng/mL TGF-1处理 LX-2 肝星 状 细 胞 24 h 使 其 活 化，再 用 Eu-MSCs-CM、MSCs-CM分别处理LX-2细胞24 h，WB检测LX-2细胞中与其活化相关的蛋白-SMA、COL1A1的表达情况（图5）。结果显示：各组间-SMA、COL1A1 经方差分析，差异具有统计学意义（F=32.64，P0.000 1；F=28.87，P=0.000 1
34、）。与 Control 组相比，DMEM组-SMA、COL1A1表达显著升高（-SMA P=0.000 1，COL1A1 P=0.000 1）；与 MSCs-CM 处理组相比，Eu-MSCs-CM 处理组可以更加显著降低活化的 LX-2细胞-SMA、COL1A1的表达（-SMA P=0.016 9，COL1A1 P=0.033 8），说明丁香酚处理增强了HUC-MSCs对HSCs细胞活化的抑制作用。2.7Eu-MSCs-CM 对 HSCs 的 TGF-1/Smads信号通路具有更强的抑制作用TGF-1在 HSCs活化过程中起着至关重要的作用，Smads蛋白家族是其下游因子，它们的异常表达是促进
35、HSCs活化的重要因素。为进一步探究丁香酚处理增强HUC-MSCs对HSCs活化抑制作用与TGF-1/Smads信号通路的关系，我们分别用Eu-MSCs-CM、MSCs-CM 处理经 TGF-1诱导活化的LX-2细胞，检测LX-2中的Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表达水平。WB 结果显示各组间 Smad2/3、p-Smad2/3 经方差分析，差异具有统计学意义（F=24.57，P=0.000 2；F=29.56，P=0.000 1）。与 Control组相比，DMEM组Smad2/3、p-Smad2/3表达显著升高（Smad2/3 P=0.000 2，p-Smad2/3 P=0.001
36、 3）；与MSCs-CM处理组相比，Eu-MSCs-CM处理组可以更加显著降低活化的LX-2细胞Smad2/3、p-Smad2/3的 表 达（Smad2/3 P=0.049 2，p-Smad2/3 P=0.002 7；图6）。2.8PMA诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞我们采用了PMA诱导THP-1单核细胞分化形成 THP-1巨噬细胞，作为探讨巨噬细胞极化的体外细胞模型。THP-1单核细胞在未接受PMA处理时，为悬浮状态生长，呈现圆形（附图2A）；在加入75 ng/mL PMA处理后，细胞胞体逐渐变大，表面出The expression of-SMA and COL1A1 in TGF-1-i
37、nduced activated LX-2 cells treated with EU-MSCs-CM was detected by WB and the statistical graph of the analysis results.One representative data from three independent experiments is shown.2)p 0.001 indicated that the DMEM group was compared with the Control group,and 1)p 0.05 indicated that the MSC
38、s-CM group was compared with the Eu-MSCs-CM group.n=3 in every group.图5丁香酚处理增强了HUC-MSCs对HSCs细胞活化的抑制作用Fig.5Eugenol treatment enhanced the inhibitory effect of HUC-MSCs on HSCs cell activationA:HUC-MSCs without eugenol treatment;B:Eugenol treatment of HUC-MSCs;C:the statistical graph of the analysis r
39、esults.one representative data from three independent experiments is given,and 1)p 0.001 indicates statistical significance compared with the control group.n=3 in every group.图4HUC-MSCs的体外划痕实验Fig.4In vitro scratch experiment of HUC-MSCs788第5期吴逐宇，等.丁香酚增强MSCs对肝星状细胞炎性活化的抑制作用现伪足，由悬浮状态逐渐变为贴壁生长，处理72 h后几乎完
40、全贴壁（附图2B）。收集贴壁细胞，通过流式细胞术检测细胞表面标志物 CD11b、CD86、CD206的表达情况（附图 2C），结果显示 CD11b的表达率接近 100%，CD86、CD206 几乎不表达。细胞形态与流式鉴定，该贴壁细胞符合 M0 型巨噬细胞。2.9丁香酚处理增强了HUC-MSCs对巨噬细胞M1型极化的抑制作用在肝纤维化过程中，巨噬细胞可以释放促炎细胞因子等活化HSCs，导致肝纤维化的发生与发展。巨噬细胞具有高度可塑性，环境变化时可以在M1（促炎）和M2型（抗炎）之间转化。在本研究中，为了评估EU-MSCs-CM是否可以逆转巨噬细胞的促炎M1型极化，首先用75 ng/mL PMA
41、处理THP-1单核细胞72 h，使其分化为巨噬细胞，然后用100 ng/mL LPS 处理 THP-1 巨噬细胞 48 h，最后再用 EU-MSCs-CM、MSCs-CM分别处理THP-1巨噬细胞24 h后，收集细胞悬液，通过流式细胞术检测THP-1巨噬细胞表面的巨噬细胞标志物CD11b、M1型极化标志物CD86、M2型极化标志物CD206（附图3A）。结果显示：各组间CD86、CD206经方差分析，差异具有统计学意义（F=10.7，P=0.003 5；F=31.41，P=0.000 1）；与Control组相比，DMEM组CD86表达显著升高（P=0.002 9）；与MSCs-CM处理组相比
42、，Eu-MSCs-CM 处理组相比 CD86 表达显著下降（P=0.024 9），CD206表达显著升高（P=0.006 9）。表明丁香酚处理增强了 HUC-MSCs 对巨噬细胞 M1 极化的抑制作用。同时通过 qRT-PCR 实验检测不同处理组THP-1 巨噬细胞促炎基因 TNF-、IL-1、IL-6 的表达情况（附图3 B），结果显示：各组间TNF-、IL-1、IL-6 经方差分析，差异具有统计学意义（F=49.14，P=0.000 1；F=33.75，P0.000 1；F=44.53，P0.000 1）；与 Control 组相比，DMEM 组 TNF-、IL-1、IL-6表达显著升高（
43、TNF-P=0.000 1，IL-1 P=0.000 6，IL-6 P=0.000 4）；与 MSCs-CM 处理组相比，Eu-MSCs-CM 处理组TNF-、IL-1、IL-6表达显著降低（TNF-P=0.013 7，IL-1 P=0.001 5，IL-6 P=0.015 5）。2.10促炎型 THP-1 巨噬细胞可以促进 LX-2 肝星状细胞活化HSCs与巨噬细胞之间的相互作用共同决定着肝纤维化的进展。为了探究THP-1巨噬细胞是否对LX-2细胞活化产生影响，我们将LPS处理诱导为促炎表型的 THP-1巨噬细胞和 LX-2细胞进行共培养，WB检测LX-2细胞的-SMA、COL1A1蛋白的表
44、达情况（图 7）。结果显示：各组间-SMA、COL1A1 经方差分析，差异具有统计学意义（F=31.40，P=0.000 7；F=49.95，P=0.000 2）；无论是经或者不经LPS处理的THP-1巨噬细胞与LX-2细胞共培养，都会促进其-SMA、COL1A1蛋白的表达；但是与经过LPS处理的THP-1巨噬细胞共培养，能更加显著的增强LX-2细胞的-SMA、COL1A1蛋白的表达（-SMA P=0.031 7，COL1A1 P=0.022 4），表明其具有更强的活化LX-2细胞的作用。3 讨 论近年来，在以细胞疗法为基础的研究中，MSCs因其巨大的应用潜力而受到广泛关注。研究表明，MSCs
45、 可以有助于组织修复21，缓解局灶性脑缺The expression levels and results of Smad2/3 and p-Smad2/3 in LX-2 cells were detected by WB and t the statistical graph of the analysis results.One representative data from three independent experiments is shown.2)p 0.01 3)p 0.001 means the comparison between DMEM group and Cont
46、rol group,and 1)p 0.05 2)p 0.01 means the comparison between MSCs-CM group and Eu-MSCs-CM group is statistically significant.n=3 in every group.图6Eu-MSCs-CM对HSCs的TGF-1/Smads信号通路具有更强的抑制作用Fig.6Eu-MSCs-CM showed a stronger inhibitory effect on TGF-1/Smads signaling pathway in HSCs789第44卷中山大学学报（医学科学版）血2
47、2以及有助于肝纤维化治疗23等。在体外条件下，培养条件（如培养基、添加剂，环境因素等）的改变对MSCs的增殖、迁移等生物学功能有着至关重要的影响，因此探索改造MSCs生物学功能以增强其疾病治疗潜力的方法备受关注；Mortezaee 等24报道了，褪黑素处理可以增强骨髓来源 MSCs 对CCL4诱导的小鼠肝纤维化的治疗作用。Sisakhtnezhad等20报道用丁香酚处理小鼠骨髓来源的MSCs可以增强其更新、迁移等生物学功能。但是，目前尚未有关于丁香酚处理HUC-MSCs治疗肝纤维化的报道。本研究中，我们通过MTT实验评估丁香酚对HUC-MSCs的毒力作用，通过体外划痕实验发现丁香酚可以增强HU
48、C-MSCs的迁移能力。我们用TGF-1处理LX-2细胞使其活化，通过WB结果显示：与MSCs-CM处理组相比，Eu-MSCs-CM处理组更加显著地抑制 LX-2细胞的-SMA、COL1A1、Smad2/3、p-Smad2/3 的表达，表明丁香酚增强了HUC-MSCs对LX-2细胞的炎性抑制作用，可能是通过TGF-1/Smads信号通路调节。肝巨噬细胞在肝纤维化发展过程中起着关键的作用，肝脏巨噬细胞的两种最典型的表型是M1和M2表型，分别介导肝脏炎症和组织重塑。M1巨噬细胞表现为促炎，分泌 TNF-、IL-1、IL-6、CCL2等促炎因子，相反，M2巨噬细胞表现为抗炎，分泌 Arg-1、IL-
49、10等抗炎因子，因此，调节肝巨噬细胞的M1或M2极化可以有利于肝纤维化的治疗。Yang等25报道了脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸-磷酸酶相互作用蛋白-2以STAT-STAT6依赖的方式刺激M2巨噬细胞极化，从而改善CCL4诱导的小鼠肝纤维化模型中的肝脏炎症和肝纤维化。He等26报道了颌骨膜来源的MSCs能有效抑制巨噬细胞的M1型极化。Jin等27报道了IL-4可以增强骨髓来源的MSCs 对 LPS 诱导活化的巨噬细胞的炎性抑制作用。本研究中，我们用PMA处理THP-1单核细胞使其分化为 M0 型 THP-1 巨噬细胞，用 LPS 诱导THP-1巨噬细胞使其表现为促炎型的M1表型，通过流式细胞术分析细胞
50、表面标志物CD11b、CD86、CD206的表达水平，结果显示：与MSCs-CM处理组相比，Eu-MSCs-CM 处理组对 THP-1 巨噬细胞的CD86表型更具抑制作用；qPCR实验检测细胞促炎基因 TNF-、IL-1、IL-6 的表达，结果显示：与MSCs-CM处理组，EU-MSCs-CM 处理组更加显著的抑制 THP-1巨噬细胞促炎基因 TNF-、IL-1、IL-6的表达。上述结果表明：丁香酚增强了HUC-MSCs对巨噬细胞的抗炎作用。HSCs与巨噬细胞之间的相互作用共同决定着肝纤维化的进展，Pradere等28报道了肝巨噬细胞以核因子 B（NF-B）依赖的方式增强 HSCs的存活，从而
