1、实验研究调节 和 对人 细胞代谢记忆形成的抑制作用赖巧玲 谢婷 黄焱福建医科大学医学技术与工程学院眼视光学系福州 谢婷现在福建医科大学附属第一医院福州 通信作者:黄焱:.【摘要】目的 探讨微小()/核因子 相关因子()对人视网膜色素上皮()细胞代谢记忆损伤的影响及其调控机制方法取 细胞将其置于 /葡萄糖培养基培养 作为正常对照组于 /高糖培养基中培养 后换成 /葡萄糖培养基继续培养 作为代谢记忆组慢病毒转染细胞并加入嘌呤霉素筛选转染成功的细胞并将其置于 /高糖培养 后换成 /葡萄糖培养基继续培养 作为 抑制剂组细胞于 /高糖利拉鲁肽培养基培养 后换成 /葡萄糖培养基继续培养 作为利拉鲁肽组 采
2、用实时荧光定量 检测、醌氧化还原酶()、血红素加氧酶()表达水平采用 法检测 总蛋白、核蛋白水平采用细胞免疫荧光检测、蛋白表达水平采用细胞计数试剂盒()检测细胞增生率以评估细胞活力采用 试剂盒检测活性氧簇()水平 结果 正常对照组、代谢记忆组、对照组和 抑制剂组 相对表达量分别为 、和 总体比较差异有统计学意义()其中正常对照组 相对表达量低于代谢记忆组 抑制剂组 相对表达量低于正常对照组差异均有统计学意义(均 )代谢记忆组 及总蛋白、核蛋白相对表达量较正常对照组降低 抑制剂组较 对照组明显升高差异均有统计学意义(均 )代谢记忆组、相对表达量较正常对照组降低 抑制剂组较 对照组明显升高差异均有
3、统计学意义(均 )代谢记忆组、荧光强度均低于正常对照组 抑制剂组、荧光强度均高于 对照组差异均有统计学意义(均 )与代谢记忆组相比利拉鲁肽组 相对表达量下降差异有统计学意义()利拉鲁肽组、总蛋白及核蛋白相对表达水平均较代谢记忆组升高差异均有统计学意义(均 )利拉鲁肽组荧光强度较代谢记忆组增强差异均有统计学意义(均 )与正常对照组及利拉鲁肽组相比代谢记忆组细胞增生活力均下降差异均有统计学意义(均 )代谢记忆组 相对含量较正常对照组及利拉鲁肽组升高差异均有统计学意义(均 )结论 利拉鲁肽通过下调 逆转代谢记忆对、和 的抑制作用【关键词】糖尿病视网膜病变 利拉鲁肽 视网膜色素上皮 代谢记忆 微小 基
4、金项目:福建省自然科学基金项目(、):./.:.()/()().中华实验眼科杂志 年 月第 卷第 期 ././././.()()().().().().().().().().().().().().().:():./.对于长期血糖控制欠佳的糖尿病视网膜病变()患者即使后期严格控制血糖既往高血糖对视网膜的损伤仍可持续进展即存在代谢记忆现象 可见高血糖及其代谢产物所致的代谢记忆现象可继续损伤视网膜并抑制其自我修复能力这可能是 持续进展的原因之一 核因子 相关因子()及其靶基因血红素加氧酶()、醌氧化还原酶()是体内强抗氧化因子 研究发现 发展过程中随着高血糖及其代谢产物的刺激可能会破坏 信号转导
5、功能而保护 可恢复并改善视网膜色素上皮()细胞、血管内皮细胞、神经节细胞的正常生理功能 另有研究发现 是微小()的下游靶基因后者不仅与 的发生和发展相关还参与糖脂代谢、调节葡萄糖耐量及胰岛素敏感性 在糖尿病小鼠模型中发现利拉鲁肽可中华实验眼科杂志 年 月第 卷第 期 .促进 及下游靶基因表达增加可能对 起到激活和保护作用 因此推测利拉鲁肽可能通过调节/减轻代谢记忆损伤 本研究拟探讨/对人 细胞代谢记忆损伤的影响及其调控机制 材料与方法.材料.细胞来源人 细胞系 购自上海翼和应用生物技术有限公司.主要试剂及仪器青链霉素(美国 公司)培养基(美国 公司)蛋白(美国 公司)胎牛血清、胰蛋白酶(德国
6、公司)葡萄糖、粉剂(美国 公司)、/引物(广东锐博生物科技有限公司)、(日本 公司)、扩增引物兔抗人 多克隆抗体(上海生工生物工程股份有限公司)慢病毒载体 抑制剂(上海吉凯基因化学技术有限公司)蛋白裂解液、细胞裂解液、凝胶试剂盒、脱脂奶粉、标记的羊抗兔二抗()、标记的羊抗鼠二抗()(北京依玛博科技有限公司)核蛋白提取试剂盒、抗荧光衰减封片剂(含)(北京索莱宝科技有限公司)超强显色液(美国 公司)膜(美国 公司)兔抗人 单克隆抗体()、兔抗人 多克隆抗体()、兔抗人 多克隆抗体()、标记羊抗兔多克隆抗体()(英国 公司)鼠抗人 多克隆抗体(北京义翘神州科技股份有限公司)细胞计数试剂盒()(上海碧
7、 云 天 生 物 科 技 有 限 公 司)二 氢 乙 锭()/(美国 生物科技有限公司)利拉鲁肽(大连美仑生物技术有限公司)型实时荧光定量 仪(美国 公司)凝胶成像仪(美国 公司)荧光显微镜(日本 公司)多功能酶标仪(美国 公司).方法.细胞培养及分组处理 将 细胞株置于含有胎牛血清、/(商品单位)青霉素和/链霉素的 培养基中培养待细胞生长至 融合时用 胰蛋白酶消化细胞加入培养基制备细胞悬液并接种于培养板中将细胞置于 /葡萄糖培养基中培养 作为正常对照组于 /高糖培养基中培养 后换成 /葡萄糖培养基继续培养 作为代谢记忆组经慢病毒 抑制剂转染成功将其置于/葡萄糖培养基培养 后换成 /葡萄糖培养
8、基继续培养 作为 抑制剂组细胞于 /高糖利拉鲁肽培养基培养 后换成 /葡萄糖培养基继续培养 作为利拉鲁肽组.法检测细胞增生率调整细胞密度为个/按每孔 置于 孔板中每组设置 个复孔加入过滤除菌后的 葡萄糖溶液调整培养基糖浓度为 、/并设置无细胞培养基作为空白组培养 后加入 试剂/孔继续孵育 采用多功能酶标仪在 波长处读取吸光度()值以细胞增生率降至接近正常对照组一半的糖浓度为最适高糖浓度此外将细胞分为正常对照组、代谢记忆组和利拉鲁肽组(、/)即细胞分别置于培养基糖浓度为 /、/和 /不同浓度利拉鲁肽中培养 细胞活力检测操作步骤同上选取细胞活力最佳组为最适利拉鲁肽给药浓度 随后将细胞分 为 正 常
9、 对 照 组、代 谢 记 忆 组、利 拉 鲁 肽 组(/)于 孔板中培养 后根据上述步骤检测 值并计算各组细胞增生率 细胞增生率(检测组空白组)/(对照组空白组).慢病毒 转染细胞 构建含有嘌呤霉素抗性基因的慢病毒载体 抑制剂(/)取原液 加入 培养基配成稀释液 常规培养并以 个/细胞悬液 接种于 孔板 后加入慢病毒稀释液、及 增强剂使感染复数()即感染时病毒与细胞数量的比值梯度达到、转染 绿色荧光蛋白()表达丰度较高时用荧光显微镜观察转染效率为 左右且细胞生长良好组所对应的最适 和转染条件即为后续实验依据 配制嘌呤霉素使终质量浓度为 /将细胞分为正常对照组、对照组和 抑制剂组调整细胞密度为
10、个/接种于培养瓶中转染 后慢病毒转染效率达 且细胞生长状态良好加入嘌呤霉素筛选转染成功、含抗性基因的细胞未被转染细胞大量破裂死亡继续培养 后收集细中华实验眼科杂志 年 月第 卷第 期 .胞传代 将转染细胞诱导为代谢记忆空载病毒模型、代谢记忆病毒模型并设置正常对照组、代谢记忆组进行后续实验.实时荧光定量 检测、水平 调整细胞密度为 个/孔并置于 孔板中分组处理培养 收集各组细胞后使用 提取 引物序列见表 参照逆转录试剂盒说明书合成 采用 实时荧光定量 检测、水平以 为内对照反应条件:预变性 变性 退火/延伸 个循环 根据 试剂盒说明书进行 逆转录及实时荧光定量 检测以 为内源性对照反应条件:预变
11、性 变性 退火/延伸 个循环 采用法计算各目的基因相对表达量表 逆转录 引物序列 引物名称引物序列正向:反向:正向:反向:正向:反向:正向:反向:正向:反向:正向:反向:注:聚合酶链式反应:核因子 相关因子:醌氧化还原酶:血红素加氧酶:肌动蛋白:微小:():.法检测 核蛋白和总蛋白表达水平 调整细胞密度为 个/孔置于培养皿中分组培养 收集各组细胞并在预冷 裂解液和核蛋白试剂盒中分别提取总蛋白和核蛋白并配置成 倍蛋白上样缓冲液 取等蛋白量缓冲液在 中电泳并转印至 膜上经脱脂牛奶封闭后与、和 抗体(均 稀释)稀释液在 下孵育过夜充分漂洗后加入二抗()在室温下孵育 加入 混合液暗室曝光、显影 和 蛋
12、白水平分别作为总蛋白及核蛋白的内参 采用 软件分析各目的条带的灰度值.细胞免疫荧光染色检测、和 蛋白表达水平 调整细胞密度为 个/孔在专用爬片培养 收集爬片后加入 多聚甲醛固定 用 破膜 加入 牛血清白蛋白封闭 加入、和 抗体()稀释液 孵育过夜充分漂洗后在室温下加入荧光二抗()避光孵育 置于载玻片上将荧光猝灭剂覆盖表面暗室中于正置荧光显微镜下观察并拍照每片不少于 个视野(倍)采用 软件分析目的蛋白荧光强度.检测细胞活性氧含量将细胞以 个/孔接种于 孔板中分组培养 后去除培养基磷酸盐缓冲液()洗涤 次将配制好的 /反应液 加入细胞中继续培养 后 洗涤 次在倒置荧光显微镜下任意选取 个视野(倍)
13、采用 分析活性氧簇()荧光强度.统计学方法采用 .统计学软件进行统计分析采用 作图 计量资料数据经 检验证实呈正态分布以 表示 各组各指标总体比较采用单因素方差分析事后多重比较方差齐时采用 检验方差不齐时采用 检验 为差异有统计学意义 结果.糖浓度及药物浓度筛选 法检测结果显示正常对照组和、/高糖组的细胞增生率分别为 、组 间 总 体 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义()其中、/高糖组细胞增生率均低于正常对照组差异均有统计学意义(均 )葡萄糖浓度为 /时细胞增生率明显下降选择最低有效葡萄糖浓度 /进行后续实验(图)正常对照组、高糖组和利拉鲁肽、/组细胞增生率分别为 、组 间 总 体 比
14、较 差 异 有 统 计 学 意 义()其中高糖组细胞增生率低于利拉鲁肽 /、/组差异均有统计学意义(均 )利拉鲁肽 /组细胞增生率最高因此选择利拉鲁肽 /为最佳浓度(图)中华实验眼科杂志 年 月第 卷第 期 .BA1 02 03 04 0M O I4 8 h7 2 h9 6 hm i R?2 7 b?3 p 对照组m i R?2 7 b?3 p 抑制剂组m i R?2 7 b?3 p 对照组m i R?2 7 b?3 p 抑制剂组5 0 m5 0 m明场G F P明场G F P明场G F P明场G F P5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m
15、5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m图 慢病毒 转染细胞荧光图(标尺 ):、条件下人 细胞转染慢病毒 抑制剂和 对照组的明场和 绿色荧光图:人 细胞转染慢病毒 抑制剂和 对照组、后的明场和 绿色荧光图:感染复数:微小:绿色荧光蛋白 ():():AB1.51.00.50.0细胞增生率12345aaa1.51.00.50.0细胞增生率aaa12345图 不同葡萄糖和利拉鲁肽浓度干预下人 细胞增生率的比较:不同葡萄糖浓度干预下人 细胞增生率比较 .与正常对照组比较(单
16、因素方差分析 检 验 ):正 常 对 照 组:/高 糖 组:/高糖组:/高糖组:/高糖组:不同利拉鲁肽浓度干预高糖诱导的人 细胞增生率比较 .与高糖组比较(单因素方差分析 检验):正常对照组:高糖组:利拉鲁肽 /组:利拉鲁肽 /组:利拉鲁肽 /组 :.():/:/:/:/:.():/:/:/.慢病毒转染条件筛选在荧光显微镜下观察 绿色荧光表达的细胞转染条件为 对照组 、抑制剂组 时荧光最强此为最佳转染条件(图)抑制剂组慢病毒载体包含嘌呤霉素抗性基因慢病毒转染 加入 /嘌呤霉素继续培养至 筛选已转染成功的细胞表达效率超过(图).转 染 后 各 组、和蛋白表达量比较实时荧光定量 检测结果显示正常对
17、照组、代谢记忆组、对照组、抑制剂组、相对表达量组间总体比较差异均有统计学意义(、均 )其中代谢记忆组 相对表达量高于正常对照组、相对表达量均低于正常对照组差异均有统计学意义(均 )抑制剂组 相对表达量明显低于 对照组、相对表达量均高于 对照组差异均有统计学意义(均)(表)代谢记忆组 总蛋白、核蛋白表达条带均较正常对照组减弱抑制剂组各条带较中华实验眼科杂志 年 月第 卷第 期 .表 各组细胞、相对表达量比较()()组别样本量正常对照组 代谢记忆组 对照组 抑制剂组 值 值 注:与正常对照组相比 与 对照组相比(单因素方差分析 检验及 检验):微小:核因子 相关因子:醌氧化还原酶:血红素加氧酶:(
18、):():对照组明显增强(图)正常对照组、代谢记忆组、对照组、抑制剂组 总蛋白、核蛋白相对表达水平总体比较差异均有统计学意义(、均 )其中代谢记忆组 总蛋白、核蛋白相对表达水平较正常对照组下降 抑制剂组较 对照组明显上升差异均有统计学意义(均 )(表)1234核N r f 2H 3总N r f 2?a c t i n图 检测总蛋白及核蛋白 蛋白电泳图:正常对照组:代谢记忆组:对照组:抑制剂:核因子 相关因子:组蛋白 :细胞免疫荧光图显示、在细胞核细胞质均可见表达相较正常对照组及 抑制剂组代谢记忆组、细胞免疫荧光强度均明显减弱(图)正常对照组、代谢记忆组、对照组、抑 制 剂 组、细胞免疫荧光强度
19、总体比较差异均有统计学意义(、均 )其中代谢记忆组、荧光强度均低于正常对照组 抑制剂组、荧光强度均高于 对照组差异均有统计学意义(均 )(表)表 各组细胞 总蛋白和核蛋白相对表达量比较()()组别样本量总蛋白 核蛋白 正常对照组 代谢记忆组 对照组 抑制剂组 值 值 注:与正常 对照 组相比 与 对 照 组 相 比(单因素方差分析 检验):核因子 相关因子:微小 :():.利拉鲁肽干预后各组、及蛋白表达量比较利拉鲁肽干预后正常对照组、代谢记忆组、利拉鲁肽组、相对表达量总体比较差异均有统计学意义(、均 )其中代谢记忆组 相对表达量高于正常对照组、相对表达量低于正常对照组差异均有统计学意义(均 )
20、利拉鲁肽组 相对表达量低于代谢记忆组、相对表达量高于代谢记忆组差异均有统计学意义(均)(表)与正常对照组相比代谢记忆组 总蛋白、核蛋白条带较弱利拉鲁肽组 总蛋白、核蛋白条带明显增强(图)正常对照组、代谢记忆组、利拉鲁肽中华实验眼科杂志 年 月第 卷第 期 .5 0 m1234N r f 2D A P I5 0 m1234N Q O 1D A P I5 0 m1234H O?1D A P I融合图BAC融合图融合图5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5
21、0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m图 各组细胞、免疫荧光图(标尺)相较正常对照组及 抑制剂组代谢记忆组、细胞免疫荧光强度均明显减弱、表达于胞核胞质中呈红色荧光细胞核呈蓝色荧光(含):正常对照组:代谢记忆组:对照组:抑制剂组:核因子 相关因子:醌氧化还原酶:血红素加氧酶 ().():():表 各组、细胞免疫荧光强度比较()()组别样本量正常对照组 代谢记忆组 对照组 抑制剂组 值 值 注:与正常对照组相比 与 对照组相比(单因素方差分析 检验):核因子 相关因子:醌氧化还原酶:血红素加
22、氧酶:微小 :():():表 利拉鲁肽干预后各组细胞、相对表达量比较()、()组别样本量正常对照组 代谢记忆组 利拉鲁肽组 值 值 注:与正常对照组相比 与代谢记忆组相比(单因素方差分析 检验及 检验):微小:核因子 相关因子:醌氧化还原酶:血红素加氧酶:():():组 总蛋白、核蛋白相对表达量总体比较差异均有统计学意义(、均 )其中代谢记忆组 总蛋白、核蛋白相对表达量均低于正常对照组利拉鲁肽组 总蛋白、核蛋白相对表达量均较代谢记忆组升高差异均有统计学意义(均 )(表)细胞 免 疫 荧 光 染 色 可 见、在细胞核、细胞质中均有表达与正常对照组相比代谢记忆组、荧光均减弱代谢记忆组荧光均明显增强
23、(图)正常对照组、代谢记忆组、利拉鲁肽组、荧光强度总体比较差异均有统计学意义(、均 )其中代谢记忆组、荧光强度均低于正常对照组利拉鲁肽组荧光强度均高于代谢记忆组差异均有统计学意义(均 )(表).利拉鲁肽干预后各组细胞增生率及 含量比较 法检测结果显示正常对照组、代谢记忆组、利拉鲁肽组细胞增生率总体比较差异有统计学意义()其中与正常对照组相比代谢记忆组细胞增生率下降利拉鲁肽组细胞增生率高于代谢记忆组差异均有统计学意义()(表)检测结果显示代谢记忆组 荧光强度较正常对照组及利拉鲁肽组增强(图)正常对照组、代谢记忆组、利拉鲁肽组 荧光强度总体比较差异有统计学意义()其中代谢记忆组 相对含量高于正常对
24、照组和利拉鲁肽组差异均有统计学意义(均 )(表)中华实验眼科杂志 年 月第 卷第 期 .5 0 m123N r f 2D A P I融合图123123BAC5 0 m5 0 mN Q O 1D A P IH O?1D A P I融合图融合图5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m5 0 m图 利拉鲁肽干预后各组、免疫荧光图(标尺 )与正常对照组相比代谢记忆组、荧光均减弱利拉鲁肽组荧光均明显增强、表达于细胞核
25、、细胞质中呈红色荧光细胞核呈蓝色荧光(含):正常对照组:代谢记忆组:利拉鲁肽组:核因子 相关因子:醌氧化还原酶:血红素加氧酶 ().():():123核N r f 2H 3总N r f 2?a c t i n图 利拉鲁肽干预后各组总蛋白及核蛋白 蛋白电泳图:正常对照组:代谢记忆组:利拉鲁肽组:肌动蛋白:核因子 相关因子:组蛋白 :表 利拉鲁肽干预后各组细胞 总蛋白和核蛋白相对表达量比较()()组别样本量总蛋白 核蛋白 正常对照组 代谢记忆组 利拉鲁肽组 值 值 注:与正常对照组相比 与代谢记忆组相比(单因素方差分析 检验及 检验):核因子 相关因子:():表 利拉鲁肽干预后各组细胞、荧光强度比
26、较()()组别样本量正常对照组 代谢记忆组 利拉鲁肽组 值 值 注:与正常对照组相比 与代谢记忆组相比(单因素方差分析 检验):核因子 相关因子:醌氧化还原酶:血红素加氧酶:():():表 利拉鲁肽干预后各组细胞增生率及 相对含量比较()()组别样本量细胞增生率 相对含量正常对照组 代谢记忆组 利拉鲁肽组 值 值 注:与正常对照组相比 与代谢记忆组相比(单因素方差分析 检验及 检验):活性氧:():中华实验眼科杂志 年 月第 卷第 期 .BCA1 0 0 m1 0 0 m1 0 0 m图 利拉鲁肽干预后各组细胞 荧 光图(标尺 )代谢记忆组 荧光强度较正常对照组及利拉鲁肽组增强:正常对照组:代
27、谢记忆组:利拉鲁肽组 ():讨论代谢记忆是高血糖的延续性损伤现象参与氧化应激、糖代谢异常等病理过程 本研究发现代谢记忆引起人 细胞中 大量堆积 是氧自由基的主要成分之一 大量研究已证实氧自由基可引起氧化应激损伤抑制细胞的正常代谢功能及活性其机制涉及、/等相关通路其中 是体内强抗氧化因子可激活、等相关抗氧化靶基因降低细胞中 水平清除代谢产物 本研究发现人 细胞在去除高糖后 表达仍受到抑制对下游靶基因激活作用减弱 等研究发现 在细胞质中主要与 结合失活受到内外源刺激后立即与 解离并转入胞核内激活下游靶基因完成信号转导 本研究证实 在细胞核、细胞质中均有表达代谢记忆可抑制总蛋白及核蛋白 表达水平细胞
28、形成代谢记忆后细胞核内 含量减少对 和 的激活作用也相应减弱 是清除氧自由基的主要酶之一 主要清除外源性代谢产物当 和 表达水平不足以清除 及糖代谢产物时将引起氧化应激反应 细胞的代谢功能也随之减弱在长期高血糖状态下糖与蛋白质或脂质结合产生难以降解的代谢产物刺激细胞释放氧自由基形成代谢记忆后仍继续促进糖代谢产物堆积导致细胞持续性氧化损伤影响细胞代谢功能 因此在代谢记忆形成过程中促进 表达并维持活性状态可能有利于清除代谢产物、对抗代谢记忆损伤 本实验评估了代谢记忆对 的作用结果证明 与 呈现相反趋势可见 极有可能通过调节 参与代谢记忆形成 通过慢病毒转染抑制 表达结果验证了在人 细胞中 是 的下
29、游靶基因之一 在此基础上本研究发现抑制 不仅解除了代谢记忆对细胞核、细胞质中 表达的抑制也促进了 对 和 的激活一定程度上保护细胞免受代谢记忆损伤临床随访病例显示利拉鲁肽可延缓 进展本研究发现采用利拉鲁肽干预高糖诱导的 细胞细胞活性有所恢复所释放的 也相应减少可见利拉鲁肽具有清除氧自由基改善细胞增生活力的作用因此我们推测利拉鲁肽具有抗氧化作用其机制可能与/途径相关 本研究结果证实了这一假设利拉鲁肽干预后细胞中 表达受到抑制对下游靶基因 的负性调节作用减弱促进细胞核、细胞质中 表达这可能与减少 与 结合或促进两者解离相关 利拉鲁肽提高了细胞核中 含量也相应增强了对下游靶基因、的激活作用 随着、表
30、达增加细胞清除高糖和代谢记忆所产生的代谢产物能力增强修复并改善细胞功能及活性缓解了细胞的持续性氧化损伤 清除氧自由基还可保护 细胞的线粒体酶活性因此利拉鲁肽不仅具有降糖作用还可通过/途径激活抗氧化通路改善人 代谢功能达到抑制代谢记忆形成的目的综上所述在人 细胞中 是 的下游靶基因之一代谢记忆对人 细胞的损伤可能与 上调促进了 失活或抑制其解离相关 而利拉鲁肽可逆转这一现象其抗氧化机制可通过抑制 同时提高细胞核中 含量进而逆转细胞代谢记忆现象 因此 和 有可能成为 的治疗靶点本研究也为利拉鲁肽的临床治疗提供理论基础及实验依据利益冲突 所有作者均声明不存在任何利益冲突作者贡献声明赖巧玲:酝酿和设计
31、实验、实施研究、采集数据、统计分析、分析/解释数据、起草文章谢婷:实施研究、采集数据、统计分析黄焱:指导实验、文章审阅、修改及定稿参考文献 ./.().:/./.:./.().:./.中华实验眼科杂志 年 月第 卷第 期 .().:././.:/./.:./.().:./.().:./.().:./.:.().:./.().:././.:/./.:./.:./.().:./.().:./.().().:./.:.().:././.().:./.().:./.().:./.().:./.().:./.:.().:./.:./.(收稿日期:修回日期:)(本文编辑:刘艳 施晓萌)读者作者编者本刊对来
32、稿中作者署名的著录要求 作者向本刊投稿时署名应符合以下条件:()参与课题的选题和实验设计参与实验资料的收集、分析和论证()参与论文的起草或能够对论文中的方法学或关键部分进行修改()能对审稿专家和编辑提出的修改意见进行核修能够答辩并承担责任()对论文的诚信负责 仅参与筹得资金或收集资料者以及仅对科研小组进行一般管理者均不宜署名为作者 文中如有外籍作者应附外籍作者亲笔签名的在本刊发表的同意函 集体署名的文章应于题名下列出署名单位于文末列出论文整理者的姓名并须明确该文的主要责任者作者署名的名次应按对论文贡献大小顺序排列于文题下方每篇论文须列出通信作者 名 如无特殊约定则视第一作者为通信作者 作者(包括通信作者)的署名及其排序应在投稿前由所有研究者共同讨论确定在编排过程中不宜变更或增减尤其是通信作者和前三名作者若确需变动者须提供所有署名作者的签名同意函并出示单位证明 有英文文题的论著和综述应有全部作者姓名的汉语拼音列于英文文题之下(本刊编辑部)中华实验眼科杂志 年 月第 卷第 期 .
