1、实验研究基金项目：厦门医学院校级一流课程项目（）；厦门医学院教育教学改革研究项目 金课建设培育计划（）；福建省大学生创新创业项目（）；厦门医学院大学生创新创业项目（，）；厦门医学院校级一流课程项目（）。作者简介：蔡燕萍（），女，汉族，本科，研究方向药物分析、中药活性成分及其作用机理。：通信作者：张伟云（），女，汉族，博士，教授、硕士生导师，研究方向药物分析、中药活性成分及其作用机理。：丁香挥发油对小鼠皮肤影响的初步研究蔡燕萍，赵思烨颜伟泓林欣欣苟文韬叶明星吴艺锦张伟云 厦门医学院药学系 厦门市中药生物工程重点实验室，福建厦门 ；广州中医药大学中药学院，广东广州 【摘要】目的：为了培养学生的科学
2、素养能力，引导学生将科研课题“丁香挥发油对小鼠正常皮肤及破损皮肤的影响”设计成本科生初步研究性实验。通过考察丁香挥发油的皮肤刺激性，评价该挥发油的安全性。方法：参照 化妆品安全技术规范（版），采用急性皮肤刺激性实验和多次给药皮肤刺激实验。结果：急性皮肤刺激性实验中，实验组小鼠正常皮肤和破损皮肤的皮肤反应平均积分值都为 ；多次给药皮肤刺激实验中，实验组小鼠正常皮肤和破损皮肤的每天每只动物皮肤反应平均积分分别为 和 ，以上各组积分均小于 ，初步表明该挥发油为无刺激性。结论：广西产地的丁香挥发油对小鼠的正常皮肤和破损皮肤刺激性小，具有一定的安全性，展示了丁香一定的应用价值。该实验包含提取制备技术和急
3、性皮肤刺激性实验的原理、操作，对本科生的客观实际分析能力和解决问题能力起到正向反馈的作用，以便为学生今后进行科学研究打下初步的基础。【关键词】丁香挥发油；皮肤刺激性；小鼠；安全性【中图分类号】【文献标志码】【文章编号】（）：，；，：，“”（），；，：；中国民族民间医药 年 月第 卷第 期 ，丁香（）为桃金娘科蒲桃属植物丁香的干燥花蕾，又称为公丁香，具有药用和食用价值，为我国重点开发药材之一 。宋代 开宝本草辑副本 、证类本草 和明代 本草品汇精要 均记载丁香生交、广南番，现 中华本草 记载产于马来西亚、东非沿岸国家及印度尼西亚，我国海南、广东也有栽培。版 药典中丁香的性味归经记载为：辛，温。归
4、脾、胃、肺、肾经，有温中降逆，补肾助阳的功效，常用于食少吐泻、呃逆呕吐、心腹冷痛等病症的治疗 。丁香的干燥花蕾中含有丰富的挥发油，主要成分包括丁香酚、石竹烯和乙酸丁香酚酯 。研究表明丁香挥发油具有抗炎 、杀虫 、抗氧化 、抑菌 、麻醉 和促进透皮吸收 的药理作用。课题组曾对中药护肤、驱蚊、抑菌洗衣液进行过开发初探，因丁香挥发油具有良好的抑菌效果，所以笔者选用丁香挥发油为这款洗衣液的配方组成之一，但发现目前关于丁香挥发油安全性的研究较少，本研究旨在考察丁香挥发油的皮肤刺激性，以评价该挥发油的安全性，为进一步开发这款中药护肤驱蚊洗衣液提供一定的参考。通过将本实验引入本科生综合性实验教学，有助于巩固
5、学生对药理学理论知识的理解，提高学生的实验实践能力。实验材料 试剂脱毛膏（广州菲诺化妆品有限公司）实验动物健康 级 小鼠共 只，雌雄各半，体重 ，杭州医学院提供，生产许可证号：（浙），合格证编号：（雌）、（雄）。（自由饮食）实验条件：温度 。药物与设备中药丁香购自北京同仁堂厦门禾祥中医门诊部，产地广西。实验所用丁香由厦门大学药学院陈全成副教授和张伟云老师鉴定为桃金娘科蒲桃属植物丁香的干燥花蕾（）。电热套，邦西仪器科技上海有限公司生产；电子天平，奥豪斯仪器有限公司生产。实验方法 丁香挥发油的提取取广西丁香药材 ，分为 份，每份分别置于 圆底烧瓶中，份药材加入 倍量的蒸馏水 ，浸泡 ，采用水蒸气蒸
6、馏法加热提取丁香挥发油（沸腾前设置 ，沸腾后可降温为 ），收集丁香挥发油，转至冰箱 暂存备用。急性皮肤刺激实验（一次给药皮肤刺激实验）取 级 小鼠 只，雌雄各半，所有小鼠单笼饲养，随机分为 组，每组 只。一组为正常对照组，一组为实验组。随机分组后，对全部小鼠背部脊柱两侧脱毛，两侧脱毛范围各为 ，后进行皮肤划伤，左侧皮肤不划伤，右侧皮肤划伤为“”字形，使皮肤表面稍稍出血即可，划伤示意图如图 所示，划伤后立即涂药，空白对照组涂纯水，实验组涂丁香挥发油，给药后均用纱布覆盖，胶布固定，敷用 ，后用蒸馏水清洗涂抹部位皮肤，在清洗完涂抹部位皮肤后的 、和 时观察小鼠左右两侧涂抹部位的皮肤反应，观察小鼠涂抹
7、部位皮肤是否出现红斑、水肿等现象，按表 进行皮肤反应评分 ，以小鼠积分的平均值进行综合评价，根据 、各观察时点最高积分均值，按表 判定皮肤刺激强度 。表 皮肤刺激反应评分表皮肤反应积分红斑和焦痂形成无红斑轻微红斑（勉强可见）明显红斑中度 重度红斑严重红斑（紫红色）并有轻微焦痂形成水肿形成无水肿轻微水肿（勉强可见）轻度水肿（皮肤隆起轮廓清晰）中度水肿（皮肤隆起约 ）重度水肿（皮肤隆起超过 ，范围扩大）最高积分表 皮肤刺激强度分级表积分均值强度 无刺激性 中等刺激性 轻刺激性 强刺激性中国民族民间医药 年 月第 卷第 期 ，图 小鼠脱毛划伤示意图 多次给药皮肤刺激实验小鼠的试验方法与急性皮肤刺激实
8、验相同，每天涂抹 次，连续涂抹，去除受试物再观察 。每日观察时，需用蒸馏水清洗涂抹部位皮肤，在清洗完涂抹部位皮肤的 后再进行观察，按表 进行皮肤反应评分。结果评价：按下列公式计算每天每只动物平均积分，以表 判定皮肤刺激强度 。每天每只动物平均积分 红斑和水肿积分 受试动物数 统计学分析对每天小鼠皮肤反应积分采用 统计软件进行数据处理（对照组与实验组比较），采用配对 检验的统计学方法进行分析，计量资料以均数加减标准差（）表示，表示差异有统计学意义。结果与分析 急性皮肤刺激性实验（一次给药皮肤刺激实验）一次给药后，经观察，发现所有小鼠除了表现较为躁动外，未见全身中毒的现象，无死亡，各组小鼠的行为、
9、活动、排泄、饮食以及外观体征均无异常。正常对照组小鼠和实验组小鼠的左侧完整皮肤和右侧破损皮肤在清洗完挥发油的 、的时刻均未发现红斑、水肿等现象。统计分析结果显示，正常对照组与给药正常皮肤组皮肤反应积分比较，正常破损皮肤组与给药破损皮肤组皮肤反应积分比较，统计学无显著性差异（），各个时间点皮肤反应积分均值和皮肤刺激强度评价见表 ，急性皮肤刺激性实验中小鼠代表性皮肤反应的照片如图 所示。该结果提示丁香挥发油对小鼠正常皮肤和破损皮肤均无刺激性。表 急性皮肤刺激实验小鼠皮肤反应积分值（）时间 组别平均皮肤反应积分值 最高分值刺激强度评价正常对照皮肤组无刺激性正常破损皮肤组无刺激性给药正常皮肤组无刺激性
10、给药破损皮肤组无刺激性 无红斑、水肿的照片 无红斑、水肿的照片图 急性皮肤刺激性实验中小鼠皮肤反应代表性图 多次给药皮肤刺激实验多次给药后，每日观察发现所有小鼠除了表现较为躁动外，未见全身中毒的反应，无死亡，各组小鼠的行为、活动、排泄、饮食以及外观体征均无异常。正常对照组小鼠左右两侧皮肤均正常，无出现红斑、水肿等情况。实验组的小鼠前 中，每日有 只小鼠右侧破损皮肤出现了不同程度的红斑、水肿，而 内实验组小鼠的左侧正常皮肤未出现红斑、水肿的情况。停止涂抹挥发油后的第二天开始，小鼠右侧破损皮肤涂抹挥发油部位的红斑与水肿消退，两侧皮肤渐渐均呈现正常状态。统计分析结果显示，空白正常皮肤组与给药正常皮肤
11、组皮肤反应积分比较，空白破损皮肤组与给药破损皮肤组皮肤反应积分比较，统计学无显著性差异（），各组每日皮肤反应积分值见表 ，皮肤刺激强度评价见表 ，多次给药皮肤刺激实验中小鼠代表性皮肤反应的图片如图 所示。中国民族民间医药 年 月第 卷第 期 ，表 多次给药皮肤刺激实验小鼠皮肤反应积分值表（，）组别 时间正常对照组（纯水）实验组（挥发油）正常皮肤破损皮肤正常皮肤破损皮肤（给药）（给药）（给药）（给药）（给药）（给药）（给药）（不给药）（不给药）（不给药）（不给药）（不给药）（不给药）（不给药）表 多次给药皮肤刺激实验皮肤刺激强度评价（）组别 时间 动物平均积分 只总体评价正常对照皮肤组无刺激空白
12、破损皮肤组无刺激给药正常皮肤组无刺激给药破损皮肤组 无刺激注：表中记录积分为所有小鼠每天的红斑和水肿积分。有轻微红斑的照片 有明显红斑的照片 有轻微红斑、轻微水肿的照片图 多次给药皮肤刺激实验中小鼠皮肤反应代表性图中国民族民间医药 年 月第 卷第 期 ，讨论与结论皮肤刺激实验指的是使用产品前要评估其引起皮肤刺激的相关测试，它包括急性皮肤刺激实验和多次皮肤刺激实验两种方法。单次皮肤刺激试验考察被检物对皮肤的直接刺激性和程度 ，多次皮肤刺激试验不仅能反映被检物对皮肤的直接刺激，而且还能反映被检物对皮肤中远期的慢性累积性刺激 。在急性皮肤刺激实验中，经过 连续经完整皮肤和破损皮肤给药，小鼠正常皮肤和
13、破损皮肤的皮肤反应平均积分值为 ，小于 ，未见中毒的反应，这提示使用者在单次使用或偶尔使用时具有一定的安全性，但急性皮肤刺激试验只对较强的刺激原敏感，不能完全说明丁香挥发油外用的安全性，所以课题组开展了多次给药皮肤刺激，在这个实验对强刺激原敏感，对弱刺激原也敏感，可考察每日使用或连续数日使用丁香挥发油对皮肤刺激的有无及大小，经过 天的给药，实验组中个别小鼠的涂抹挥发油的破损皮肤部位出现轻微红斑、明显红斑、轻微水肿、轻度水肿等现象，经计算，实验组小鼠正常皮肤和破损皮肤的每天每只动物皮肤积分值分别为 和 ，均小于 ，以表 评定皮肤刺激强度，丁香挥发油对小鼠正常皮肤和破损皮肤均无刺激性，而针对破损皮
14、肤出现局部皮肤反应的现象，可解释为外用药对破损皮肤稍具刺激性的普遍表现，使用时保证给药皮肤的完整性即可避免 。丁香挥发油作为丁香的主要药效部位，化学成分丰富，药理作用广泛，具有广阔的应用前景 。研究结果表明，丁香挥发油对小鼠的正常皮肤和破损皮肤刺激性小，具有一定的安全性，该实验结果为前期课题组中药护肤驱蚊抑菌洗衣液进一步的开发提供了理论参考，也可后期丁香其他的产品的应用和开发提供新的思路，展示了丁香一定的产业应用价值，但是该实验仅在一种实验动物上进行实验，而且数据出现了标准差大于均数的情况，表明数据呈偏态分布的现象，可能是因为实验动物的个体差异性大所导致实验结果具有局限性，仍需在多种实验动物上
15、进行实验互相验证，并扩大或采用人重组皮肤模型进一步实验，以获取更加可靠的结果。整个实验涉及中药化学的提取制备方法与技术、药理学实验的基本操作与技能，有利于激发学生科研兴趣，培养学生创新思维。参考文献 张小飞，万娜，王学成，等丁香挥发油理化性质、提取工艺参数与其芳香水稳定性的相关性研究 中草药，（）：宋卢多逊开宝本草辑副本 尚志钧，辑校合肥：安徽科学技术出版社，：宋唐慎微证类本草 尚志钧，等校点北京：华夏出版社，：明刘文泰本草品汇精要 曹晖，校注北京：华夏出版社，：国家中医药管理局 中华本草编委会中华本草 上海：上海科学技术出版社，：李莎莎，李凡，李芳，等丁香的化学成分与药理作用研究进展 西北药
16、学杂志，（）：陈志雄，李友霞，赵世兴，等丁香花蕾油的分子蒸馏分离及 分析 香料香精化妆品，（）：杨冰，李婷婷，杨伊涵，等丁香油抗炎镇痛效果的研究 绿色科技，（）：涂小芳香辛料精油的提取及其杀虫、抑菌活性研究 合肥：合肥工业大学，美丽，朱懿敏，罗晶，等丁香化学成分、药效及临床应用研究进展 中国实验方剂学杂志，（）：安同伟，陈庆忠，孙建，等丁香酚的最优提取方法及药理作用 山东畜牧兽医，（）：赵婷婷，张彤，项乐源，等当归、丁香挥发油的促透皮吸收作用 中成药，（）：高保栓，王宁，黄丽华，等正交实验优选丁香挥发油提取工艺研究 时珍国医国药，（）：国家食品药品监督管理总局化妆品安全技术规范 版北京：中国标准出版社，：王学民，陈霞凤，叶曼莉，等豚鼠多次皮肤刺激试验结果分析 中华皮肤科杂志，（）：，张琪薇，陈争光，万力生小儿推拿退热乳的皮肤刺激性及过敏性实验研究 时珍国医国药，（）：王萍，汪镇朝，刘英孟，等丁香挥发油的化学成分与药理作用研究进展 中成药，（）：（收稿日期：编辑：刘斌）中国民族民间医药 年 月第 卷第 期 ，
