1、2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 丁香酚酯及肉桂醇酯对氟比洛芬透皮吸收的影响王晶1，张金伟1，张艺蓉1，万旭春1，尹虹1，李翰铭1，赵利刚1，2（1.华北理工大学药学院 唐山 063210；2.唐山市新型药物制剂与释药技术重点实验室 唐山 063210）摘要：目的通过对芳香族挥发油中的肉桂醇（CIN）、丁香酚（EUG）成分进行结构改造，寻找促透效果更好且安全性高的经皮给药促透剂。方法以CI
2、N、EUG为先导化合物，采用酰氯酯化法合成硬脂酸肉桂醇酯（CIN-C18）和硬脂酸丁香酚酯（EUG-C18），通过体外经皮渗透实验、体外释放实验、分子模拟技术和红外光谱法初步探究其促透机制。结果以EUG-C18为促透剂时，FP的24h经皮累积透过量（Q24h）可达到（295.0345.08）gcm-2，与其他组相比较，均有显著的促透效果（P98%。CIN-C18：1H-NMR(600 MHz,CDCl3)：7.48-7.40(6H,m),7.36(6H,dd,J=8.4,6.8 Hz),7.34-7.27(5H,m),6.69(3H,d,J=15.6 Hz),6.35(3H,dt,J=15.7
3、,7.2 Hz,),4.28(6H,dd,J=7.2,1.2 Hz,),7.61-0.70(10H,m),1.28(4H,s),0.91(1H,t,J=6.9 Hz).产率：76.5%。EUG-C18：1H-NMR(600 MHz,CDCl3)：7.05-6.69(3H,m),5.98(1H,ddt,J=16.9,10.1,6.7 Hz),5.25-4.86(2H,m),4.15(3H,q,J=7.2 Hz),3.83(4H,s),3.40(2H,dd,J=6.7,1.6 Hz),2.58(2H,t,J=7.5 Hz),2.31(4H,t,J=7.5 Hz),1.90-1.70(3H,m),1
4、.65(4H,q,J=7.4 Hz),1.44-1.37(2H,m),1.36-1.11(12H,m),0.90(4H,t,J=7.0 Hz)。产率：77.4%。2.2体外分析方法的建立及方法学考察2.2.1色谱条件Hypersi ODS 色谱柱（4.6 mm150 mm，5 mm）；流动相：甲醇-含1%冰乙酸的水溶液（55:45，v/v）；检测波长：247 nm；柱温 40；流速：1.0 mLmin-1；内标为40 gmL-1尼泊金异丙酯溶液。2.2.2标准曲线方程精密称量20.01 mg的FP于容量瓶中，加入甲醇定容，稀释至200 gmL-1，再稀释为浓度为0.2-100 gmL-1的FP
5、溶液。分别加入等体积、浓度为40 gmL-1尼泊金异丙酯溶液。以尼泊金异丙酯为内标物，通过HPLC进行溶液检测，分析药物与内标的峰面积比值（Ai）随模型药物的不同浓度（C）的变化曲线。对数据进行线性拟合，得到回归方程：Ai=0.0304C+0.0046，r=0.9999。证明在0.2-100 gmL-1范围内，二者具有良C17H35COOHSOCl2C17H35COClOC17H35O123456789OHOHOCH3OCH3OC17H35O123456(a)(b)(c)(d)图1CIN-C18、EUG-C18的合成路线注：a：CIN；b：EUG；c：CIN-C18；d：EUG-C18。179
6、7 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 好的线性相关性。2.2.3精密度日内精密度测定需在1天时间内对高、中、低3个浓度下的样品进行分析，日间精密度测定选用相同浓度样品连续3天进样分析，得到3种浓度的日内精密度均值分别为 RSD：（0.980.13）%、（0.910.19）%和（1.120.37）%（n=6），日间精密度均值分别为 RSD：（0.950.17）%、（0.980.29）%和（1
7、.030.41）%（n=6）。2.2.4回收率通过计算高、中、低三种药物浓度的比来确定回收率，得到FP平均加样回收率分别为（97.860.52）%、（98.360.36）%和（99.030.23）%（n=6）。2.3体外透皮实验2.3.1离体兔皮的制备选取体质量（2000200）g的家兔，以质量浓度为20%的乌来糖溶液作为麻醉剂，将其背部朝上固定于兔台，用修剪器除去背部长毛后，用剃须刀除去细密绒毛。待皮肤裸露后，采用空气栓塞法处死大耳兔。之后，迅速剥离背部皮肤，剔除皮肤中的脂肪和结缔组织，裁剪成1cm2，于生理盐水下冲洗数次，之后置于密封袋中低温（-80）冷冻保存。兔皮须在7天内使用，使用前应
8、当保证其完整无破损。2.3.2贴剂的制备称取FP溶于乙酸乙酯溶液中，与促透剂、压敏胶混合，置于磁力搅拌器上搅拌15 min至混匀，静置脱气10 min直至气泡消失，将混合物均匀转移到硅酮纸上，室温下放置 10 min 挥发溶剂，于 50下烘干15 min，覆上背衬膜备用。同上制备含有促透剂（挥发油及其酯）的 FP 贴剂，处方中 FP、压敏胶（DURO-TAK 87-235A）的比例保持不变。2.3.3体外渗透实验方法采用水平卧式双室扩散池为实验装置，以离体兔皮为透过屏障，在其角质层一侧贴敷制备好含（不含）促透剂的贴剂，加入3.5 mL pH=7.4的PBS溶液，加入磁转子，32下恒温搅拌。于2
9、、4、6、8、10、12、24 h取样2 mL，同时补充2 mL PBS溶液。在4，4000 rmin-1条件下离心5 min，取300 L上清液与等量内标液混匀，经高效液相色谱仪分析测定含量。计算单位面积累积透过量（Q）。以Q对时间t作图，直线的斜率为稳态透皮速率（Jss），直线与横轴的交点为时滞（tlag），并计算增渗比（ER，即加入促透剂与不加促透剂时药物Q24h之比）2.4体外释放实验选择FP贴剂（含或不含促透剂）进行药物释放度测定。在（320.5）下进行实验，取磷酸盐缓冲溶液（900 mL）注入溶出杯中，将贴剂释放面朝上固定于碟网之间，并与桨底相距（252）mm 处平行放置13，于0
10、.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h取样5 mL，同时补充5 mL缓冲溶液。样品经微孔滤膜（0.45 m）过滤后在室温下4000 rmin-1下离心5 min，与同体积内标液混合，涡旋20 s，通过HPLC检测。2.5分子模拟Materials Studio 7.0软件用于模拟促透剂-模型药物-神 经 酰 胺 三 者 之 间 相 互 作 用 的 影 响。从ChemDraw 16.0 中 获 得 模 型 药 物（FP）、神 经 酰 胺0481216202428050100150200250300350400Time(h)Q24(g/cm2)None1%CIN3%CIN5%CIN(A)0
11、481216202428050100150200Time(h)Q24(g/cm2)None3%EUG1%EUG5%EUG(B)图2含有不同浓度挥发油的贴剂中FP的经皮渗透曲线（x s,n=4）注：A：CIN；B：EUG。表1挥发油及其硬脂酸酯对FP的经皮渗透影响（x s,n=4）促透剂ControlCINEUGCIN-C18EUG-C18Jss（gcm2h-1）6.070.8911.661.268.421.2412.181.3212.811.88Q24h（gcm-2）106.528.35205.0429.28*161.5725.17*254.5233.27*295.0345.08*tlag/（
12、h）3.583.872.481.410.22ER1.001.921.522.402.77注：与Control相比，*P0.05；与CIN、EUG相比，*P0.05。1798 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中药制剂研究（CER-NP）及促透剂（CIN、EUG、CIN-C18、EUG-C18）结构，在COMPASSII力场下，首先在Forcite模块下对结构进行优化，其次在Blend模块下进行化合物的混合，寻找最优构
13、象，最后在Dreding力场下计算各化合物间结合的键能及键长。2.6ATR-FTIR剔除兔背部毛发，标记15个的不同区域（面积为1.0 cm2），随机分 5 组（A：无水乙醇，B：1%CIN，C：3%EUG，D：CIN-C18，E：EUG-C18），并向区域内涂抹20 L含（不含）促透剂的无水乙醇溶液，渗透30 min后以空气栓塞法处死大耳兔，剥离背部皮肤（标记区域），室温下干燥15 min，利用ATR-FTIR光谱仪进行检测，其中内反射晶体为硒化锌（ZnSe），入射角为45，角质层朝下置于检测器上，在1000-4000 cm-1的检测波长范围内扫描20次，使用Origin 7.0软件对红外吸
14、收峰进行分析。2.7组织学评价剔除兔背部毛发，标记5个面积为1.0 cm2的区域，涂抹20 L含（不含）促透剂的无水乙醇溶液，5个区域分 别 为（A：无 水 乙 醇，B：1%CIN，C：3%EUG，D：1%CIN-C18，E：3%EUG-C18）。渗透1 h后，采用空气栓塞法处死大耳白兔，剥离给药区域背部皮肤，4%多聚甲醛溶液固定后将其包埋在石蜡块中，冠状切片，后用苏木精-伊红染料进行染色。组织切片均在Olympus显微镜下，10倍镜观察14。2.8统计学方法实验数据采用平均值标准差（x s）表示。使用方差分析（ANOVA）进行显著性检验，显著性水平设为P0.05。采用统计分析系统 SPSS
15、21.0 对实验结果进行统计分析处理，并使用t检验对相关系数的显著性（P0.05）进行检验。3 实验结果 3.1最佳促透浓度的筛选按“2.3.2”项下的方法分别制备含 1%、3%和 5%挥发油的FP透皮贴剂，按“2.3.3”项下的方法进行体外经皮渗透实验。以经皮累积透过量（Q24h）为纵坐标、T为横坐标绘制经皮累积渗透曲线，结果见图2。由图可知，含有不同浓度的挥发油对FP的促透效果均显著高于空白组（P0.05），故选择较小浓度1%进行后续实验。当EUG浓度为3%时，促透效果最佳。在随后的实验中，挥发油酯的浓度与挥发油类化合物等摩尔浓度。3.2最佳促透剂的筛选按“2.3.2”项下的方法制备含挥发
16、油酯的贴剂，考察挥发油及其酯对 FP经皮渗透参数的影响，结果见表1。从结果上看，与空白组相比，CIN、EUG显著增强FP 的经皮透过量，其中对 FP 的增渗比分别为 1.92，1.52。体外经皮促透实验表明，促透剂组均能够显著提高FP的经皮渗透（P0.05），EUG-C18对FP产生的促透量最大，Q24h达到（295.0345.08）gcm-2，CIN-C18仅次于EUG-C18（P0.05）。结果发现，CIN的促透效果优于EUG，而EUG-C18的促透效果优于CIN-C18。3.3体外释放实验如图3所示，为含或不含促透剂的FP贴剂的24 h内体外释放百分比，所选用促透剂分别为 1%CIN、3
17、%EUG、1%CIN-C18、3%EUG-C18，所有加入促透剂均显著增强了FP的释放（P CIN-C18CINEUG。3.4分子模拟如图 4 所示，分别为使用 Materials Studio 软件计算得到的FP-CER-NP及FP-促透剂-CER-NP的最小能量复合物。所有系统计算的氢键键能如表2所示，结果表明促透剂组计算的氢键键能绝对值均显著高于FP与CER-NP。048121620240102030405060Time(h)Cumulative release(%)NoneCIN-C18CINEUGEUG-C18图3含有挥发油及其硬脂酸酯的FP贴剂的累积释放度（x s,n=4）1799
18、 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 3.5ATR-FTIR通过ATR-FTIR检测特征峰位移情况，判断角质层“三明治”结构中烃链的有序度15。乙醇不会改变皮肤脂质烃链的排列方式及空间构象，且挥发快，短时间内可以恢复角质层屏障功能16。皮肤角质层的主要成分是脂质、角蛋白和水，在ATR-FTIR中，脂质的特征吸收峰为 vsCH2=2848.69cm-1及 vasCH2=2918.12cm-1，
19、反映脂质侧链自由度水平的指标可用CH2伸缩振动峰位移表示，波数位移的大小与CH2的偏转/全反构象体的比例有关17。角蛋白的特征吸收峰分为酰胺带（1639.39cm-1）及酰胺带（1544.89cm-1），代表蛋白质的二级结构-螺旋及-折叠18，除此之外，角质层中OH的振动吸收峰为3278 cm-1。由图5可见，与对照组相比，实验组中皮肤角质层中脂质的CH2对称及不对称振动均向高波数发生移动，其中，EUG-C18位移变化最大，除CH2振动吸收峰发生改变外，酰胺带的位移值也发生改变，均发生了蓝移现象，同时，角质层中OH的振动吸收峰也均向高波数发生移动。3.6组织学评价如图6所示为在10倍放大倍数下
20、，含或不含促透剂的兔皮肤组织切片图像，图6a为对照组下的皮肤细胞形态，可清晰观察到角质层（角质层紧密排列在活表2分子模拟计算各组氢键键能组别FP-NPFP-CIN-NPFP-EUG-NPFP-CIN-C18-NPFP-EUG-C18-NP氢键键能（kcalmol-1）-1.191-1.826-1.701-2.328-2.5324000350030002500200015001000Reflction(%)Wave number(cm-1)3286.273280.483280.483288.193278.552921.772917.922919.842919.842917.922854.2728
21、52.342852.342852.342848.481631.561639.271637.471639.271646.99vasCH2amide I bandvsCH2(A)(B)(C)(D)(E)图5含或不含促透剂的皮肤ATR-FTIR光谱图注：A：control；B：CIN；C：EUG；D：CIN-C18；E：EUG-C18。图4FP、促透剂与NP间的氢键相互作用注：碳原子呈灰色，氧原子呈红色，氮原子呈蓝色，氢原子呈白色；氢键以黑色虚线表示。图6含或不含促透剂的兔皮肤组织学切片注：a：空白组；b：以CIN为促透剂；c：以EUG为促透剂；d：以CIN-C18为促透剂；e：以EUG-C18为促
22、透剂。A：水疱；B：水肿；C：角化过度1800 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中药制剂研究性表皮上，角质层呈带状均匀分布）和附属器官，未观察到角质层脱落，且未见任何炎症细胞。经促透剂处理后的大耳兔皮肤组织切片可明显观察到角质层变薄，一些区域外层角质呈带状游离，并且在表皮区有空腔出现，表明挥发油及其酯改变了皮肤角质层有序致密结构，使其变得疏松，从而降低了皮肤的屏障作用。组织学切片结果表明促透剂仅会对皮肤产生的轻微的
23、刺激性，并不会对皮肤细胞产生毒性。4 讨论 促透剂的作用机制主要是通过可逆性改变皮肤角质层结构来增加药物的经皮渗透量。近年来对挥发油类促透剂的研究显示，其作用于皮肤后可不同程度地改变皮肤的生理结构，增加其通透性且刺激性较小。但因其易挥发，不利于制剂的质量控制，限制了在经皮给药制剂中的应用。本文参考课题组之前的研究，选取了芳香族两种典型的挥发油醇酚成分，即肉桂醇和丁香酚，结合前期研究发现肉桂醇可以与皮肤中的神经酰胺产生更强的氢键作用，其促透能力强于肉桂醛，同时肉桂醛在透皮吸收时会转化为肉桂醇5，因而本文选用肉桂醇；且因贴剂在制备过程中需加热，肉桂挥发油、丁香挥发油作为促透剂稳定性较差19-20，
24、本文对其结构进行酯化改造，以期改善挥发性且提高促透活性，同时不会增加其皮肤刺激性，并探究了酯类衍生物对FP的促透效果及作用机制。体外经皮促透实验表明，挥发油对FP具有一定的促透活性，这表明丁香酚可通过影响皮肤角质层的角蛋白构象来增加其流动性从而发挥经皮促透作用；而肉桂醇可通过扰乱脂质侧链的有序排列使细胞间隙增大，增加药物经皮渗透量。同时研究表明挥发油酯的促透活性优于挥发油组，这表明脂肪酸酯可通过干扰脂质双分子层侧链的空间排列顺序来提高药物的经皮渗透量并缩短时滞21。组织学切片显示，在加入挥发油酯后有轻微水肿现象出现，但并未对皮肤活性造成影响，且在短时间内可以恢复，这表明其刺激性低。体外释放研究
25、表明，所有促透剂均可增加药物释放，而EUG-C18、CIN-C18比EUG、CIN更容易使药物释放。这可能是由于促透剂可以通过形成自由体积的填充剂来减少药物与压敏胶的相互作用，从而促进药物释放22，而成酯后因其更容易占据压敏胶中氢键而形成位点，从而产生更多的自由药物分子，增加药物的释放。分子模拟结果表明促透剂与NP混合后的氢键键能绝对值均显著高于FP-NP，可能是由于促透剂与神经酰胺结合后导致脂质结构被扰乱致使更多FP游离而增加皮肤渗透量。ATR-FTIR 研究表明应用促透剂后SC脂质烷基侧链的自由度增大，分子间结合力减弱，角蛋白的二级结构可能受到促透剂的空间位阻效应而产生了挤压，使其排列发生
26、变形，导致角蛋白分子间的空隙增加23，同时二级结构的改变可能会造成角蛋白中的氢键网络发生断裂，扩张了角质细胞24，OH振动吸收峰向高波数移动可能角质细胞含水量增加而膨胀有利于FP的透过25，无论是CH2的对称及不对称吸收峰、酰胺 I带及 OH 振动吸收峰，EUG-C18显示了最大的位移变化，这为其具有最优促透能力提供了合理的解释。综上所述，来源于芳香族挥发油的EUG及CIN均可增加FP的经皮渗透量，结构改造后的酯类衍生物通过促进FP从压敏胶中的释放、影响SC中角蛋白的构象及扰乱脂质侧链顺序来增加FP的经皮渗透。其中，EUG-C18具有较好的经皮促透活性和较低的皮肤刺激性，值得进一步深入研究。参
27、考文献 21梁佳敏,李楠,徐海蓉,等.经皮给药系统的体外释放、透皮特性及体内药动学研究进展.武警后勤学院学报(医学版),2013,22(12):1137-1140.2Chen M L,Quan G L,Sun Y,et al.Nanoparticles-encapsulated polymeric microneedles for transdermal drug delivery.JJ Control Release,2020,325:163-175.3王艳宏,刘书博,王锐,等.中药挥发油促透皮吸收及透皮吸收作用的研究进展.中国实验方剂学杂志,2017,23(3):192-199.4赵亚男,
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36、 Effect Evaluation of the AromaticVolatile Oil StearateWang Jing1，ZhangJinwei1，Zhang Yirong1，Wan Xuchun1，Yin Hong1，Li Hanming1，Zhao Ligang1,2(1.School of Phamacy,North China University of Science and Technology,Tangshan 063210,China；2.Tangshan Key Labof Novel Preparations and Drug Release Technolog,
37、Tangshan 063210,China)Abstract:ObjectiveIn the present research,3-phenyl-2-propen-1-yl stearate(CIN-C18)and 4-allyl-2-methoxy-1-yl stearate(EUG-C18)were synthesized by Cinnamic alcohol(CIN)/Eugenol(EUG)and stearic acid using acyl chloride esterification method.The percutaneous absorption of Flurbipr
38、ofen(FP)was evaluated usingVolatile oil and its stearateas the enhancer.MethodsIn addition,the penetration promoting activity of on FP was investigated,and its penetration mechanism was studied using in vitro release experiment,ATR-FTIR and molecular docking technology.ResultsThe results showed that
39、 when EUG-C18 was used as the penetration enhancer,the 24h cumulative transdermal flux of FP(Q24h)could reach(295.0345.08)mgcm-2,which had a significant penetration enhancing effect as compared with other groups(P0.05).EUG-C18 not only destroys the hydrogen bond interaction between the drug and the
40、ceramide,increasing lipid mobility,but also acts on the keratin and promotes hydration,thereby promoting the penetration of FP.ConclusionEUG-C18 exhibits a significant penetration enhancer for FP,and it is expected that EUG-C18,as a novel penetration enhancer,will be widely used in transdermal drug delivery systems.Keywords:Flurbiprofen,Volatile oil,Transdermal drug delivery,Penetration mechanism（责任编辑：李青）1802
