1、Technique express科技广场14Vol.46 No.10 Oct.2023对羟基苯乙酮的舒缓和控油功效研究郭沈涛1，徐文枫1，牛 强1，张煜玲1，龙 艳2，彭春梅2(1.广东悠质检测技术有限公司，广东 广州 510450；2.广东芭薇生物科技股份有限公司，广东 广州 510450)摘 要：体外细胞方法评价对羟基苯乙酮的舒缓功效和控油功效，为其在化妆品中的应用提供新的功效依据。研究采用LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7株和睾酮诱导的皮脂腺细胞SZ95株，测定对羟基苯乙酮对一氧化氮（NO）、TNF-、IL-6和油脂合成的抑制作用。结果显示，对羟基苯乙酮可显著抑制LPS诱导的巨噬细
2、胞NO、TNF-和IL-6含量（p0.01），0.05mg/mL的对羟基苯乙酮对油脂合成的抑制率为17.64%（p0.001）。研究表明对羟基苯乙酮可降低细胞的炎症反应，抑制油脂的分泌，具有一定的舒缓和控油效果。关键词：对羟基苯乙酮；舒缓；控油；功效中图分类号：TQ658 文献标识码：A 文章编号：1006-7264(2023)10-014-04DOI：10.3969/j.issn.1006-7264.2023.10.004对羟基苯乙酮（p-Hydroxyacetophenone，p-HAP）是一种具有利胆退黄1、解热镇痛2、促胆汁分泌和降血脂3,4等作用的天然植物提取物，也是一种重要的精细有
3、机化学品5，可用于香料的制取。皮肤刺激主要是刺激物质破坏皮肤屏障后引起的毛细血管通透性增加，黏膜腺体分泌增多等症状，常伴有皮肤红肿、瘙痒、斑块等现象6。随着皮肤屏障的破坏，各种刺激物会诱导角质形成细胞释放IL-6、IL-8、TNF-等炎症因子，从而引发皮肤免疫炎症反应7,8。研究发现，p-HAP可能通过NF-kB信号通路在体内和体外减少氧化应激和细胞凋亡9，提示其可能具有抑制炎症反应的功能。油性皮肤是因人体皮脂腺分泌旺盛、皮脂腺功能失常所产生的，TNF-能通过JNK和PI3K/Akt通路促进皮脂合成10，由于p-HAP具有一定的抗炎效果，因此也可能具有抑制皮肤油脂合成的功效。目前，对羟基苯乙酮
4、在化妆品中常被作为防腐剂11，在一定使用浓度下，引起皮肤刺激、眼刺激以及皮肤致敏的风险很低12。但由于其不在化妆品安全技术规范规定的防腐剂目录中，在配方中常被标注为抗氧化剂。然而，关于对羟基苯乙酮在化妆品的其他功效研究很少。本研究将通过体外细胞模型，探讨对羟基苯乙酮在舒缓和控油方面的功能，为其作为功效原料在化妆品的应用提供数据支持。1实验部分1.1主要材料、试剂与仪器小鼠巨噬细胞RAW264.7株，中国科学院；人皮脂腺细胞SZ95株，复旦医学院；DMEM细胞培养基、胎牛血清、0.25%EDTA胰酶，美国Gibco公司；格里斯试剂（Griess Reagent）、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（D
5、MSO）、睾酮、尼罗红，美国Sigma公司；TNF-ELISA检测试剂盒，英国Abcam公司；IL-6 ELISA检测试剂盒，武汉华美生物工程有限公司；对羟基苯乙酮，广东芭薇生物科技股份有限公司提供。CO2培养箱，美国Thermo公司；荧光显微镜，德国徕卡公司；多功能酶标仪，瑞士tecan公司。1.2实验方法1.2.1 细胞培养分别培养RAW264.7细胞和SZ95细胞。将生长情况良好、长成致密单层的细胞消化或吹散后，计数，调节适宜浓度加入96孔细胞培养板中，100 L/孔。将细胞板盖好，封边，置温度（371）、CO2 5.0%1%条件下培养2448 h，每天相差显微镜观察细胞形态和生长情况，
6、至细胞融合度达50%以上时加样检测。1.2.2 LPS诱导巨噬细胞NO、TNF-和IL-6含量测试参考团体标准方法13，选择长满良好单层的96孔板巨噬收稿日期：2023-06-07作者简介：郭沈涛（1984-），男，硕士，电话：（020）32756099，E-mail：。Technique express科技广场15第46卷2023年第10期表1 LPS诱导巨噬细胞模实验结果Tab.1 Effectsofp-HAPonNO,IL-6andTNF-inLPS-inducedRAW264.7实验分组加药情况NO相对含量/%IL-6/（pg/mL）TNF-/（pg/mL）BC/20.740.821.
7、620.18688.49NCLPS1001.2099.361.688 71896.17PCLPS+地塞米松磷酸钠87.571.79*2.180.00*6 610130.11*p-HAP0.1 mg/mL84.041.35*70.281.22*7 40887.68*0.01 mg/mL101.951.1575.911.49*8 44222.630.001 mg/mL100.161.7890.651.19*8 362186.68细胞RAW264.7株，弃掉96孔板中的培养基，加入无细胞毒性浓度的样品溶液50 L，同时设空白/溶剂对照（BC）、模型组（NC）和阳性对照组（PC），每组各加6孔。其中B
8、C和NC组为细胞培养基，PC组为地塞米松磷酸钠溶液。加样后，BC组补加50 L细胞培养基，其他组每孔加入50 L含有 LPS 的细胞培养基。加样完毕后将96孔板放置于37，5%的CO2培养箱中培养（242）h。孵育培养结束后，每孔收集50 L细胞培养上清液与50 L的Griess试剂充分混合后，于暗处反应10 min，用酶标仪在540 nm处检测A值，计算NO相对含量。同时，收集上清液按照ELISA检测试剂盒说明书测定TNF-、IL-6含量。NO相对含量=A样品/ANC100%式中，A样品指样品组的A值均值，ANC为模型对照组（NC组）的A值均值。1.2.3 皮脂腺细胞油脂合成实验选择长满良好
9、单层的96孔板皮脂腺细胞SZ95株，弃掉 96 孔板中的培养基，加入无细胞毒性浓度的样品溶液50 L，同时设空白/溶剂对照（BC）、模型组（NC）和阳性对照组（PC），每组各加6孔。其中BC和NC组为细胞培养基，PC组为地塞米松磷酸钠溶液。加样后，BC组补加50 L细胞培养基，其他组每孔加入50 L含有睾酮的细胞培养基。加样完毕后将96孔板放置于37，5%的CO2培养箱中培养（242）h。培养结束后弃掉上清液，用PBS清洗1遍，每孔加入100 L尼罗红工作液，37 下避光反应20 min，在Ex/Em=485 nm/565 nm处检测荧光强度。油脂抑制率=1 （MFI样品MFIBC）/（MFI
10、NCMFIBC）100%式中，MFI样品、MFINC、MFIBC分别为样品组、NC和BC的荧光强度均值。1.2.4 数据统计分析采用t检验进行显著性分析，P0.05时为具有显著性差异，否则无统计学差异。2结果与讨论2.1NO、TNF-和IL-6 测试炎症是一种重要的免疫反应，它能使机体在感染或组织损伤期间存活，并在各种有害条件下维持体内平衡14。本研究探讨了p-HAP的抗炎作用是否可能与抑制参与炎症反应的一些重要细胞因子有关。实验结果显示，RAW264.7株经LPS诱导后，模型组NO、TNF-、IL-6水平显著提高（P0.05），0.001 mg/mL的p-HAP可显著降低IL-6水平（p0.
11、05），且随着p-HAP浓度增大，IL-6水平越低。另外，0.1 mg/mL组的NO、TNF-含量降低，与NC组相比，具有统计学差异（p0.01）；0.001 mg/mL及0.01 mg/mL的p-HAP对NO、TNF-含量无明显抑制（P0.05）。结果详见表1。敏感性皮肤（SS）受到物理、化学、精神等因素刺激时皮肤易出现灼热、刺痛、瘙痒及紧绷感等主观症状，伴或不伴红斑、鳞屑、毛细血管扩张等客观体征15。炎症反应是皮肤应对外部刺激产生的自我防御机制，皮肤刺激后相关炎症因子水平会明显提高16。Chang Ching-Wen等17在小鼠模式上发现p-HAP可抑制NF-B、环氧合酶-2和一氧化氮（N
12、O）的产生，同时降低了促炎细胞因子TNF-、IL-1b和IL-6的水平，且降低了福尔马林诱导的第二阶段的伤害性感受反应，而这种镇痛作用可能归因于其抗炎作用。本研究采用细胞模型，同样发现p-HAP可显著降低促炎细胞因子NO、TNF-和IL-6的水平，结合皮肤刺激机理及化妆品舒缓功效的定义，说明p-HAP在化妆品的应用中具有一定的舒缓功效。注：与NC比较，*p0.05，*p0.01，*p0.001Technique express科技广场16Vol.46 No.10 Oct.20232.2细胞油脂合成油性皮肤是因人体皮脂腺分泌旺盛、皮脂腺功能失常所产生的。皮脂腺分泌异常通常会带来痤疮等皮肤性问题。
13、化妆品控油功效，指有助于减缓施用部位皮脂分泌和沉积，或使施用部位出油现象不明显18。皮脂腺细胞是皮肤油脂合成的场所，抑制细胞油脂合成是控油功效的最直接途径。表2 细胞油脂测试结果Tab.2 InhibitionoflipidformationinSZ95humansebocytestreatedwithp-HAP实验分组浓度/（mg/mL）平均荧光单位SD值抑制率/%显著性BC/186.330.48/NC/549.173.59/PC2358.56.9452.550.001p-HAP0.0254892.7716.580.0010.05485.174.2617.640.001本研究采用体外皮脂腺细
14、胞进行油脂合成抑制实验。结果显示，p-HAP在0.05 mg/mL时SZ95细胞活力为101.09%，无明显细胞毒性（图1）。0.025 mg/mL和0.05 mg/mL的对羟基苯乙酮组的细胞油脂表达量与NC组相比显著性下降（P0.05），油脂合成抑制率分别为16.58%和17.64%，对羟基苯乙酮可显著抑制皮脂腺细胞油脂合成（表2、图2）。BCPCNCp-HAP120.0060.0020.000.000.000 00.015 9/(mg/mL)细胞活力/%0.050 20.158 70.501 40.584 65.007 215.822 850.000 080.0040.00100.00图1
15、 对羟基苯乙酮细胞毒性测试Fig.1 Resultsofcellviabilityassayofp-HAPinSZ95humansebocytes图2 对羟基苯乙酮抑制细胞油脂合成（荧光染色）Fig.2 Effectsofp-HAPonlipidaccumulationinSZ95humansebocytes3结论对羟基苯乙酮可显著抑制LPS诱导的巨噬细胞的NO、TNF-和IL-6水平（p0.01），显著抑制皮脂腺细胞油脂的合成。研究表明，对羟基苯乙酮可降低细胞的炎症反应，抑制油脂的分泌，提示其可能具有舒缓和控油的功效。综合对羟基苯乙酮的几种作用，还可能具有一定的治疗痤疮的效果，可作为祛痘功效
16、原料应用在化妆品中。参考文献：1 李小妹,梁咏,康志英,等.清肝利胆口服液中对羟基苯乙酮含量的测定J.中国实验方剂学杂志,2013,19(17):160-162.2 谢剑华,李光华,鲁晟.扑热息痛的又一合成路线J.中国医药工业杂志,1999(7):8,15.3 张瑱,贺兴冬,季申,等.对羟基苯乙酮降血脂作用的研究J.Technique express科技广场17第46卷2023年第10期Study on the soothing and oil control efficacy of p-HydroxyacetenoneophenoneGUO Shen-tao 1,XU Wen-feng1,N
17、IU Qiang1,ZHANG Yu-ling1,LONG Yan2,PENG Chun-mei 2(1.Guangdong Youzhi Testing Technology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong 510450,China;2.Guangdong Bawei Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong 510450,China)Abstract:p-Hydroxyacetophenone(p-HAP)has been used as a preservative in cosmetics,however,its n
18、ew efficacy has rarely been reported.Herein,the soothing and oil control efficacy of p-HAP was evaluated by cellular in vitro method to provide new efficacy basis for application in cosmetics.The content of nitric oxide(NO),tumor necrosis factor (TNF-)and interleukin-6(IL-6)was determined in LPS-ind
19、uced RAW264.7.The lipid content was determined in testosterone-induced SZ95.The results revealed that p-HAP could significantly inhibit these pro-inflammatory cytokines,including NO,TNF-and IL-6(P 0.01).In addition,0.05 mg/mL p-HAP could inhibit the formation of lipid droplets in human sebocytes,wit
20、h inhibition rate of 17.64%(P 0.001).These findings might imply the potential application of p-HAP as a functional ingredient in cosmetics,which might have soothing and oil control efficacy according to the inhibition of pro-inflammatory cytokines and lipid content.Key words:p-Hydroxyacetophenone;so
21、othing efficacy;oil control;efficacy（本文编辑 张 静）世界临床药物,2010,31(10):599-602.4 邓轶方,于鹏霞,黄晓玲,等.对羟基苯乙酮对正常大鼠胆汁分泌及高脂血症的影响J.药学实践杂志,2016,34(6):507-510,525.5 鲍继明,戴淑昌.对羟基苯乙酮的合成J.合成化学,2002(3):281-282.6 王海涛.化妆品用抗敏抗刺激活性物质的筛选、提取及作机理研究D.北京:北京工商大学,2010.7 CORSINI E,GALLI CL.Epidermal cytokines in experimental contact d
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