1、195Yin FengjeRu20232023年JOURNALOFCHINESEHIGHTITUDEMEDICINEANDBIOLOGYNo.Vol.44第3 期第44卷杂志国高原医生物多房棘球坳囊液对沉默DDIT4后小鼠肝细胞生物学功能的影响尹凤娇2，徐凯2，陈佳昕2，仁增卓嘎2，七茹-2冶廣搏12，庞明泉12，樊海宁12，曹得萍3，王海久1.2*，王志鑫12（1.青海大学附属医院肝胆胰外科，西宁8 10 0 0 1;2.青海省包虫病研究重点实验室，西宁8 10 0 0 1；3.桂林医学院基础医学院基础医学教研室，桂林54119 9）摘要目的探讨多房棘球坳囊液（Hydatid cyst fl
2、uid,HCF)对沉默DNA损伤诱导转录因子4(DNAdamage-inducible transcript4,DDIT4)后小鼠肝细胞生物学功能的影响。方法1.采用免疫蛋白印迹法（WestermBlot）、实时荧光定量法(RT-qPCR）检测经HCF处理的小鼠肝细胞中DDIT4蛋白的表达量，以检测转染效率;2.选用慢病毒转染小鼠正常肝细胞DDIT4后做HCF处理，采用细胞计数试剂8 法(CCK-8)检测各组小鼠肝细胞的细胞活性;3.用WesternBlot法检测Beclin-1、Ca s p a s e-3、LC3等凋亡自噬相关蛋白水平;4.用透射电镜观察HCF对小鼠肝细胞超微结构的影响。结
3、果1.经HCF作用后慢病毒转染小鼠肝细胞的DDIT4基因及蛋白表达水平检测结果显示,LV-Ddit4-RNAi1、LV-Ddit4-RNAi2、LV-D d i t 4-RNA i 3组分别与LV-Ddit4-NC组比较，前三组DDIT4蛋白含量显著下降,LV-Ddit4-RNAi3组尤为显著（P0.01）。2.LV-D d i t 4-RNA i 0.4、0.8 m g/m L组细胞OD值明显大于LV-Ddit4-NC0.4、0.8 m g/m L组(P0.01);与HCF共培养48 h后,沉默DDIT4组细胞形态接近正常AML-12细胞的形态，多呈椭圆形或者圆形,且细胞生长密度较LV-Dd
4、it4-NC组明显为高。3.与LV-Ddit4-NC con组比较,LV-Ddit4-NC 0.4mg/mL HCF组和LV-Ddit4-NC 0.8mg/mL HCF组的LC3-II、Be c l i n-1、Ca s p a s e-3蛋白表达水平显著增高（P0.01)；分别与LV-Ddit4-NC0.4、0.8 mg/mLHCF组比较,LV-Ddit4-RNAi0.4、0.8 m g/m LH CF组的LC3-II、Be c l i n-1、Ca s p a s e-3蛋白表达水平显著降低，均具有统计学意义。4.两对照组细胞胞质未见明显损伤，线粒体基质较均匀，粗面内质网未见明显扩张，自噬
5、水平低;LV-Ddit4-RNAi0.4、0.8 m g/m L组细胞损伤较轻，未见粗面内质网扩张，胞质内存在较多脂滴，自噬数量增多;LV-Ddit4-NC0.4、0.8 m g/m L组细胞损伤严重，粗面内质网严重扩张,胞质内存在大量脂滴，可见大量自噬结构。结论HCF对沉默DDIT4后小鼠肝细胞生物学功能的影响：1.AML-12细胞增殖;2.AML-12细胞凋亡、自噬数量减少。关键词多房棘球坳；囊液；沉默DNA损伤诱导转录因子4；细胞；凋亡；自噬中图分类号R383.3文献标志码AD0I10.13452/ki.jqmc.2023.03.007Effects of Echinococcus mu
6、ltilocularis cyst fluid on thebiological function of mouse hepatocytes after silencing DDIT4*iaol-,Xu Kail-2,Chen Jiaxin-2,Renzeng zhuoga2,Ni收稿日期：2 0 2 2-12-6：青海省科技厅重点实验室项目（2 0 2 0-ZJ-Y01）：第二批青海省“高端创新人才千人计划（培养拔尖人才）项目；中科院“西部之光（青年学者）项目。*通信作者，主任医师，教授，硕士生导师，尹凤娇（19 9 6-），女，汉族，青海籍，在读硕士研究生196Ye Gengbo-2,Pa
7、ng Mingquan-2,Fan Haining*,Cao Deping,Wang Hajiu-2*,Wang Zhixin-(1.Department of Hepatopancreatobiliary Surgery,Qinghai University Affiliated Hospital,Xining 810001,China;2.Qinghai Provincial Key Laboratory of Hydatid Disease Research,Xining 810001,China;3.Department of Basic Medicine,School of Basi
8、c Medicine,Guilin Medical University,Guilin 541199,China)Abstract Objective To investigate the effects of hydatid cyst fluid(HCF)on the biological function of mousehepatocytes after silencing DNA damage-inducible transcript 4(DDIT 4).Methods 1.Western Blot and RT-qPCRwere performed to detect the DDI
9、T4 protein expression in mouse hepatocytes which were treated with HCF to detectthe transfection efficiency.2.Normal mouse hepatocytes DDIT4 suitable for lentivirus transfection were selected forHCF treatment.Cell counting reagent 8(CCK-8)was used to detect the cell activity of mouse hepatocytes in
10、eachgroup.3.The levels of Beclin-1,Caspase-3,LC3 and other autophagy-related proteins were detected by WesternBlot.4.The effects of HCF on the ultrastructure of mouse hepatocytes was observed by transmission electron micros-copy.Results 1.The detection results of DDIT4 gene and protein expression le
11、vel of lentivirus transfected mousehepatocytes after HCF treatment showed that compared with LV-Ddit4-NC group,DDIT4 protein content of LV-Ddit4-RNAi 1,LV-Ddit4-RNAi 2,LV-Ddit4-RNAi 3 decreased significantly,especially in LV-Ddit4-RNAi 3group(P0.01).2.The cell OD value of LV-DDit4-Rnai 0.4 and 0.8 m
12、g/mL groups was significantly higher thanthat of LV-Ddit4-NC 0.4 and 0.8 mg/ml groups(P0.01).After co-culture with HCF for 48 hours,the morphol-ogy of cells in the silencing DDIT4 group was close to that of normal AML-12 cells,mostly oval or round.The cellgrowth density was significantly higher than
13、 that in the LV-Ddit4-NC group.3.Compared with LV-Ddit4-NC congroup,LC3-II,Beclin-1 and Caspase-3 protein expression levels in LV-Ddit4-NC 0.4 mg/mL HCF group andLV-Ddit4-NC 0.8 mg/mL HCF group were significantly increased(P0.01);Compared with LV-Ddit4-NC 0.4and 0.8mg/mL HCF groups,LC3-II,Beclin-1 a
14、nd Caspase-3 protein expression levels in LV-Ddit4-RNAi 0.4and O.8 mg/mL HCF groups were significantly decreased with statistical significance.4.There was no obvious dam-age to the cytoplasm of the cells in the two control groups.The mitochondrial matrix was relatively uniform.Therough endoplasmic r
15、eticulum was not significantly expanded and the autophagy level was low.In the LV-Ddit4-RNAi 0.4 and 0.8 mg/mL groups,the cell damage was light.No rough endoplasmic reticulum expansion was ob-served.There were more lipid droplets in the cytoplasm,and the number of autophagy was increased.In LV-Ddit4
16、-NC 0.4 and 0.8 mg/mL groups,the cells were severely damaged and the rough endoplasmic reticulum was severelyexpanded.There were a large number of lipid droplets in the cytoplasm,and a large number of autophagy structurescould be seen.Conclusion The effects of HCF on the biological function of mouse
17、 hepatocytes after silencing DDIT4are as follows:1.The number of AML-12 cells increased;2.The number of apoptosis and autophagy of AML-12cells decreased.KeywordsEchinococcus multilocularis;cyst fluid;silencing DNA damage-inducible transcription factor 4(DDIT 4);cell;apoptosis;autophagyDNA损伤诱导转录因子4(D
18、NAdamage-induc-ibletranscript4,DDIT4）是一种与代谢、免疫等相关的蛋白，在损伤等应激条件下高表达。在前列腺癌、卵巢癌等众多恶性肿瘤的表达中有显著性差异，且在抗肿瘤治疗中起着“保护伞作用-3。肝多房棘球坳病病灶边界不清楚，囊液持续外渗，刺激周围肝细胞，导致正常肝细胞损伤。徐凯4 等研究发现，正常小鼠肝细胞经多房棘球坳囊液（HCF）干预后，细胞活性明显受到抑制，且DDIT4在调亡、自噬相关蛋白中高表达。本研究观测HCF对沉默DDIT4后小鼠肝细胞生物学功能的影响1材料与方法1.1材料1.1.1实验细胞系正常小鼠肝细胞株（AML-12）购自中国科学院上海生命科学研究
19、所，保存于青海大学附属医院中1970.4、0.8 m g/m L的HCF,分别与细胞培养48 h。10个/孔），2 4h后更换培养基并加人浓度为0.0、心实验室。1.1.2小鼠BALB/c小鼠购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物合格证号：No.201930977。1.1.3主要试剂和仪器RIPA裂解液、0.2 5%胰蛋白酶消化液（不含EDTA）、嘌呤霉素（puromycin）均购自北京索莱宝科技有限公司，DMEM/F12培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，CCK-8试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司,DDIT4一抗、Beclin-1一抗购自美国A
20、bcam公司，Caspase-3一抗、LC3A/B一抗购自美国Cell SignalingTechnology公司，-actin抗体、HRP山羊抗兔二抗购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，RNASimple总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自天根生化科技有限公司，DDIT4引物、18S引物购自华大基因公司，LV-Ddit4-RNAi、阴性对照病毒购自吉凯基因公司。生物倒置显微镜系统购自日本OLYMPUS公司，荧光化学发光成像系统购自美国CE公司，酶标仪购自德国Tecan公司,电泳仪购自BIORAD公司,PCR基因扩增仪购自美国ABI公司，普通高速离心机购自Sigma公司，Cytation5细胞成
21、像微孔板检测系统购自美国BioTek公司，实时荧光PCR仪购自Roche公司，透射电子显微镜购自HITACHI公司。1.2方法1.2.1囊液收集及处理将造模小鼠采用颈椎脱白法处死，以无菌方式打开腹腔并小心分离多房棘球坳囊泡（用PBS反复多次清洗），并将囊泡放至2 0 mL无菌注射器内，以挤压方式分离囊液并离心（32 0 0 r/min，7 m i n），用滤器（0.2 2 m)过滤离心囊液后分装,并存于-8 0 冰箱备用。1.2.2慢病毒LV-Ddit4-RNAi转染小鼠肝细胞按规定密度（410 4个/mL）接种于六孔板中。2 4h后当细胞覆盖率为2 0%30%时进行慢病毒转染。根据慢病毒使用
22、操作手册要求，每组细胞分别加人LV-Ddit4-RNAi 1、LV-D d i t 4-RNA i2、LV-D d i t 4-RNA i 3和LV-Ddit4-NC病毒,以及相应的转染增强液置培养箱（37,5%CO,）培养。用嘌呤霉素筛选稳定细胞株,并进行RT-qPCR及WesternBlot鉴定，检测各组DDIT4基因mRNA和蛋白表达量，并确定合适的慢病毒进行转染1.2.3小鼠肝细胞DDIT4蛋白的表达量检测分别收集经HCF作用后的LV-Ddit4-RNAi1、LV-Ddit4-RNAi 2、LV-D d it4-RNA i 3和LV-Ddit4-NC细胞,细胞用含有PMSF蛋白酶抑制剂
23、的Ripa缓冲液做冰上裂解（30 min）、离心（4，12 0 0 0 r/min，10min）后取上清液后用5蛋白上样缓冲液稀释并水浴（9 5，10 min），通过BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白样品浓度。取30 g总蛋白进行SDS-PACE电泳。结束后转移至0.2 mPVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭（室温，1h）。将膜与DDIT4（1:10 0 0）、-actin(1:1500）一抗一同孵育（4,过夜）。第二天对稀释（1:50 0 0)的用HRP标记的二抗进行孵育（室温，1h）。使用增强型ECL化学发光系统进行印记检测（以-actin为内参）。使用ImageJ软件对蛋白条带进行灰度分析。1.2
24、.4小鼠肝细胞DDIT4的表达量检测直接提取细胞总RNA，将适量的RNA逆转录成cDNA,采用RT-qPCR法检测4组DDIT4的mR-NA表达量，筛选慢病毒。将4个样品用DDIT4基因和内参基因引物扩增，见表1。每个反应重复3次。采用2 0 L体系建立扩增体系。采用两步法PCR反应程序进行实验。PCR结果分析由ABIQ5PCR仪完成。1.2.2慢病毒LV-Ddit4-RNAi转染表1DDIT4、18 S 引物序列Table1Primer sequences of DDIT4,18S基因Forward primerReverse primerDDIT4CAAGGCAAGAGCTGCCATAGC
25、CGGTACTTAGCGTCAGGG18SGCCAGGTTCTGGCCAACGGTGCGGACACGAAGGCCCCAAA1.2.5HCF对沉默DDIT4后小鼠肝细胞形态学影响收集转染后的小鼠肝细胞接种于6 孔板（31.2.6HCF对沉默后小鼠肝细胞活性的影响198收集转染后的小鼠肝细胞接种于9 6 孔板（1104个/孔），2 4h后更换培养基并加入浓度为0.0、0.4、0.8 m g/m L的HCF，处理48 h后，每孔加人CCK-8试剂孵育1.2.7调亡自噬相关蛋白水平检测同1.2.3所示方法。1.2.8细胞内超微结构观察收集转染后的小鼠肝细胞，在培养皿（35mm）接种细胞（110 个/皿
26、），2 4h后更换培养基，并加人不同浓度的HCF培养48 h。从EP管中收获培养48h的细胞，用PBS洗涤2 次；用2.5%戊二醛固定（过夜）后以1%钱酸固定（避光，室温）2 h，再用不同浓度梯度（30%、50%、7 0%、8 0%、9 5%、10 0%）乙醇进行脱水，然后浸透、包埋、聚合、切片、拍照，在电镜下观察细胞内超微结构1.2.9统计学处理采用GraphPadPrism9.0统计软件作统计分析,结果以均数标准差（xs）表示，多组间比较采用AnalysisofVariance（A NO VA）法分析，两两比较用 Least-Significant Difference(LSD)法检验。P
27、0.05为差异有统计学意义2结果2.1慢病毒转染效率2.1.1细胞慢病毒转染情况使用ImageJ软件检测荧光细胞所占全视野细胞的百分比达8 0%以上，可用于后续实验。如图1。ABLV-Ddit4-NCLV-Ddit4-RNAi 1LV-Ddit4-RNAi2LV-Ddit4-RNAi3A为明场镜下图（10 0）;B为同一视野荧光图（10 0），绿色荧光表明慢病毒已成功转染细胞图1细胞慢病毒转染图Figure1Cell lentivirus transfection2.1.2经HCF作用后的慢病毒转染小鼠肝细胞的DDIT44蛋白表达量经HCF作用后慢病毒转染小鼠肝细胞的DDIT4蛋白表达水平检测
28、结果显示,LV-Ddit4-RNAi1、LV-Ddit4-RNAi 2、LV-D d it 4-RNA i3组分别与LV-Ddit4-NC组比较，前三组DDIT4蛋白含量显著下降,LV-Ddit4-RNAi3组尤为显著（P0.01），见图2、表2。因此最终选用LV-Ddit4-RNAi3组细胞做后续实验DDIT425KDa-actin42KDaLV-Ddit4-NCLV-Ddit4-RNAi1LV-Ddit4-RNAi2LV-Ddit4-RNAi3图2小鼠肝细胞DDIT4蛋白表达图Figure2DDIT4 protein expression in mice hepatocytes199表2小
29、鼠肝细胞DDIT4蛋白表达结果(xs)Table 2DDIT 4 protein expression in mouse hepatocytes(x+s)GroupsDDIT4LV-Ddit4-NC31.200.09LV-Ddit4-RNAi 130.27 0.09aLV-Ddit4-RNAi 230.220.02aLV-Ddit4-RNAi 330.170.07aF162.136P0.001a:Compared to the LV-Ddit4-NC group,P0.012.1.3经HCF作用后慢病毒转染小鼠肝细胞的DDIT4基因表达量经HCF作用后慢病毒转染小鼠肝细胞的DDIT4基因表达水
30、平检测结果显示,LV-Ddit4-RNAi1、LV-Ddit4-RNAi2、LV-D d it 4-RNA i3组分别与LV-Ddit4-NC组比较,前三组DDIT4基因表达水平均显著下降,LV-Ddit4-RNAi3组尤为显著（P0.01）,见表3。表3小鼠肝细胞DDIT4的表达结果(xs）Table3DDIT4 expression in mice hepatocytes(x+s)GroupsnDDIT4LV-Ddit4-NC121.000.11LV-Ddit4-RNAi1120.520.13aLV-Ddit4-RNAi 2120.400.02aLV-Ddit4-RNAi3120.210.
31、03aF一47.013P0.001a:Compared to the LV-Ddit4-NC group,P0.012.2HCF对沉默后AML-12细胞形态的影响与HCF共培养48 h后,con组LV-Ddit4-NC和LV-Ddit4-RNAi组细胞形态多呈椭圆形或者圆形，细胞生长密度正常,贴壁良好,连接成岛状；而LV-Ddit4-RNAi组分别经过0.4、0.8 mg/mLHCF处理后细胞数及状态明显好于LV-Ddit4-NC0.4、0.8 m g/m L组，多数细胞形态较正常，且贴壁状态良好，可见少部分细胞漂浮于培养基中，见图3。LV-Ddit4-NCLV-Ddit4-RNAiCon0.
32、4 mg/mL HCF0.8 mg/mL HCF图348h后各组细胞形态镜下图（10 0）Figure3Cell morphology of each group after 48 hours(100)2002.3AML-12细胞活力与LV-Ddit4-NC0.4、0.8 m g/m L组细胞比较,LV-Ddit4-RNAi0.4、0.8 m g/m L组细胞OD值明显上升，增殖率也随之增加（P0.01）；与HCF共培养48h后，沉默DDIT4组细胞形态接近正常AML-12细胞形态，多呈椭圆形或者圆形，且细胞生长密度较LV-Ddit4-NC组明显为高。见表4。表4HCF对各组AML-12细胞活
33、力的影响（xs)Table 4Effects of HCF on the viability of AML-12 cells in each group(xs)LV-Ddit4-NCLV-Ddit4-RNAiGroups(n=12)(n=12)Con1.2380.0811.1970.0860.4 mg/mL0.943 0.059a1.0170.060bc0.8 mg/mL0.807 0.036a1.0160.060 bdF142.94027.234P0.0010.001a:Compared with LV-Ddit4-NC con group,P0.01;b:Compared with LV-
34、Ddit4-RNAi con group,P0.01;c:Compared with LV-Ddit4-NC 0.4 mg/mLgroup,P0.01;d:Compared with LV-Ddit4-NC 0.8 mg/mL group,P0.012.4调亡自噬相关蛋白水平与 LV-Ddit4-NC con 组比较,LV-Ddit4-NC O0.4、0.8mg/mL HCF 组 Beclin-1、LC3-II、Ca s p a s e-3蛋白表达显著升高（P0.01）；与LV-Ddit4-RNAicon组比较,LV-Ddit4-RNAiO.4mg/mLHCF组的Bec-lin-1表达具有统计
35、学意义（P0.05）,LV-D d it 4-RNAi0.8mg/mLHCF组的Beclin-1表达具有统计学意义（P0.01）；与LV-Ddit4-RNAicon组相比，LV-Ddit4-NCLV-Ddit4-RNAi 0.8 mg/mL HCF 组的 Caspase-3表达具有统计学意义（P0.05）；与LV-Ddit4-NC0.4、0.8 m g/m L H C F组比较,LV-Ddit4-RNAi0.4、0.8 m g/m LH CF组的LC3-II表达具有统计学意义（P0.05）,Be c l i n-1、Ca s p a s e-3蛋白表达具有统计学意义（P0.05）。见图4、表5
36、。LV-Ddit4-RNAiLC3-116KDaLC3-II14KDaBeclin-152KDa35KDaCaspase-3-actin42KDaLV-Ddit4-NCconLV-Ddit4-RNAiconLV-Ddit4-NC0.4mg/mLLV-Ddit4-NC0.8mg/mLLV-Ddit4-RNAi0.4mg/mLLV-Ddit4-RNAi0.8mg/mL图4Caspase-3、Be c l i n-1、LC3蛋白水平表达图Figure 4Protein expression of Caspase 3,Beclin-land LC3201表5凋亡自噬相关蛋白水平（x土s）Table 5
37、Levels of Apoptosis AutophagyRelated Protein(xs)GroupsnLC3BeclinlCaspaseLV-Ddit4-NC con30.030.010.110.050.230.03LV-Ddit4-NC 0.4mg/mL30.120.03a0.860.13a0.900.04aLV-Ddit4-NC 0.8mg/mL30.140.04a1.03 1.15a0.97 0.07aLV-Ddit4-RNAi con30.040.010.100.050.23 0.02LV-Ddit4-RNAi 0.4mg/mL30.060.01b0.43 0.13 bd0.3
38、20.03cLV-Ddit4-RNAi 0.8mg/mL30.080.01c0.550.14ce0.37 0.02 bdF12.26931.958206.503P0.0010.0010.001(LC3)a:Compared to the LV-Ddit4-NC con group,P0.01;b:Compared to the LV-Ddit4-NC 0.4 mg/mL group,P0.05;c:Compared to the LV-Ddit4-NC0.8 mg/mL group,P0.05;(Beclin1)a:Compared to the LV-Ddit4-NC con group,P
39、0.01;b:Compared to the LV-Ddit4-RNAi con group,P0.05;c:Comparedto the LV-Ddit4-RNAi con group,P0.01;d:Compared to the LV-Ddit4-NC 0.4 mg/mL group,P0.01;e:Compared to the LV-Ddit4-NC 0.8 mg/mL group,P0.01;(Caspase)a:Compared to the LV-Ddit4-NC con group,P0.01;b:Compared to the LV-Ddit4-RNAi con group
40、,P0.05;c:Compared to the LV-Ddit4-NC 0.4 mg/mL group,P0.01;d:Compared to the LV-Ddit4-NC 0.8 mg/mL group,P0.012.5细胞内超微结构LV-Ddit-4-NC和LV-Ddit4-RNAi组的透射电镜图显示，胞质未见明显损伤，线粒体基质较均匀，粗面内质网未见明显扩张，自噬水平低，见图5a-d;LV-Ddit4-RNAi0.4、0.8 m g/m L组细胞损伤较轻,胞质内存在较多脂滴，自噬数量增多，见图5e-h;LV-Ddit4-NC0.4、0.8 m g/m L组细胞损伤最严重，粗面内质网严
41、重扩张，胞质内存在大量脂滴，可见大量自噬结构，见图5i-1。abCdLV-Ddit4-NCLV-Ddit4-RNAihe一LV-Ddit4-RNAi 0.4 mg/mLLV-Ddit4-RNAi0.8mg/mLkLV-Ddit4-NC 0.4mg/mLLV-Ddit4-NC 0.8mg/mL1000500010005000图5各组AML-12细胞超微结构图Figure5Ultrastructure of AML-12 cells in each group202（责任编辑：陈芃）3讨论DDIT4是位于染色体10（10 q22.1）上，由2 32个氨基酸组成的一种蛋白质。有研究表明,DDIT4能
42、发挥广泛的细胞及生物学功能 5-6 。DNA损伤转录诱导在多种细胞中出现，正常情况下DDIT4均呈低表达，且半衰期短，很难被检测出来 7 在寄生虫感染中，由于虫体寄生诱发了宿主细胞的内质网应激反应并启动未折叠蛋白反应。多种应激条件下，自噬水平会显著上升 8 Hou等 9 研究发现，沉默DDIT4后可减轻LPS诱导人脐静脉内皮细胞凋亡现象。Su等 10 研究得出，降低DDIT4表达水平可减轻蛛网膜下腔出血患者脑脊液中代谢产物所引起的原代皮层神经元凋亡。DDIT4也可密切参与对细胞自噬的调控作用 1-12 本课题组前期研究发现 4,HCF对正常小鼠肝细胞有损伤作用。国内外众多研究发现，DDIT4可
43、能与细胞亡、细胞自噬密切相关，故本研究筛选LV-Ddit4-RNAi3做相关实验。二本研究观测HCF对沉默DDIT4后小鼠肝细胞生物学功能的影响发现：1.AML-12细胞增殖；2.AML-12细胞调亡、自噬数量减少参考文献1Yao C,Cheng X,Guo X,et al.NNT-AS1 modulatesprostate cancer cell proliferation,apoptosis and migration throughmiR-496/DDIT4 axis J.Cancer Cell Int,2020(20):463.2 Chang B,Meng J,Zhu H,et al.
44、Overexpression of therecently identified oncogene REDD1 correlates with tumor pro-gression and is an independent unfavorable prognostic factor forovarian carcinoma J.Diagn Pathol,2018,13(1):87.3Jia W,Chang B,Sun L,et al.REDD1 and p-AKT over-expression may predict poor prognosis in ovarian cancer J.I
45、ntJ Clin Exp Pathol,2014,7(9):5940-5949.4徐凯,尹凤娇,张耀刚，等.HCF对小鼠肝细胞凋亡与自噬影响的研究 J.解放军医学院学报，2 0 2 2,43（1）：8 1-8 6+9 4.5 Reiling JH,Hafen E.The hypoxia-induced paralogsScylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K ac-tivity upstream of TSC in Drosophila J.Genes Dev,2004,18(23):2879-2892.6Lipina
46、 C,Hundal HS.Is REDD1 a Metabolic EminenceGrise?J.Trends Endocrinol Metab,2016,27(12):868-880.7 Tirado-Hurtado I,Fajardo W,Pinto JA.DNA DamageInducible Transcript 4 Gene:The Switch of the Metabolism asPotential Target in Cancer J.Front Oncol,2018(8):106.8Li CF,Sun JX,Gao Y,et al.Clinorotation-induce
47、d au-tophagy via HDM2-p53-mTOR pathway enhances cell migrationin vascular endothelial cells J.Chinese Journal of Parasitologyand Parasitic Diseases,2018,9(2):147.9Hou XH,Yang SB,Yin J,et al.Blocking the REDD1/TXNIP axis ameliorates LPS-induced vascular endothelial cellinjury through repressing oxida
48、tive stress and apoptosis J.AmJ Physiol Cell Physiol,2019,316(1):C104-C110.10 Su J,Wang M,Yan Y,et al.Increased REDD1 facili-tates neuronal damage after subarachnoid hemorrhage J.Neu-rochem Int,2019(128):14-20.11 张怡，高维娟.DDIT4对脑缺血再灌注损伤中自噬的调控作用 J.中国病理生理杂志,2 0 18,34（5）：9 56-9 6 0.12 Du F,Sun L,Chu Y,et al.DDIT4 promotes gastriccancer proliferation and tumorigenesis through the p53 and MAPKpathwaysJ.Cancer Commun(Lond),2018,38(1):45.
