1、论著多囊卵巢综合征模型大鼠卵巢中结缔组织生长因子及基质金属蛋白酶-9的表达*张璐 刘明盛 杨旭 李兰(成都市第五人民医院成都中医药大学附属第五人民医院妇产科,四川 成都 6 1 1 1 3 0)【摘要】目的 探讨卵巢中结缔组织生长因子(C T G F)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达与多囊卵巢综合征的关系。方法 5 2只S P F级S D雌性大鼠(6周龄,具备规律动情周期)依照不同造模方式分为对照组和模型组,每组2 6只。对照组行羧甲基纤维素灌胃建模,模型组行等量来曲唑建模。分析研究对象动情周期不在出现固定规律,且具有连续性特征时,两组均采集其血清以及卵巢组织,采用放射免疫法(R I
2、A)测定促黄体生成激素(LH)、促卵泡激素(F S H)、雌二醇(E2)、垂体泌乳素(P R L)、睾丸素等指标对大鼠内分泌改变情况进行评定分析;并应用免疫组织化学的方法使用C T G F一抗、二抗、三抗和MMP-9一抗、二抗、三抗来测定和分析两种因子在该疾病组织中的表达情况。结果 模型组P R L、LH、睾丸素、窦前卵泡卵泡膜胞浆中C T G F、黄体中MMP-9等表达高于对照组(P0.0 5),F S H、E2、卵泡基底膜内MMP-9表达水平均发生显著下降趋势(P0.0 5)。结论 卵巢中结缔组织生长因子水平变化与该疾病中小卵泡过多表达或者排卵障碍之间存在一定关联性,MMP-9则与多囊卵巢
3、综合征的排卵障碍之间存在关联性。【关键词】多囊卵巢综合征;结缔组织生长因子;基质金属蛋白酶-9;促黄体生成激素;大鼠【中图分类号】R 7 1 1.7 5 【文献标志码】A D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 2-3 5 1 1.2 0 2 3.1 1.0 0 6 基金项目:四川省科技厅重点项目(2 2 M Z G C 0 2 5 9)通讯作者:李兰,E-m a i l:1 3 7 5 8 4 4 4 1 7q q.c o m引用本文:张璐,刘明盛,杨旭,等.多囊卵巢综合征模型大鼠卵巢中结缔组织生长因子及基质金属蛋白酶-9的表达J.西部医学,2 0 2 3,3 5
4、(1 1):1 5 8 9-1 5 9 3.D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 2-3 5 1 1.2 0 2 3.1 1.0 0 6E x p r e s s i o n o f c o n n e c t i v e t i s s u e g r o w t h f a c t o r a n d m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e-9 i n o v a r y o f r a t s w i t h p o l y c y s t i c o v a r y s y n d r o m eZ H
5、A N G L u,L I U M i n g s h e n g,Y A N G X u,L I L a n(D e p a r t m e n t o f O b s t e t r i c s a n d G y n e c o l o g y,T h e F i f t h P e o p l e s H o s p i t a l A f f i l i a t e d t o C h e n g d u U n i v e r s i t y o f T r a d i t i o n a l C h i n e s e M e d i c i n e,C h e n g d u
6、6 1 1 1 3 0,C h i n a)【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T o s t u d y t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e e x p r e s s i o n o f c o n n e c t i v e t i s s u e g r o w t h f a c t o r(C T G F)a n d m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e-9(MMP-9)i n o v a r y a n d p o l y c y
7、 s t i c o v a r i a n s y n d r o m e.M e t h o d s 5 2 f e m a l e r a t s(6 w e e k s o f a g e,w i t h r e g u l a r e s t r o u s c y c l e s)w e r e d i v i d e d i n t o t w o g r o u p s(c o n t r o l g r o u p a n d m o d e l g r o u p)a c c o r d i n g t o d i f f e r e n t m o d e l i n g
8、 m e t h o d s.T h e c o n t r o l g r o u p w a s g i v e n c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e b y g a v a g e,a n d t h e m o d e l g r o u p w a s g i v e n t h e s a m e a m o u n t o f l e t r o z o l e.T h e s e r u m a n d o v a r i a n t i s s u e o f t h e t w o g r o u p s w e r e
9、 c o l l e c t e d w h e n t h e e s t r o u s c y c l e o f r a t s w a s n o t f i x e d a n d h a d t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f c o n t i n u i t y.R I A m e t h o d w a s u s e d t o d e t e r m i n e LH,F S H,E 2,P R L,a n d t e s t o s t e r o n e,r e s p e c t i v e l y.T h e e n
10、d o c r i n e c h a n g e s o f m o d e l m i c e w e r e e v a l u a t e d a n d a n a l y z e d b y P R L,t e s t o s t e r o n e a n d o t h e r i n d e x e s.T h e e x p r e s s i o n o f c o n n e c t i v e t i s s u e g r o w t h f a c t o r a n d MMP-9 i n o v a r i a n t i s s u e s w a s d
11、e t e r m i n e d a n d a n a-l y z e d b y i mm u n o h i s t o c h e m i c a l m e t h o d s u s i n g C T G F p r i m a r y a n t i b o d y,s e c o n d a r y a n t i b o d y,t h i r d a n t i b o d y a n d MMP-9 p r i m a r y a n t i b o d y,s e c o n d a r y a n t i b o d y a n d t h i r d a n t
12、 i b o d y.R e s u l t s T h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f P R L,LH,p r e s i n u s f o l l i c u-l a r c y t o p l a s m(C T G F,a l b u m e n C T G F,b a s a l m e m b r a n e c y t o p l a s m o f f o l l i c l e C T G F)a n d MMP-9 i n c o r p u s l u t e u m o f t h e m o d e l g r o u
13、p w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h o s e o f t h e c o n t r o l g r o u p(P0.0 5).H o w e v e r,t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f F S H,s e r u m e s t r a d i o l a n d MMP-9 i n t h e b a s a l m e m b r a n e o f f o l l i c l e s w e r e s i g n i f i c a n t l
14、y d e c r e a s e d(P 6 mM/L时),尿糖量也出现一定波动(4.7 mM/L),则表明本次实验所需的样本依照相关文献研究标准,满足实验要求5,即所需要的多囊卵巢综合征大鼠模型制作成功。1.5 标本采集 当模型组大鼠动情周期发生变化且连续出现间期时,开始标本采集,对照组在其间期采集标本。具体方法如下:2 1 d最后1次完成灌胃操作后需对所有实验大鼠进行禁食干预,时间为1 2 h,随后以缺血法处死实验个体,完成操作后立即采集其5 m L的心脏血液,并2 0 0 0 r/m i n离心操作后取上层血清,在零下4 0 保存备用。随后摘取各组实验个体的子宫及卵巢,完成称重操作,做
15、好个体记录后,对卵巢进行剖开操作,操作时需注意沿长径方向,随后以1 0%福尔马林固定备用。1.6 观察指标及测量方法1.6.1 放射免疫法(R I A)测定LH、F S H、E2、P R L0951西部医学 2 0 2 3年1 1月 第3 5卷第1 1期 M e d J W e s t C h i n a,N o v e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.1 1和睾丸素等指标对模型大鼠内分泌改变情况,并对其进行评价。切片制备和组织学观察:修剪卵巢组织并行石蜡包埋处理,以4 m厚度进行切片并进行HE染色,具体方法如下:脱蜡:切片放置入烘箱中完成烘干操作,温度调节为6 0
16、,时间设定为0.5 h,完成烘干后将样本拿出快速放置在二甲苯溶液中,浸泡1 5 m i n后将切片放置在新鲜的二甲苯溶液中完成浸泡处理,时间设定为1 5 m i n,脱蜡操作完成。水化:切片放入无水乙醇后取出放置进入无水乙醇,并以此按照9 5%、9 0%、8 0%、7 0%的顺序放置进乙醇溶液中,时间为5 m i n,浸泡完成后需放入自来水中完成冲洗,冲洗时间设定为3 m i n。苏木素染色:苏木素染料浸泡染色,1 5 m i n,自来水冲洗3 m i n。伊红染色:伊红染料浸泡染色,2 m i n,自来水冲洗3 m i n。脱水:依次放在8 0%乙醇中,3 0 s,9 5%()、9 5%()
17、、1 0 0%()、1 0 0%()乙醇各1 m i n。透明:切片放入二甲苯、中各5 m i n。封片:脱水后的切片需放置在平整的桌面上,待二甲苯挥发干后,在切片上滴加适量中性树胶进行封片。拍摄:待中性树胶完全干燥后,借助倒置显微镜完成切片的观察以及拍摄操作。1.6.2 免疫组织化学法 测定卵巢组织中MMP-9和C T G F的表达,明确为阳性的切片划分为阳性对照组,而P B S代替一抗为阴性对照对上述含量表达进行评定,观察到胞浆组织内有棕黄色或者棕褐色的颗粒状物质时判定为阳性,选择合适角度进行拍照处理后,经过B i o s e n s D i g i t a l I m a g i n g
18、 S y s t e m分析对其影像学的灰度值进行确定,具体方法如下:脱蜡:与1.6.1中HE染色中的方法相同。水化:与1.6.1中HE染色中的方法相同。内源性酶灭活:切片滴加3%H2O2,室温条件下,避光孵育1 0 m i n,去离子水清洗5 m i n,重复3次。抗原修复:切片放在柠檬酸盐冲洗液中浸泡,微波炉加热至沸腾,9 5 保温1 0 m i n,溶液冷却至室温用P B S清洗5 m i n,重复3次。封闭:取1 x羊血清封闭液滴加于肺组织切片上,随 后 将 切 片 置 于 湿 盒 中,在3 7 条 件 下 孵 育3 0 m i n。孵育一抗:弃去封闭液,向组织切片上滴加一抗2 0 0
19、 L,切片组织放置在湿盒中,并将湿盒置于温度为4 的环境下完成孵育过夜。复温清洗:取出切片组织放置在恒温箱中,将温度设定为3 7,完成孵育操作,时间约为3 0 m i n,使用P B S T清洗1 0 m i n,重复清洗3次。孵育二抗过程:向组织上滴入荧光二抗,随后将切片组织放置在湿盒中,调节好恒温环境,在3 7 条件下孵育3 h。清洗:吸弃荧光二抗,使 用P B S T清 洗1 0 m i n,重 复 清 洗3次。脱水、透明、封片方法HE染色相同。拍摄:使用显微镜进行切片观察。1.7 统计学分析 采用S P S S 1 7.0软件进行数据分析,计量资料以均数标准差(xs)表示,组间采用t检
20、验,以P0.0 5为差异有统计学意义。2 结果2.1 造模成功动物数量及过程 本实验共收集5 2只S D大鼠,根据不同灌胃给药方法分为对照组和实验组,并采用P o r e s k y法进行造模,两组每周6测定大鼠体重变化,持续3周,并评定造模效果。两组大鼠在制作过程中未发生死亡和感染,结果显示,5 2只大鼠造模成功。2.2 实验模型的改进 应用P o r e s k y法进行造模,在此基础上给予胃灌药的同时给予皮下注射,将剂量下调,确保了造模成功率和缩短了给药时间,且S D大鼠与人类发育机制相近,已被用于临床各种疾病的造模实验,且P o r e s k y法方法造模稳定性较高。2.3 两组大鼠
21、内分泌改变情况比较 模型组LH、P R L、睾丸素含量明显高于对照组(P0.0 5),F S H、E2明显低于对照组(P0.0 5),见表1。表1 两组大鼠血清性激素分泌情况比较(xs)T a b l e 1 S e r u m s e x h o r m o n e s e c r e t i o n i n b o t h g r o u p s o f r a t s 组别nL H(I U/L)F S H(I U/L)E2(P m o l/L)P R L(m I U/L)睾丸素(n m o l/L)模型组2 63.9 82.3 21.0 40.3 76 9.0 12 2.3 43 5.1
22、 12 1.1 65.3 20.2 3对照组2 61.6 21.1 22.8 00.1 98 7.1 11 7.2 42 2.4 01 1.3 22.5 31.1 1t5.0 0 33.2 3 44.1 3 56.2 5 05.1 4 6P0.0 50.0 50.0 50.0 50.0 5注:与对照组比较,P0.0 5。2.4 两组大鼠卵巢中C T G F的表达情况 统计切片结果显示,C T G F在卵巢中卵泡基底膜、白膜、颗粒细胞和窦前卵泡卵泡膜胞浆中均有表达。但在多囊卵巢综合征模型组卵巢组织中,窦前卵泡卵泡膜、卵泡基底膜中C T G F表达情况均有明显变化,故本文只对两者进行讨论;其中模型
23、组大鼠窦前卵泡卵泡膜胞浆1951西部医学 2 0 2 3年1 1月 第3 5卷第1 1期 M e d J W e s t C h i n a,N o v e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.1 1中的C T G F表达量较对照组明显偏高(t=4.2 6 0,P0.0 5);在卵泡基底膜胞浆以及白膜中,模型组大鼠的C T G F表达量较对照组均有明显升高(t=5.0 0 1,P0.0 5;t=5.2 6 1,P0.0 5),见图2。图2 两组大鼠卵巢组织中C T G F的表达情况F i g u r e 2 E x p r e s s i o n o f C T G F
24、 i n o v a r i a n t i s s u e s o f t h e t w o g r o u p s注:与对照组比较,P0.0 5。2.5 两组大鼠卵巢组织中MMP-9的表达情况比较 研究发现MMP-9在卵巢颗粒细胞,卵泡基底膜,始基卵泡、白膜、窦前卵泡卵泡膜胞浆等组织液内均有表达,而实验结果也显示,P C O S大鼠模型组中并不是所有的卵巢组织内的MMP-9都会出现表达异常,只有黄体与卵泡基底膜中MMP-9表达情况均有明显变化,故本文只对两者进行讨论;模型组MMP-9在黄体中的表达明显高于对照组(P0.0 5);卵泡基底膜内的MMP-9表达情况低于对照组(P0.0 5),
25、见表2。表2 大鼠卵巢组织中MMP-9的表达情况分析(xs,n g/m L)T a b l e 2 E x p r e s s i o n o f MMP-9 i n r a t o v a r i a n t i s s u e组别 n黄体卵泡基底膜模型组2 61 3 6.1 44.2 51 0 3.1 53.2 7对照组2 61 2 3.2 46.3 21 3 7.6 24.6 3t 4.0 0 74.1 0 6P 0.0 50.0 5注:与对照组比较,P0.0 5。3 讨论多囊卵巢综合征这一疾病在患者日常工作、生活中具有严重影响,不利于其正常生理活动,患者会伴随不排卵、闭经等一些列生理变
26、化,导致其无法正常受孕,不仅影响其身心健康,还会对其家庭和睦造成不良影响6-8。该病涉及广泛病理和生理学改变,如遗传、神经内分泌、物质代谢、卵巢局部调控等变化,因此该疾病的研究成为生殖内分泌研究人员重点关注项目9-1 0。大多数多囊卵巢综合征患者的排卵功能异常,也有极少数患者伴随稀少排卵,但是存在黄体功能异常等现象,因该疾病缺乏深度分析,针对疾病同卵泡发育以及排卵之间的关联性尚处于待研究或研究状态中1 1-1 2。本次实验的主要目的就是通过构建大鼠多囊卵巢综合征模型,深入研究样本血清性激素水平的变化情况。有文献报道1 3-1 4指出,C T G F及MMP-9在多囊卵巢综合征中表达异常,可能是
27、由不同分 子 机 制 引 起 的。本 研 究 还 深 度 分 析C T G F、MMP-9在卵巢组织中的变化以及对应表达现状,为该病发病机制的后续研究提供一定的参考,也可以为研究两者背后的分子机制提供一个可以参考的实验数据。目前动物模型因其操作简单、成功率高和重复性好等优点已被广泛应用于临床各项疾病实验中,而使用大鼠和兔动物实验较多1 5。本文选取5 2只S D雌性大鼠进行实验,因大鼠造模较为稳定,生长速度快及繁殖能力强等优点,广泛使用与生长发育的研究,且本文应用P o r e s k y法有效提高了造模成功率,因此并未发现其他因素对恩赐研究数据以及研究结果的准确性产生的明显影响1 6。研究发
28、现,当多囊卵巢综合症大鼠造模成功后发现血清性激素含量发生较为明显的变化,另外用药期间研究对象体内的性激素水平与未用药之前对比,也发生较为明显的变化,因此分析研究样本体内性激素与该疾病发生、发展存在明显相关性1 7-1 8。本研究显示模型组中P R L、LH和睾丸素等水平含量明显较对照组升高(P0.0 5),说明模型组中的睾丸素在由雄激素转向雌激素时被阻断,从而导致睾丸素蓄积,LH水平升高与睾丸素水平异常表达之间也可能存在一定联系,P R L的升高会造成卵巢局部P R L水平增加,从而导致雄性激素向雌性激素的转换变化。本研究还发现模型组中F S H和E2含量明显较对照组下降,发生这种情况的因素可
29、能与芳香化酶抑制剂造成雌激素合成速率降低有关1 9-2 0。研究表明,神经细胞、上皮细胞和血管内皮细胞中均可分泌C T G F,此因子在成纤维细胞增殖变化以及有丝分裂过程中发挥重要的促进作用。有研究发现C T G F参与了E CM形成和多种病理过程,而这一因子的研究中,正常卵巢组织中的表达并未明了2 1。本研究发现,C T G F这一因子在黄体组织、白膜组织以及颗粒细胞组织、窦前卵泡膜等胞浆中均有不同程度的表达,窦前卵泡卵泡膜、卵泡基底膜中C T G F表达情有明显变化,模型组各项表达含量高于对照组,说明C T G F的表达与该疾病发生、发展有联系。且实验发现F S H可抑制C T G F在卵
30、巢组织中的表达,而本实验F S H表达量明显下降,这可能是该疾病大鼠卵巢组 织 中C T G F高 表 达 的 主 要 原 因 之 一2 2-2 3。MMP-9属于胶原酶,此指标在破骨细胞中表达量较高。研究发现MMP-9与细胞转移和组织重建有明显相关性,且在雌性动物体内发现MMP-9随着生理周2951西部医学 2 0 2 3年1 1月 第3 5卷第1 1期 M e d J W e s t C h i n a,N o v e m b e r 2 0 2 3,V o l.3 5,N o.1 1期的波动而变化2 4-2 5。本研究发现,MMP-9在窦前卵泡卵泡膜胞浆、颗粒细胞、始基卵泡和白膜中均有表
31、达,但MMP-9在黄体和基底膜胞浆中的表达较其他细胞中的表达更加明显,与对照组比较具有统计学意义(P0.0 5)。4 结论卵巢中C T G F水平变化与该疾病中小卵泡过多表达或者排卵障碍之间存在一定关联性,MMP-9则与多囊卵巢综合征的排卵障碍之间存在关联性。【参考文献】1Z HOU F,S H I L B,Z HAN G S Y.O v a r i a n F i b r o s i s:A P h e-n o m e n o n o f C o n c e r nJ.C h i n M e d J(E n g l),2 0 1 7,1 3 0(3):3 6 5-3 7 1.2MO R AN
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