1、食品研究与开发23 年 9 月第 44 卷第 18 期基础研究基金项目：黑龙江省自然科学基金项目（LH2020C063）；黑龙江省财政厅、中央支持地方高校改革发展资金人才培养支持计划项目（304017）；国家级大学生创新创业训练计划项目（202110240019）作者简介：陈林林（1979），女（汉），教授，博士，研究方向：食品生物催化与转化。DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2023.18.016发酵紫苏粕制备抗氧化肽的工艺优化及抗氧化性陈林林1，王玲1，郑凤鸣1，张海鹏1，郝熙1，辛嘉英1，2（1.哈尔滨商业大学 食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150028；2.中
2、国科学院 兰州化学物理研究所 羰基合成与选择氧化国家重点实验室，甘肃 兰州 730000）摘要：以脱脂后的紫苏炼油副产物紫苏粕为原料，选取酵母菌为发酵菌种，通过单因素和响应面试验探究紫苏粕发酵工艺对饼粕中蛋白质含量的影响，得到的优化条件为发酵液 pH3.4、液料比 5.01（mL/g）、接菌量为 8.5%（质量分数）、发酵时间 24 h，此条件下蛋白质含量为 0.679 mg/g。以最优条件下发酵后的紫苏粕酶解制备抗氧化肽，研究酶种类与酶用量对发酵后紫苏粕抗氧化性的影响。结果表明，发酵后紫苏粕蛋白经碱性蛋白酶水解后，其抗氧化能力强于胰蛋白酶水解后的酶解液，且当碱性蛋白酶的用量在 5.0%（80
3、0 U/g）时，酶解液对 DPPH 自由基、羟基自由基、ABTS+自由基、超氧阴离子自由基清除能力达到最佳。关键词：紫苏粕；抗氧化肽；发酵；酶解；抗氧化性Process Optimization and Activity of Antioxidant Peptides Prepared from Fermented Perilla MealCHEN Linlin1，WANG Ling1，ZHENG Fengming1，ZHANG Haipeng1，HAO Xi1，XIN Jiaying1，2（1.Food Engineering College，Harbin University of Com
4、merce，Harbin 150028，Heilongjiang，China；2.State Key Laboratory for Oxo Synthesis Selective Oxidation，Lanzhou Institute of Chemical Physics，ChineseAcademy of Sciences，Lanzhou 730000，Gansu，China）Abstract：The defatted perilla meal，the by-product of perilla oil refining，was fermented with yeast.Single fa
5、ctor tests and response surface methodology were employed to optimize the fermentation process.The protein content reached the maximum of 0.679 mg/g when the fermentation was carried out with the liquid-to-material ratioof 5.01（mL/g）and the inoculum amount of 8.5%（weight per unit volume）at pH3.4 for
6、 24 h.Antioxidant peptide was prepared by enzymatic hydrolysis with the perilla meal fermented under the optimal conditions.The effects of enzyme type and enzyme amount on the antioxidant activity of fermented perilla meal were determined.The fermented perilla meal protein hydrolyzed by alkaline pro
7、tease showed stronger antioxidant capacity thanthat hydrolyzed by trypsin.When the amount of alkaline protease was 5.0%（800 U/g），the hydrolysate showed thehighest DPPH，hydroxyl，ABTS+，and superoxide anion radical scavenging abilities.Key words：perilla meal；antioxidant peptide；fermentation；enzymatic h
8、ydrolysis；antioxidant activity引文格式：陈林林，王玲，郑凤鸣，等.发酵紫苏粕制备抗氧化肽的工艺优化及抗氧化性J.食品研究与开发，2023，44（18）：116-124.CHEN Linlin，WANG Ling，ZHENG Fengming，et al.Process Optimization and Activity of Antioxidant Peptides Prepared fromFermented Perilla MealJ.Food Research and Development，2023，44（18）：116-124.抗氧化肽由动植物酶促水解、
9、分离和提取获得，可以抑制生物聚合物的过氧化或在体内消除自由基，具有一定的抗氧化能力1。抗氧化肽的作用机制是能够直接作用于自由基，阻止其发生反应；还可以吸收能够应用技术116食品研究与开发23 年 9 月第 44 卷第 18 期基础研究产生自由基的物质，减少体内自由基的含量。机体抵抗氧化的能力越强，患相关疾病的可能性就越小。对抗氧化肽的深入研究使其在功能性产品、食品添加剂、化妆品、制药和其他行业中的应用日益广泛2-4。以植物蛋白作为原料制得的抗氧化肽，具有抗氧化、提高免疫力、延缓衰老、抗高血压等生理功能，如今抗氧化肽已经成为国内外研究热点。近年来，活性肽大多采用酶解法制成，通过酶解法从植物蛋白中
10、制备的生物活性肽不仅活性高，而且无毒副作用5-7。杨雪等8将豌豆蛋白以碱性蛋白酶酶解，通过测定豌豆蛋白酶液对自由基的清除率，制备出具有强抗氧化活性的豌豆活性肽。紫苏在我国已有近 2 000 年的种植和使用历史，是一种一年生传统草本植物，可以食用或入药。紫苏饼粕是紫苏籽脱脂后的副产物，与其他油料脱脂后的饼粕相比，紫苏饼粕是一种蛋白含量丰富、杂质少，含有丰富的必需氨基酸、功效比值、净蛋白比值、消化率高的优质植物蛋白资源9。胡博路等10研究表明，紫苏叶具有很强的清除超氧阴离子自由基和羟基自由基能力。本文以紫苏粕为原料，利用酵母菌对其发酵提高蛋白质含量，对发酵紫苏粕中的蛋白进行提取并通过单因素与响应面
11、试验优化其发酵条件；利用蛋白酶对发酵后紫苏粕进行水解，制备紫苏粕抗氧化肽，并以1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羟基自由基、2，2-联偶氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）2，2-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid），ABTS阳离子自由基、超氧阴离子自由基的清除率，及铁离子还原抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）等为指标，来探究酶种类和酶用量对发酵后紫苏粕抗氧化肽活性的影响。以期为紫苏加工副产品的高值利用和
12、抗氧化肽的开发提供依据。1材料与方法1.1材料与试剂紫苏粕：黑龙江省桦南农盛园食品有限公司；酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）131 保存于哈尔滨商业大学食品工程学院发酵与生物催化实验室；邻苯三酚（焦性没食子酸）、抗坏血酸：天津市兴复精细化工研究所；三羟甲基氨基甲烷（trometamol，Tris）、ABTS、2，4，6-三吡啶基三嗪 2，4，6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ：萨恩化学技术有限公司；DPPH：日本东京化成工业株式会社；麦芽汁培养基、碱性蛋白酶（200 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司，所
13、用试剂均为分析纯。1.2仪器与设备UV 5100B 型紫外可见分光光度计、HZP-D 恒温振荡箱：上海元析仪器有限公司；DHG-9070A 型电热恒温鼓风干燥箱、LDZX-50KB 立式高压蒸汽灭菌箱：上海一恒科技有限公司。1.3方法1.3.1脱脂紫苏粕的发酵1.3.1.1紫苏粕脱脂称取一定量的紫苏粕粉，按 13（g/mL）比例加入3060 沸程的石油醚搅拌浸提 30 min，过滤后弃去上层油脂清液，多次重复，直至最后石油醚为无色。滤渣在 80 烘箱中干燥，4 冰箱保存。1.3.1.2菌种的活化称取 13 g 麦芽汁培养基，加热溶解在 100 mL 无菌水中，装于锥形瓶中，在 121、1.01
14、 kPa 的条件下灭菌 15 min 后取出培养基置于无菌台，冷却后在培养基中加入 0.5 g 酵母，在恒温摇床（37、120 r/min）中培养 24 h 后，用无菌水冲洗，将冲洗后的孢子倒入锥形瓶中，采用无菌纱布过滤，制备成孢子悬浮液。最后用血球计数板计数后，将孢子悬浮液的浓度调整为 21065106CFU/mL，置于冰箱中 4 保存备用。1.3.1.3固态发酵紫苏粕在 250 mL 锥形瓶中加入一定量的脱脂紫苏粕，加入适量无菌水混匀，密封后灭菌（121，20 min），将孢子悬浮液倒入超净工作台上的锥形瓶中混匀发酵。发酵后灭菌（121，10 min）、干燥（50，48 h），得到紫苏粕抗
15、氧化肽粗提物。研磨后，密封并储存在 4 冰箱。1.3.2脱脂紫苏粕发酵单因素试验1.3.2.1pH 值对发酵紫苏粕蛋白质含量的影响分别准确称取 25 g 发酵紫苏粕置于灭菌后的锥形瓶中，按 3.01（mL/g）的液料比加入 75 mL 无菌水，酵母菌接菌量为 3.2%，调节溶液 pH 值分别为 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0。将 5 组样品置于恒温振荡箱在 37 下发酵 24 h。考察不同 pH 值对发酵液中蛋白质含量的影响。1.3.2.2接菌量对发酵紫苏粕蛋白质含量的影响分别准确称取 25 g 发酵紫苏粕置于灭菌后的锥形瓶中，按 3.01（mL/g）的液料比向每组加入 75
16、mL 无菌水，调节溶液 pH 值为 3.0，加入酵母菌液混匀，接菌量为 4%、8%、12%、16%、20%（酵母菌菌液加入量与发酵紫苏粕质量分数），将 5 组样品置于恒温振荡箱在37 下发酵 24 h。考察不同接菌量对蛋白质含量的影响。1.3.2.3液料比对发酵紫苏粕蛋白质含量的影响分别准确称取 25 g 发酵紫苏粕置于灭菌后的锥形瓶中，酵母菌接菌量为 3.2%，各加入 25、50、75、100、应用技术117食品研究与开发23 年 9 月第 44 卷第 18 期基础研究125 mL 无菌水，混匀，调节溶液 pH 值为 3.0。将 5 组样品置于恒温振荡箱在 37 下发酵 24 h。考马斯亮蓝
17、法测发酵液中蛋白质含量，考察不同液料比对蛋白质含量的影响。1.3.2.4发酵时间对发酵紫苏粕蛋白质含量的影响分别准确称取 25 g 发酵紫苏粕置于灭菌后的锥形瓶中，按 3.01（mL/g）的液料比向每组加入 75 mL 无菌水，酵母菌接菌量为 3.2%，调节溶液 pH 值为 3.0，将5 组样品置于恒温振荡箱在 37 下发酵 6、12、18、24、30、36、42、48 h。考马斯亮蓝法测发酵液中蛋白质含量，考察不同发酵时间对蛋白质含量的影响。1.3.3脱脂紫苏粕发酵响应面试验选取 pH 值（A）、液料比（B）、接菌量（C）3 个反应条件进行单因素优化试验，每组试验进行 3 次平行试验。在此基
18、础上，确定工艺条件的优选试验范围，采用Design-Expert 8.0 响应面分析法对工艺条件进行优化。因素与水平见表 1。1.3.4紫苏蛋白的提取参考 Zhao 等11的方法略作改动，首先进行碱溶处理，准确称取 20.0 g 发酵紫苏粕，按液料比 101（mL/g）加入一定量蒸馏水，调节反应体系的 pH 值至 9.0，50 恒温水浴，充分浸泡 1 h 后，进行离心（3 000 r/min，15 min），保留上清液。将上清液的 pH 值调整至 4.4，静置 10 min 后，使蛋白酸沉。将上清液于 3 000 r/min 离心 15 min，将离心分离得到的沉淀物以 12 质量比溶解，溶液
19、用浓度 1.0 mol/L 的 NaOH 溶液调 pH 值为 7.0后，冷冻干燥，得到发酵紫苏粕分离蛋白。1.3.5蛋白质含量的测定参考 Cheng 等12的方法，准确称取考马斯亮蓝粉末 0.10 g，于 50 mL 乙醇（95%）中溶解，加入 100 mL 磷酸（85%），用蒸馏水定容至 1 000 mL，过滤后收集滤液，得到考马斯亮蓝溶液。以标准蛋白质浓度为横坐标X，吸光度 A595nm为纵坐标 Y，绘制蛋白质浓度标准曲线，计算发酵紫苏粕中的蛋白质含量。回归方程为 Y=0.780 7X-0.039，R2=0.991 8，在浓度范围为 01.0 mg/mL内，蛋白质浓度与 A595nm之间具
20、有良好的线性关系，可用于待测样品中蛋白质浓度的计算。1.3.6抗氧化肽的制备与条件优化参考 Hashimoto 等13的方法，取 5.0 g 的发酵紫苏粕于锥形瓶中，加入 100 mL 蒸馏水，超声处理 20 min，调节 pH 值，分别加入碱性蛋白酶（200 U/mg）和胰蛋白酶（250 U/mg），酶加入量分别为 1%（160 U/g）、3%（480U/g）、5%（800U/g）、7%（1120U/g）和 9%（1440U/g）。在 40 水浴恒温振荡器中酶解 4 h，灭酶处理 15 min，真空抽滤后收集滤液。加入无水乙醇（V滤液V无水乙醇=12），静置沉淀 12 h，除去上清液，将沉淀
21、物冻干，备用。1.3.7发酵紫苏粕抗氧化肽活性的测定1.3.7.1DPPH 自由基清除能力的测定参照 Chen 等14方法略有改动。用无水乙醇配制浓度为 210-4mol/L 的 DPPH 溶液，将其与紫苏蛋白酶解液以体积比 11 均匀混合，于室温下避光反应 30 min后，在波长 517 nm 处测量溶液的吸光度 A。同时，以无水乙醇为参照物，用去离子水和抗坏血酸替代酶解紫苏蛋白溶液，按相同的操作方法测定 A517nm。并以此作为空白对照和阳性对照。根据下述公式计算 DPPH 自由基清除率（D，%）。D=A0-（A1-A2）A0100式中：A1为酶解紫苏蛋白溶液+DPPH 乙醇溶液的吸光度；
22、A2为酶解紫苏蛋白溶液+乙醇溶液的吸光度；A0为乙醇液+DPPH 乙醇溶液的吸光度。1.3.7.2超氧阴离子自由基清除能力的测定参照 Siswoyo 等15方法略有改动。配制酶解紫苏蛋白溶液和 Tris-HCl 混合溶液（50 mmol/L，pH8.2），25 下恒温水浴 20 min，取出后立即加入温度为 25 的0.2 mL 7 mmol/L 邻苯三酚溶液，将混合溶液定容至10 mL。待反应启动后 1 min 开始计时，在波长 325 nm处，每间隔 30s 测定一次吸光度 A，共记录吸光度 6 次。以时间（t）为横坐标，A325nm为纵坐标，标准曲线的斜率就是邻苯三酚自氧化速率。用去离子
23、水和抗坏血酸替代酶解紫苏蛋白溶液，按相同的操作方法测定 A325nm。并以此作为空白对照和阳性对照。根据下述公式计算超氧阴离子自由基清除率（F，%）。F=A0-AsA0100式中：A0为去离子水和抗坏血酸的邻苯三酚氧化速率计算吸光度曲线的斜率；As为酶解紫苏蛋白溶液的邻苯三酚氧化速率计算吸光度曲线的斜率。1.3.7.3ABTS+自由基清除能力的测定参考 Lin 等16的方法略有改动。按照体积比 11 将过硫酸钾溶液（2.45 mmol/L）与 ABTS 溶液（7 mmol/L）均匀混合，室温下避光反应 15 h。用磷酸缓冲液（0.01 mol/L，pH7.4）将 ABTS 溶液稀释，直至 73
24、4 nm处吸光度为 0.70，制得 ABTS 反应液。取 1 mL 酶解紫苏蛋白溶液和 5 mL ABTS 反应液，振荡摇匀，于室温表 1响应面试验因素与水平Table1Factors and levels of response surface methodology水平因素A pH 值B 液料比/（mL/g）C 接菌量/%-13.02.01403.53.51814.05.0112应用技术118食品研究与开发23 年 9 月第 44 卷第 18 期基础研究下静置 10 min 后在 734 nm 处测其吸光度 A，用去离子水和抗坏血酸替代酶解紫苏蛋白溶液，按相同的操作方法测定 A734nm。
25、并以此作为空白对照和阳性对照。根据下述公式计算 ABTS+自由基清除率（A，%）。A=A734 nm-AA734 nm100式中：A734 nm为去离子水和抗坏血酸在 734 nm 处测其吸光度；A 为酶解紫苏蛋白溶液在 734 nm 处测其吸光度。1.3.7.4羟基自由基清除能力的测定将酶解紫苏粕蛋白溶液、FeSO4溶液（9 mmol/L）和水杨酸乙醇溶液（9 mmol/L）以体积比 111 混合，然后加入相同体积的 H2O2溶液（8.8 mmol/L）。37 恒温水浴 30 min 后离心（5 000 r/min，10 min）。在波长 520 nm处，测量上清液的吸光度 A17-18。用
26、去离子水和抗坏血酸代替酶解紫苏蛋白溶液，按相同的操作方法测定A520nm。并以此作为空白对照和阳性对照。根据下述公式计算羟基自由基清除率（N，%）。N=A520 nm-AA520 nm100式中：A520 nm为去离子水和抗坏血酸在 520 nm 处测其吸光度；A 为酶解紫苏蛋白溶液在 520 nm 处测其吸光度。1.3.7.5FRAP 总抗氧化能力的测定参考 Hetharia 等19的方法，略有改动。准确称取0.51 g 乙酸钠，加 2 mL 冰醋酸，定容至 25 mL；准确称取 0.078 1 g TPTZ 粉末，加 83 L 浓盐酸，并用蒸馏水定容至 25 mL；精确称取 0.162 g
27、 FeCl3，用 30 mL 蒸馏水溶解并摇匀。将上述步骤中制备的溶液以 1011 的体积比混合，制成 FRAP 工作液。准确量取 1 mL 酶解紫苏粕蛋白溶液至比色管中，加入制备的工作液 6 mL，摇匀，37 恒温水浴加热 10 min 后，在波长为 593 nm，测量溶液的吸光度，吸光度越大，表示总还原能力就越强。2结果与分析2.1发酵条件对紫苏粕蛋白质含量影响的单因素试验2.1.1pH 值对发酵紫苏粕蛋白质含量的影响pH值对发酵紫苏粕蛋白质含量的影响如图1所示。由图 1 可知，pH 值从 3.0 变化到 3.5 时，发酵紫苏粕蛋白质含量增加，达到 0.293 mg/g。当 pH 值继续增
28、加至 4.0 时发酵紫苏粕蛋白质含量又急剧下降，pH 值对发酵紫苏粕蛋白质含量产生影响的原因可能是 pH值的改变影响酵母菌的活性20，当 pH 值为 3.5 时，发酵紫苏粕蛋白质含量最高，因此选择 pH 值为 3.5 进行后续试验。2.1.2接菌量对发酵紫苏粕蛋白质含量的影响接菌量对发酵紫苏粕蛋白质含量的影响如图 2所示。由图 2 可以看出，一定范围内，蛋白质含量随着接菌量的增加而提高，当接菌量为 8%时，所产生的蛋白质含量达到最高值（0.375 mg/g），随着接菌量的继续增加，蛋白质含量开始下降，且接菌量对蛋白含量产生影响的原因可能是反应体系中微生物过多，大量聚集在紫苏粕表面，降低了代谢速
29、度，影响发酵效果，因此选择接菌量为 8%进行后续试验。2.1.3液料比对发酵紫苏粕蛋白质含量的影响液料比对发酵紫苏粕蛋白质含量的影响如图3所示。从图 3 可以看出，随着液料比的增加，蛋白质含量明显增加。液料比为 3.01（mL/g）时，达到最大值。随着液料比值的进一步增加，蛋白质含量开始下降，当液料比超过 4.01（mL/g）时，蛋白质含量迅速下降。这可能是因为反应系统中的水分含量过高，反应溶液被过度稀释，各种营养素的浓度降低，导致微生物代谢减慢，从而影响蛋白质的含量21。因此选择液料比图 1pH 值对发酵紫苏粕蛋白质含量的影响Fig.1Effect of pH value on protei
30、n content of fermented perillameal;+BFUNHHUQ)图 2接菌量对发酵紫苏粕蛋白质含量的影响Fig.2Effect of inoculation amount on protein content offermented perilla meal;+BFUNHHU8F应用技术119食品研究与开发23 年 9 月第 44 卷第 18 期基础研究3.01（mL/g）进行后续试验。2.1.4发酵时间对发酵紫苏粕蛋白质含量的影响发酵时间对发酵紫苏粕蛋白质含量的影响如图 4所示。由图 4 可以看出，当发酵时间在 624 h 范围内时，紫苏粕蛋白质含量呈上升状态可能是
31、因为酵母菌可以将其含有复杂的蛋白质分解成更简单、更容易消化的形式，从而增加了紫苏粕蛋白质含量，2448 h 趋于平缓，这可能是因为营养来源被耗尽，紫苏粕蛋白质含量缓慢增长。选取 24 h 为发酵时间，与郑温翔等22研究结果一致。2.2脱脂紫苏粕发酵最佳工艺条件的确定2.2.1试验设计方案及结果通过中心组合设计法设计响应面试验，优化紫苏发酵工艺，响应面设计及结果如表 2 所示。2.2.2模型的建立及显著性分析利用 Design-Expert 8.0 软件对表 2 数据进行多元回归拟合，得到发酵紫苏粕蛋白质含量（Y）、pH 值（A）、液料比（B）、接菌量（C）的二次多项回归模型方程：Y0.648.
32、12510-3A0.073B0.076C0.047AB0.037AC0.059BC0.080A20.056 33-0.11C2。方差分析结果如表 3 所示。从表 3 可以看出，整体模型水平极显著（P0.05），R2=0.977 3，R2adj=0.948 1，表明该方程具有较高的拟合度。根据方差分析结果显示 A不显著，B、C、AB、AC、BC 均显著（P0.05），表明各因注：P0.05，表示影响显著；P0.01，表示影响极显著。表 3方差分析结果Table 3Variance analysis results变异来源离差平方和 自由度均方F 值P 值模型0.2190.02317.180.00
33、0 1A5.28110-415.28110-40.340.413 4B0.04310.04319.320.000 1C0.04610.04640.830.000 1AB8.64910-318.64910-35.640.009 7AC5.55010-315.55010-33.620.025 8BC0.01410.0143.060.002 9A20.02710.02716.290.000 4B24.65510-314.65510-38.470.036 4C20.05310.05349.85液料比（B）pH 值（A）。2.2.3因素交互作用的影响pH 值与接菌量、液料比与接菌量和 pH 值与液料比的
34、交互作用如图 5图 7 所示。图 5pH 值与接菌量的交互作用Fig.5Interaction between pH value and inoculation amount图 6液料比与接菌量的交互作用Fig.6Interaction between liquid-solid ratio and inoculation amount图 7pH 值与液料比的交互作用Fig.7Interaction between pH and liquid-solid ratio4.03.83.63.43.0C 接菌量/%发酵紫苏粕蛋白质含量/（mg/g）A pH 值120.30.50.6108640.40.
35、73.2发酵紫苏粕蛋白质含量/（mg/g）1210864C 接菌量/%A pH 值4.03.83.63.43.03.2发酵紫苏粕蛋白质含量/（mg/g）1210864C 接菌量/%B 液料比/（mL/g）2.014.413.813.212.615.01C 接菌量/%发酵紫苏粕蛋白质含量/（mg/g）120.30.50.6108640.40.70.22.014.413.813.212.615.01B 液料比/（mL/g）发酵紫苏粕蛋白质含量/（mg/g）B 液料比/（mL/g）A pH 值2.014.413.813.212.615.014.03.83.63.43.03.24.03.83.63.4
36、3.0A pH 值3.2发酵紫苏粕蛋白质含量/（mg/g）0.30.50.60.40.7B 液料比/（mL/g）2.014.413.813.212.615.01应用技术121食品研究与开发23 年 9 月第 44 卷第 18 期基础研究根据回归方程，为了检验各因素之间的相关性，对结果进行了响应面分析，如图 5、6 和 7 所示。图中响应面和等高线形状的变化更直接地反映了 pH 值、液料比和接菌量对蛋白质含量的影响。在响应面图中，曲面越陡，凸起越大，表明所分析的两个因素之间的相互作用与对响应值的影响呈正相关。在等高线图中，等高线形状越接近椭圆，表明所分析的因素之间就有越显著的相互作用。从图 5
37、可以看出，保持 pH 值不变，随着接菌量的增加，蛋白质含量先增加后降低。从等高线的形状可以看出，pH 值和接菌量之间的相互作用对响应值有显著影响。从图 6 可以看出，当液料比保持不变，接菌量增加时，蛋白质含量先增加后降低。从等高线的形状可以看出，液料比和接菌量之间的相互作用对响应值有显著影响。从图 7 可以看出，当 pH 值保持不变，液料比增大时，蛋白质含量先增加后降低。从等高线形状可以看出，pH 值和液料比之间的相互作用对响应值有显著影响。2.2.4最优工艺参数采用 Design-Expert 8.0 软件进行分析并求解二次多元回归模型，得到的最佳发酵工艺条件为 pH3.37、液料比 5.0
38、1（mL/g）、接菌量为 8.48%，蛋白质理论含量0.683 mg/g。通过对实际可操作性的考虑，将优化条件调整为 pH3.4、液料比 5.01（mL/g）、接菌量 8.5%。在此条件下进行 3 次重复试验，得到蛋白质含量的平均值为 0.679 mg/g，与理论值相比，其相对误差约为 0.59%液料比pH 值。以最优条件下发酵后的紫苏粕通过酶解制备抗氧化肽，当碱性蛋白酶的用量在 5%（800 U/g）时，发酵紫苏粕酶解液的抗氧化活性呈现最佳，酶解液对 DPPH 自由基、超氧阴离子自由基、ABTS+自由基、羟基自由基的清除率分别可达 65.63%、50.14%、47.35%、45.63%。为紫
39、苏加工副产物利用和抗氧化肽的开发提供理论参考。参考文献：1NAJAFIAN L,BABJI A S.Production of bioactive peptides usingenzymatic hydrolysis and identification antioxidative peptides frompatin(Pangasius sutchi)sarcoplasmic protein hydolysateJ.Journalof Functional Foods,2014,9:280-289.2SANNASIMUTHU A,AROCKIARAJ J.Intracellular free
40、 radicalscavenging activity and protective role of mammalian cells by antioxidant peptide from thioredoxin disulfide reductase of arthrospiraplatensisJ.Journal of Functional Foods,2019,61:103513.3HALESHAPPA R,PATIL S J,SIDDALINGA MURTHY K R.Phytochemical analysis,in vitro evaluation of antioxidant a
41、nd free radi#547*#K(F*F-;+F=F6;+F图 11不同酶解条件对羟基自由基清除能力的影响Fig.11Effect of different enzymatic hydrolysis conditions onscavenging ability of hydroxyl radical47*#K(F*F-;+F=F6;+F图 12不同酶解条件对 FRAP 总抗氧化能力的影响Fig.12Effects of different enzymatic hydrolysis conditions ontotal antioxidant capacity of FRAPF*F-;+
42、F=F6;+F应用技术123食品研究与开发23 年 9 月第 44 卷第 18 期基础研究cal scavenging activity of simarouba glauca seedsJ.Advances inPharmacology and Pharmacy,2021,9(1):1-8.4BHIXAVATIMATH P,MANIYAR Y,NAIKWADI A.Synthesis,characterization and evaluation of potential antioxidant free radicalscavenging activity of novel synthet
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