1、基金项目:陕西省自然科学础研究计划面上项目()大学生创新创业训练计划项目()作者简介:尚坤 男讲师博士 研究方向为天然产物化学生物:.阎瑾逸 女学士 研究方向为微生物活性产物开发:.高君梅 女学士 研究方向为微生物活性产物开发:.尚坤、阎瑾逸与高君梅为并列第一作者 通讯作者 男教授博士博士生导师 研究方向为微生物活性产物开发:.收稿日期:放线菌来源活性天然产物发现研究进展尚 坤 阎瑾逸 高君梅 王 瑾 李思颖 闫祥祥 黄小玉 刘 晨 岳昌武(延安大学基础医学院 延安市微生物药物创新及转化重点实验室陕西 延安)摘 要 放线菌()是抗生素等活性天然产物的重要来源在临床治疗病原菌感染等重大疾病方面发
2、挥着重要作用 由于抗生素滥用等原因导致临床上出现的以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌()等为代表的耐药的种类和数量急剧增加对人类生存造成了重大威胁 结合现代生物技术进展加大放线菌来源新抗生素的开发力度刻不容缓 本文对新时期放线菌来源抗生素的发现现状、基于生理操作和基因操作的放线菌来源天然产物挖掘的技术方法等进行综述以期对放线菌来源活性天然产物的发现提供借鉴关键词 放线菌活性天然产物发现抗生素菌株筛选基因组挖掘研究进展中图分类号 文献标识码 文章编号 ():./.(.).期 顾 欣等:耐高温沼渣降解菌的筛选及复合菌剂降解效果研究 微生物来源的抗生素类药物在临床治疗病原菌感染和肿瘤等重大疾病方面发挥着重要
3、作用是抗生素的主要来源具有非常好的临床应用前景(表)由于近年来抗生素的滥用等原因导致临床上出现的多药耐药甚至全耐药菌株的数量和种类急剧增加从 年“超级菌”全球火速扩散到 年 月美国 医疗中心爆发“超级菌”肆虐“超级菌”严重威胁着人类的生命健康已成为全球医疗卫生领域面临的一道亟待攻克的难题 抗生素权威 曾指出超级菌可让致病菌变得无比强大抵御几乎所有抗生素而且由于新抗生素的研发、上市速度严重滞后可能会导致“超级菌”感染 年内将无药可用 由于细菌耐药给全球临床抗生素用药带来了巨大挑战近年来新抗生素的研发重新受到医药行业和各国政府高度重视大有回暖之势 自 世纪以来基因组学、代谢组学以及基因组编辑等技术
4、的巨大进步促使科学家们开始反思和改进抗生素研发策略提出了许多诸如基于分子系统学、代谢组学以及基因组挖掘技术的新抗生素发现新策略并取得了诸多进展 本文总结了 世纪起从放线菌中发现的重要活性天然产物及其策略和方法对新时期放线菌来源抗生素的开发现状、放线菌新菌株的筛选、放线菌来源天然产物快速鉴定、沉默基因簇等基因组挖掘的技术方法等进行综述以期对放线菌来源的活性天然产物的发现提供借鉴表 已知天然产物及其合成类似物数量及应用前景 天然产物或合成类似物/个已知天然产物/个活性产物/个抗生素应用前景生物来源天然产物超过 微生物代谢物 放线菌代谢产物约 约 约 真菌代谢产物约 约 约 非细胞微生物代谢产物约
5、约 约 高等生物代谢产物:植物界 低等植物/藻类代谢产物 约 约?高等植物 万 万约 约 高等生物代谢产物:动物界 海洋无脊椎动物代谢产物 约 约 陆生动物代谢产物 约 约?合成化合物 半合成抗生素?几乎全部 抗生素结构类似物?极少?合成化合物总数百万?约 注:数据来自参考文献下表同:抗感染、抗病毒、抗肿瘤产物:微小真菌、担子真菌、粘菌纲、粘霉菌:本表统计非细胞微生物包括:粘液菌、蓝藻等?:有待实验验证 :抗生素成药潜力存疑 :抗生素成药潜力较低 :抗生素成药潜力较强 :抗生素成药潜力极强 放线菌来源活性天然产物的开发现状放线菌来源的活性天然产物是抗生素的重要来源目前发现放线菌来源的微生物生物
6、活性物质超过 个其中抗生素活性天然产物超过 个除了目前还在临床上广泛应用的链霉素、卡那霉素、氯霉素等抗生素外还包括免疫调节剂、受体拮抗剂以及酶、维生素、有机酸等生物活性物质 按照微生物天然产物开发历程可将放线菌天然产物的发现分为三个阶段:前 年(年代至 年代)、第二个 年(年代至 年代)和 年代及以后 从表 可以看出尽管进入新时期从普通生境中分离出 微 生 物 学 杂 志 卷新的放线菌种以及挖掘新的活性天然产物已变得越来越困难放线菌来源的活性产物在微生物来源活性产物中的比重也在不断降低(从早期的降到了目前的.)科学家们基于“新环境新菌株新产物”策略从特殊生境或稀有放线菌中通过各种基因组挖掘等方
7、法开发新型抗生素并取得了积极成效 据 等统计从 年到 年通过链霉菌抗生素发现新策略已从各种生境链霉菌中发现至少 种以上具有抗()活性的药物前导化合物提示这不失为开发放线菌来源抗生素的重要途径表 年至 年间报道的微生物活性产物的大致数量及比例 来源物种发现时期(年代)及比例()早期(年)比例/中期(年)比例/新时期(年)比例/总数放线菌 .链霉菌 其他放线菌 细菌 粘细菌 蓝细菌 真菌 微小真菌 担子真菌 其他真菌总数/年/新时期典型生境放线菌来源活性天然产物的发现进入 世纪以来以高分辨质谱等为代表的现代质谱技术、代谢组学为代表的现代组学技术的巨大进步以及上述天然产物开发策略的调整发现了一大批新
8、型放线菌来源的抗生素.大环内酯类化合物周啟辉等从高纬度北海海洋中分离出了的链霉菌(.)并从中分离出 个()活性化合物其中化合物 是大环内酯类化合物、为开环类化合物 等从东南极洲潮间带沉积物中分离的稀有放线菌海沉淀菌()中分离出具有很好的抗菌活性的萜类、烷基间苯二酚、低聚糖或氨基酸衍生的大环内酯类系列化合物.新型大环多烯内酯类化合物刘洋等人从威海近海海域分离出链霉菌(.)菌株运用(一株菌株多个产物)方法挖掘出 种有独特的环戊烯酮结构存在的新型大环多烯内酯类化合物 经初步测试化合物 在 /时抑制稻瘟病菌孢子萌发抑制率可达到.生物碱类化合物矫文策等从大连周边海域分离的星海链霉菌(.)中挖掘出具有良好
9、抑制肿瘤细胞活性的含亚砜官能团的生物碱类次级代谢产物 周彪分别从链霉菌(.)和链霉菌(.)的大米固体培养基和高氏液体培养基的培养物中分离出具有双吲哚化学结构的生物碱星孢菌素类化合物其中从链霉菌(.)培养物中分离出 个化合物(化合物 )其中 个为新化合物(化合物 )从链霉菌(.)培养物中分离出 个化合物(化合物 )其中 个为新化合物(化合物 )这些新化合物对前列腺癌和乳腺癌的治疗具有潜在的应用价值.酰胺类化合物 期 顾 欣等:耐高温沼渣降解菌的筛选及复合菌剂降解效果研究 孙金柱从链霉菌(.)出 个化合物()其中、化合物为苯甲酰胺类化合物、为首次从自然界中分离出的酰胺类天然产物号化合物为新的链型酰
10、胺类化合物 该放线菌主要的次级代谢产物是化合物 抗菌实验结果显示化合物对番茄灰霉病菌()、水稻纹枯病菌()、苹果斑点落叶病菌(.)有一定的抑菌活性.聚酮类化合物 等从梵净山原始森林土样中分离的链霉菌(.)中得到发酵天然产物 化合物(图)该系列抗生素对 和肠球菌有较强的杀菌作用还可抑制肝母细胞瘤、肺癌以及人胃癌细胞、黑色素瘤等多种癌细胞株的增殖对抗肿瘤新药的开发具有重要的意义 等从来自海洋的马杜拉放线菌(.)中分离出了新型低毒抗真菌聚酮 .噻嗪类化合物 等从海洋来源放线菌绿藻()中分离出了一种新的噻嗪和两种新的噻唑衍生物并将其命名为 其中 具有独特的 羟基苯基噻嗪 核 对非小细胞肺癌细胞 表现出
11、中度的细胞毒作用.环肽类化合物郭俊夫从海南岛沿海浅海区生长的菌株绿色链霉菌()中纯化出系列具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性的环脂肽类的伊枯草菌素类()化合物、以及 这类化合物的疏水部分是由 个碳原子组成的 氨基脂肪酸亲水部分是肽链是由 个 氨基酸通过由脂肪酸的氨基与 末端氨基酸的羧基形成的酰胺键成环典型结构.放线菌素类化合物天然的放线菌素类化合物的发色团母核均为吩噁嗪酮即 氨基 二甲基吩噁嗪酮 二羧酸 年王强从链霉菌 .和糖单孢菌(.)菌株的活性次级代谢产物中分离出 个放线菌素类化合物(化合物 )其中化合物 和 的生色团母核为罕见的噁唑并吩噁嗪四环稠合结构这种母核结构在天然放线菌素
12、中首次被发现 化合物 为新结构化合物命名为新放线菌素 化合物 为首次发现天然放线菌素衍生物命名为新放线菌素 通过其抗菌活性测试结果显示新放线菌素 可以对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌()、甲氧西林耐药的表皮葡萄球菌()等多种耐药菌株具有中等的抗菌活性 并且对肺腺癌、结肠癌、肝癌等癌细胞具有较强的抗肿瘤细胞活性.糖苷类化合物保罗霉素()是对金黄色葡萄球菌()和蜡样芽胞杆菌()等革兰阳性细菌具有很强活性的抗生素用于治疗淋球菌和衣原体感染 等在海底 峡谷进行海洋考察时从 的深海沉积物中分离出来的松木小单孢菌 中分离出了一种没有报道过的新的 该抗生素是一种新型的天然产物结构独特它
13、是 家族中第 个缺乏 部分的抗生素是报道的最小的生物活性的 该天然产物是第一个对不同的人类肿瘤细胞系如对胰腺癌、乳腺腺癌和肝细胞癌的家族成员表现出强烈的细胞毒活性 值得考虑作为进一步研究其抗癌潜力的候选药物 激活次级代谢基因表达促进抗生素合成放线菌是抗生素的重要来源其次级代谢途径编码基因表达与否直接决定了该次级代谢产物能否合成 等分析了天蓝色链霉菌()()的近 个代谢相关基因在不同生理状态下的表达状态发现约有的代谢相关基因只有在特定环境状态下才被 微 生 物 学 杂 志 卷诱导表达 如何有效激活“沉默”的次级代谢基因最大程度发掘菌株的次级代谢潜力已成为当前新抗生素开发研究人员面临的重要课题目前
14、针对放线菌的沉默基因激活主要有两种策略一种是在生理层面改变放线菌的生活环境主要有混合培养、化学表观遗传调控、核糖体工程等策略 另一种是在基因层面对基因的直接操作主要包括调控基因的遗传操作、基因簇倍增以及异源表达等策略.基于生理层面改变放线菌活性天然产物开发混合培养是基于自然生态环境中的微生物往往处于多菌种共存的状态模拟微生物野生生境将分离菌株和 共培养可能有利于增加次生代谢产物的多样性及新生物活性物质的发现机会 策略是通过改变培养基营养成分、值、含氧量、温度、培养方式等随机地激活体内相关基因表达继而改变菌株的代谢途径来产生新的次级代谢产物或提高其产量该策略简单有效是目前微生物次级代谢产物开发的
15、重要手段化学表观遗传学()是向培养基中添加外源性可影响菌株次级代谢途径调控的胞外小分子化合物信号分子或 甲基化酶或去甲基化酶抑制剂、拓扑异构酶抑制剂等以改变染色质结构或调控其次级代谢基因簇转录活性的化学物质启动或抑制菌体内的相关代谢通路从而实现与体内基因表达水平调控相同或相似的生物学效果 核糖体工程()选用作用于核糖体的抗生素通过菌株对相应抗生素亚致死量的抗性等来筛选得到代谢途径或代谢产物合成效率得到改造的突变株 核糖体工程可用于定向筛选获得耐药突变株进而检测这些耐药株次级代谢能力的改变 以链霉素为例链霉素作用靶点为细菌的核糖体组分当受到外界高浓度链霉素的选择部分菌株核糖体蛋白发生突变成为耐药
16、菌株而这些核糖体蛋白组分的突变往往能刺激或提高菌株内部分抗生素的生物合成 针对基因的遗传操作因其步骤较繁琐需要因菌而异 的优化遗传操作条件适合于对遗传背景较清楚的潜力菌株进行代谢潜力挖掘 而混合培养、表观遗传调控等天然产物挖掘策略由于其操作便捷则适合于对遗传背景并不太清楚的菌株资源库进行大规模、高通量挖掘 因此如果能够通过提供一个较为理想的发酵条件或通过在培养基中添加相应的成分等手段激活放线菌基因组中常规条件下处于沉默状态的抗生素合成隐性基因就可能有效地启动其编码的次级代谢产物合成这将是获得新型放线菌来源抗生素的重要途径这一观点已得到大量研究结果的证实延安市微生物药物创新及转化重点实验室曾利用
17、基因组挖掘技术结合 获得 等系列具有很好抗 活性新卤化抗生素表明这些方法的组合不失为一种有效的抗生素开发手段 我国科学家在型聚酮的发现、生物合成机制及调控机制解析等方面取得了巨大成就特别是张立新、向文胜和王为善等科学家提出了“精准动态调控内源三酰甘油()提高聚酮产量工程策略”被认为“这是 年来首次在代谢水平上清晰阐明链霉菌初级代谢到次级代谢的代谢转换机制并进行工程应用”利用该策略已成功实现了土霉素、杰多霉素等型聚酮的高产菌株的构建给低产抗生素的开发提供一条新的策略.基于基因操作的放线菌活性天然产物开发延安市微生物药物创新及转化重点实验室利用次级代谢基因簇在线分析软件 对天蓝色链霉菌()基因组完
18、成图序列(.)进行了次级代谢产物基因簇预测结果表明该基因组中至少蕴藏着 个独立的次级代谢产物生物合成基因簇这些基因簇在不同的条件下可能产一系列的结构类似物极大地丰度了天蓝色链霉菌的次级代谢产物产生潜力 截至 年已报道在天蓝色链霉菌()中发现了 种天然产物分析统计结果表明目前已有 类次级代谢合成途径编码基因簇在天蓝色链霉菌()中找到了与之相对应的次级代谢产物也就是说经过众多科学家多年的努力在链霉菌的模式生物中尚有 种基因簇未能找到与之相对应的次级代谢产物 这更进一步说明链霉菌的次级代谢潜力远远高于人们以前的预期(即除了部分基因簇对应于已知的活性天然产物外尚有部分代谢途径还没有相应的天然产物与之对
19、应)等利用天蓝色链霉菌()的次级代谢相关的基因芯片分析了可 期 顾 欣等:耐高温沼渣降解菌的筛选及复合菌剂降解效果研究 维链霉菌()、卡特兰链霉菌()、海洋链霉菌()和金黄色北孢菌()等 株菌的基因组后发现至少有 个次级代谢基因簇相关基因在这 株菌中均能找到但从后 株菌中找到的相应基因簇编码合成的产物的数量远少于天蓝色链霉菌()科学家们开始着手对这些基因簇进行进一步深入的开发期待对这些基因簇的激活挖掘能发现新的次级代谢产物放线菌次级代谢产物生物合成基因簇在实验室培养环境的生理状态下往往是以沉默状态存在而且对于很多即使以活性状态存在的次级代谢基因簇而言其表达水平往往很低这就给其相应的产物纯化和鉴
20、定带来很大困难 由于隐性基因簇可能编码合成具有成药潜力的新型化合物因此激活或提高次级代谢隐性基因簇的表达水平对于发现新的次级代谢产物具有极大意义 人们将利用各种手段激活沉默基因簇的表达或者提高其表达水平的操作概称为基因组挖掘()目前常见的微生物基因组挖掘手段主要有抗终止、途径特异性调控激活、基因簇倍增、组合生物合成、代谢工程等 近年来发展的或 等对相应的蛋白编码基因或调控序列进行遗传操作也极大地提高了发现放线菌来源新抗生素的机会基于多拷贝基因簇可以大幅度提高编码天然产物合成量研究者可以利基因编辑技术将完整的生物合成基因簇克隆且定向定点的整合到放线菌基因组特点位点为该产物高效生物合成创造条件 等
21、将完整的 生物合成基因簇整合到产生菌异色链霉菌()基因组上成功地获得 高产菌株(产量由 /提高到/)组合生物合成()是在人们克隆得到大量的微生物次级代谢产物生物合成基因簇及对相关合成基因功能进行分析以及了解其生物合成、调节等基因的基础上通过基因编辑等 操作技术在体外对这些不同来源的基因进行删除、倍增、添加、取代以及重组然后导入到一个适当的微生物宿主中并定向合成新抗生素或其他一些新的生理活性物质的一种复杂、综合性生物技术 等将 的卤化酶基因与 生物合成基因簇在天蓝色链霉菌 中共表达并将甲基化酶 阻断成功获得卤化取代甲基的新卤化物 等将委内瑞拉链霉菌()来源的 编码基因 导入到 生物合成基因簇的
22、编码基因删除的红糖多孢菌()菌株中进行异源表达获得了与 具有相似的生物活性的新结构类似物 和 等也关注到了 等将 的卤化酶基因与 生物合成基因簇的在天蓝色链霉菌 中共表达并将该基因簇的甲基化酶 阻断成功获得了糖基 氨基被吡咯取代的新型化合物 等分别将参与糖基合成、等基因与/进行不同基因间组合整合入 启动子调控下的 质粒载体构建了一系列的重组穿梭质粒载体并分别转化敲除了糖基合成基因簇的委内瑞拉链霉菌 菌株成功得到了正常的天然产物 及系列的衍生物 等利用参与次级代谢糖基化酶基因不保守性和识别糖基配体的宽容性合成新型糖基化修饰原理 将 糖基化酶异源表达纯化酶蛋白催化一系列的配醣体得到了 修饰的系列衍
23、生物 等将不同来源的糖基配体合成基因簇与糖基化酶基因的组合生物合成通过异源组合表达成功实现、等新化合物的系列突变衍生物合成 展 望尽管特殊生境来源放线菌资源收集结合生理水平和基因水平的天然产物挖掘已经极大地增加了研究者通过基因组挖掘的方法获得新次级代谢产物的机会促进了放线菌活性天然产物开发但是由于开发抗耐药菌感染抗生素的过程异乎寻常地困难很多研究者和制药公司放弃了这方面的研究 年辉瑞制药关闭了其抗生素研发中 微 生 物 学 杂 志 卷心也意味着抗生素开发泥土时代的落幕 目前全球前 家最大的制药公司中已有 家彻底退出了抗生素市场抗生素的开发前景需要去思考 后新冠肺炎疫情时代由于 可能在很长的时间
24、内将和人类社会共存越来越多的证据表明大量新冠肺炎患者在住院期间被诊断出患有继发感染 目前尚不清楚这些感染的具体原因但有迹象表明患有病毒性呼吸道感染的患者更易出现细菌感染引起这些继发感染的细菌是对多种药物具有耐药性的细菌 后疫情新冠肺炎时代 开发抗耐药菌感染的新抗生素更应该引起人们的重视抗耐药菌抗生素的开发面临诸多的技术瓶颈针对耐药靶点的高通量药物筛选等技术的进步给包括放线菌来源的抗耐药菌抗生素的开发带来巨大的机遇新抗生素的开发不再是对一个商业化的产物库的简单的筛选和抗菌效果验证问题而是需要充分考虑多方面技术综合集成的多学科的充满挑战的工作 将微生物表观遗传等技术引入放线菌天然产物开发抗生素痕量
25、分析技术引入活性天然产物生物合成的检测天然产物结构解析平台及软件的改进、代谢中间产物示踪技术的发展、基因编辑及代谢工程的组合应用等可能会给放线菌来源抗耐药菌感染抗生素带来新的明天参考文献:.():.:.:.():.:.周啟辉.高纬北极放线菌 和真菌 的次级代谢产物初步研究.上海:华东理工大学.():.():.刘洋.海洋链霉菌 .中天然产物的挖掘.济南:山东大学.矫文策.两株海洋来源链霉菌的分类鉴定及其活性次级代谢产物的研究.大连:大连理工大学.周彪.五株海洋放线菌活性次级代谢产物研究.杭州:浙江大学.孙金柱.一株海洋放线菌次生代谢产物的分离鉴定及抑菌活性研究.长春:吉林大学.():.():.王
26、荫荫.卤化聚酮类抗生素 抑菌及抗肿瘤活性初步分析.遵义:遵义医学院.:.():.():.郭俊夫.海洋放线菌 活性成份分离鉴定及结构解析研究.上海:华东理工大学 .():.王强.海洋链霉菌 和糖单孢菌 活性代谢产物研究.北京:北京协和医学院./.():.().():.:.期 顾 欣等:耐高温沼渣降解菌的筛选及复合菌剂降解效果研究 ():.:.:.:.():.:.():.().():.():.():.():.:.:.():.():.():.:.():.():.():.():.:.:.:.():.():.():.:.:.:.():.():.:.():.:.:().():.?.:.:.():.微 生 物 学 杂 志 卷
