1、（本文编辑：余晓曼）（收稿日期：2 0 2 3-0 2-0 7）http:/www.lenkzz1001-9057.2023.09.016c0m/C.1N/10.3969ISS.D0I110.3969057.2023.09.016论著摘要ClinInternVoL.40.No.9632临床内科杂志2 0 2 3年9 月第40 卷第9 期非糖尿病代谢相关脂肪性肝病患者尿液代谢物特征分析黄艳阳赵娜隋国媛贾连群权冬梅关键词代谢相关脂肪性肝病；尿液代谢物；代谢组学中图分类号R575.5;R333.4文献标识码A代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）的主要病理表现为肝细胞的脂肪沉积超过正常范围,与胰岛素抵抗、
2、遗传等关系密切,是一种与代谢关联紧密的疾病1-2 。MAFLD 是一种进行性疾病,可直接导致肝硬化、肝癌等肝病,且可能参与2 型糖尿病、代谢综合征、动脉粥样硬化性心血管疾病、慢性肾脏病及相关恶性肿瘤的发病34。目前,MAFLD的全球患病率约为2 5%且呈持续增长趋势，由于其对公众健康的影响日益严重，研究防治MAFLD具有重要意义。代谢组学已成为现代研究中发现各个系统疾病相关标志物的新工具5-7 ,可更好地阐述机体变化的代谢结果，提供内源性代谢物的全面概况。基于液相色谱-质谱技术（LC-MS）的代谢组学技术已成功应用于涵盖MAFLD在内的多领域疾病的研究。本文回顾性将其与生物体中发生的潜在生物过
3、程联系起来，可为临床提供更加客观准确的信息。对象与方法1.对象：选取2 0 19 年3月2 0 2 0 年3月沈阳市第六人民基金项目：国家自然科学基金资助项目（8 18 0 38 6 0）；辽宁省自然科学基金资助项目（2 0 2 2-MS-283）；沈阳市中青年科技创新人才支持计划项目(RC210094)作者单位：110 8 47 沈阳，辽宁中医药大学研究生院（黄艳阳），中医脏象理论及应用教育部重点实验室（赵娜、隋国媛、贾连群）；沈阳市第六人民医院消化内科（权冬梅）通讯作者：隋国媛，E-mail：s g y 8 7 10 0 8 12 6.c o m贾连群，E-mail：jlq-15(6):5
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8、itochondrial Dysfunction Mediated医院的非糖尿病MAFLD患者10 例作为nDM-MAFLD组,均符合非酒精性脂肪性肝病防治指南（2 0 18 更新版）1 中MAFLD的诊断标准,其中男、女各5例,年龄18 7 2 岁,平均年龄（55.39.4）岁；再选取同期该院健康体检者10 例作为健康对照组（对照组）,其中男、女各5例，年龄18 7 2 岁，平均年龄(55.18.1)岁。两组受试者年龄、性别比较差异均无统计学意义（P0.05）,具有可比性。排除标准：（1)肝硬化、肝脏恶性肿瘤、急性胆道感染性疾病、正在服用或近3个月服用过具有肝毒性的药物；（2)经标准抗高血压
9、治疗后舒张压 10 0 mmHg，和（或）收缩压 16 0 mmHg；（3）患有恶性肿瘤、先天性心脏病、急性心肌梗死、经皮冠状动脉介人治疗术后、心功能不全级及以上、严重心律失常、急性脑梗塞及出血、肺心病、呼吸衰竭、肾功能不全、造血系统疾病等严重原发病；（4)精神疾病；（5）糖尿病；（6)严重腹泻或便秘；（7)妊娠及哺乳期；（8）近3个月服用过留体类抗炎药物、抗菌素和微生态制剂；（9）近1周食用过含有益生菌类食物。本研究经沈阳市第六人民医院伦理委员会审核批准，所有受试者均签署知情同意书。2.方法（1）一般资料及实验室检查指标收集：收集所有受试者一般资料（性别、年龄及BMI）及实验室检查指标甘油三
10、酯（T G）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、A LT、A ST、谷氨酰转移酶（GGT）、载脂蛋白（APOA）、载脂蛋白B（A PO B）、血糖、尿酸、尿素、总蛋白、Through the TNFSF8/AMPK/JNK Signaling Pathway J.Cell Mol Neu-robiol,2023,43(5):2179-2202.13Zhang P,Wang AP,Yang HP,et al.Apelin-13 attenuates high glucose-induced calcification of MOVAS cell
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14、3临床内科杂志2 0 2 3年9 月第40 卷第9 期直接胆红素、总胆红素。(2)尿液代谢组学检测：收集所有受试者晨起后第1次尿液的中段尿,在4 下以 4 0 0 0 r/min 离心 10 min,取上清液,于-80冰箱冻存。取样本10 0 l加人对应1.5ml离心管中，根据相应的色谱-质谱检测条件进行检测处理。通过检索实验室自建数据库、整合公共库及metDNA方法得到代谢物鉴定信息。3.统计学处理：应用R程序进行统计分析。多变量统计分析采用正交偏最小二乘法判别（OPLS-DA）分析，单变量统计分析采用students.t-test和差异倍数分析。符合正态分布的计量资料以xs表示，组间比较采
15、用studentst-test检验；不符合正态分布的计量资料以M（P2 5，Pr s）表示，组间比较采用非参数检验。以P0.05为差异有统计学意义。结果1.两组受试者一般资料与实验室检查结果比较：nDM-MAFLD组患者BMI、T G、T C、LD L-C、A LT、A ST、A PO B、血糖、尿酸、尿素水平均高于对照组,HDL-C低于对照组（P0.05)。见表1。2.两组受试者尿液代谢物比较分析：OPLS-DA分析结果显示，两组分离趋势明显。nDM-MAFLD组患者与对照组比较上调331个、下调8 0 个差异显著尿液代谢物。nDM-MAFLD组患者丙酮酸、乳酸、磷脂酰乙醇胺、TG、溶血磷脂
16、胆碱、嘌呤、尿酸水平均高于对照组,磷脂酰胆碱水平低于对照组(P0.05)。见表2。3.两组患者差异代谢物通路富集情况：两组患者差异代谢物KEEG通路富集，包括丙酮酸盐代谢（Pyruvatemetabolism）、糖酵解/糖异生（Glycolysis/Gluconeogenesis）、嘌岭呤代谢（Purinemetabolism）等代谢通路。见图1。讨论经研究证明MAFLD的临床负担不仅限于肝脏相关,越来越多的证据表明MAFLD是一种多系统疾病,是导致肝外慢性并发症的重要负担，长期高血糖或二甲双胍等药物都被报道为其重要的混杂因素，MAFLD患者在病情进展中合并糖尿病，会使糖尿病患者的血糖更难控制
17、,且显著加剧其脂代谢的紊乱,增加2型糖尿病硫代谢两酬酸代谢P值苯丙胺酸代谢叶酸一碳库1.00新生生物素生物合成0.75硝基甲萃降解0.50单杆菌生物合成不同环境中的微生物代谢0.25甲烷代谢0.00细魔色素P450对外源性物质的代谢黑色素生成数字缺氧诱导因子（NIF)-1信号通路2.5乙醛酸及二教酸代谢5.0糖解酵/糖异生7.5膜高血糖素信号通路乙莱降解10.0E-苯丙酸代谢癌症的中心碳代谢苯丙烷类化合物的生物合成00.10.20.30.40.5A甲降解星形孢菌素生物合成硒化合物代谢P值漂岭代谢1.00聚酬糖单元生物合成0.75多环芳烃降解光传导0.50盼嗪生物合成0.25新霉素、卡那莓素和庆
18、大霉素的生物合成不同环境中的微生物代谢0.00黄酮和黄酮醇生物合成数字脂肪酸生物合成二恶英降解1芳香族化合物的降解2咖啡因代谢3不饱和脂肪酸的生物合成4照汁分泌5精氨酸和脯氨酸代谢抗氧化性丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢00.10.20.30.40.5B图1两组患者差异代谢物通路(A：正离子模式下;B：负离子模式下)心血管事件的发生率8-10 。既往研究结果显示,MAFLD合并糖尿病患者包括ALT、A ST、T C、T G、LD L-C 等在内的相关指标会高于未合并糖尿病患者组,HDL-C 低于未合并糖尿病患者组,二者在患病机制上相互影响，且当MAFLD单独发病时,其发病表1两组受试者一般资料与实
19、验室检查结果比较(xs)组别例数 BMI(kg/m)TG(mmol/L)TC(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)ALTU/L,M(Ps,P%)ASTU/L,M(Pg,P)CGTU/L,M(Ps,Ps)对照组1024.00 1.800.97 0.344.86 0.501.84 0.483.15 0.4614.81(11.49,19.48)16.85(15.92,21.64)23.22(15.33,34.06)nDM-MAFLD 组1027.68 2.612.92 0.985.40 1.301.31 0.293.52 1.1522.05(19.66,31.18)20
20、.86(18.29,23.33)29.40(19.25,50.91)值3.5325.9531.2262.9460.9422.2062.2171.416P值0.0030.0010.0010.0090.0590.0410.0440.174APOAAPOB血糖尿酸尿素总蛋白直接胆红素总胆红素组别例数(g/L)(g/L)(mmol/L)mol/L,M(Pas,Prs)mg/dl,M(Pas,Prs)(g/L)(mol/L)umol/L,M(P2s,Prs)对照组101.68 0.270.95 0.114.59 0.39267.32(251.41,342.73)3.83(4.59,4.81)75.76
21、4.694.40 0.7616.71(14.10,18.94)nDM-MAFLD 组101.63 0.321.14 0.265.26 0.54362.00(312.80,413.40)5.12(4.71,5.59)74.39 4.433.89 0.9318.86(16.33,36.18)值0.4262.1593.0882.6804.2540.7641.3451.653P值0.6750.0450.0070.0160.0010.4550.1950.116表2两组受试者尿液代谢物比较分析PC20:1(11Z)/22:4PE16:0/18:3TG(19:0/组别例数尿酸丙酮酸乳酸LysoPC22:4嘌
22、岭(7Z,10Z,13Z,16Z)J(6Z,9Z,12Z)i-17:0/21:0)对照组10990 341.495921.6531976 653.602104 169.615.983.1131 227.673679.451237 128.062nDM-MAFLD组102.085 489.699347.2436682223.066256.029.47216 062.2163.834.462.625.334495 440.463变化倍数2.1060.3783.3812.4582.6853.1233.8642.089P值0.0100.0140.0410.0100.0480.0420.0160.031
23、（本文编辑：高婷）JClinInternN01.40NO.9634临床内科杂志2 0 2 3年9 月第40 卷第9 期往往更为隐匿，难以引起人们的重视，为去除两组比较间的相关复杂影响因素1,提高对MAFLD患者的诊疗效果,本研究选取nDM-MAFLD患者的尿液样本进行非靶向代谢组学检测，探讨其尿液代谢物特征，根据检测结果得出其与对照组患者尿液代谢物方面差异明显。并发现以下关键通路，以期为nDM-MAFLD的发病机制和早期诊断奠定实验基础。在与对照组差异代谢物富集的通路中我们发现丙酮酸代谢通路。丙酮酸是一种三碳化合物，在被细胞利用的情况下参与机体多种代谢反应,是一种重要的代谢中间体，参与TC合成
24、、脂质新生、糖异生及维持三羧酸循环。本研究发现，在nDM-MAFLD患者的尿液代谢物中丙酮酸、乳酸水平显著升高。丙酮酸在细胞浆中被还原成乳酸供能,或进人线粒体内通过丙酮酸脱氢酶（PDH)复合物（PDC)脱羧转化为乙酰辅酶（Ac-CoA）12】,进人三羧酸循环,完成葡萄糖的有氧氧化供能。然而丙酮酸氧化只占肝脏中葡萄糖/丙酮酸代谢的一小部分，绝大多数线粒体丙酮酸通过丙酮酸羧化酶(PC)羧化成草酰乙酸,以柠檬酸的形式从线粒转移到细胞质中合成脂肪酸13，促进脂肪的从头合成途径,从而促进MAFLD的发生发展12 。丙酮酸可通过乙酰辅酶A和三羧酸循环实现体内氨基酸、脂肪和糖的相互转化，在三大营养物质的代谢
25、中起到重要的联系枢纽作用14。但丙酮酸促进脂肪酸从头合成途径的作用机制还未十分明确，其确切的分子机制应该是一个复杂的网络系统，通过影响机体多个位点发挥，待以后行更深层次的研究。磷脂是细胞膜重要组成部分，不仅是细胞的支架和屏障，还与脂质代谢紊乱相关,且在KEEG代谢通路中也被明显富集。本研究发现nDM-MAFLD组患者尿液代谢物中PC20:1(（11Z)/22:4（7 Z,10 Z,13Z,16 Z)】水平显著降低，LysoPC22:4、PE16:0/18:3(6Z,9Z,12Z)等水平均显著升高。PC类代谢物被视为是最具有生物学活性的磷脂,与多种生物学过程密切相关,参与血脂调节15。PC可在卵
26、磷脂-胆固醇酰基转移酶(LCAT)的作用下产生LysoPC。此外,磷脂酶A2(PLA2）也可以水解PC,产生LysoPCl10。研究表明LysoPC类代谢物是氧化低密度脂蛋白的主要组成成分17 ,促进MAFLD的发生发展。经研究证实LysoPC类代谢物与糖尿病、动脉粥样硬化、血脂异常等代谢性疾病和心血管疾病的发生发展密切相关18 。由此我们可得出磷脂代谢途径在nDM-MAFLD的发生与发展中扮演重要角色nDM-MAFLD组嘌呤和尿酸的水平显著升高,且与对照组差异代谢物富集的通路中包括呤代谢。研究发现尿酸是体内嘌呤核苷酸代谢的终产物。尿酸的来源主要有饮食摄人及体内分解的嘌呤化合物，在肝脏中生成,
27、约7 0%经肾脏排出，余下由胃肠道途径排出19 ,维持体内血清尿酸水平的平衡。Liu等2 0 的研究表明肝脏脂肪含量与血尿酸升高有关,高水平的尿酸是导致包括MAFLD在内的多种慢性疾病的独立危险因素；同时，该研究观察到尿酸增加与代谢综合征（MetS）/M A FLD 的发病率之间存在线性因果关系,由此得出血清尿酸水平可能是筛选代谢综合征/肝脏代谢异常的个体化预测因子,降低血清尿酸水平可能是减少肝损害的一种潜在方案。既往基础研究结果表明尿酸可诱导肝细胞中转录因子固醇调节元件结合蛋白1C的表达从而促进脂类合成的增加；尿酸可激活肝细胞内的免疫受体,在脂肪组织内作为细胞内氧化剂,诱导慢性炎症反应的发生
28、发展；进一步得出血清尿酸具有诱导氧化应激反应、干扰胰岛素信号通路等作用2 1。由此我们可得出嘌呤代谢途径与nDM-MAFLD的发生与发展有关。本研究仍有部分局限，具体表现为样本量较少，故本研究仅作为探索性研究；但经查阅国内外相关文献可知，部分相关研究所属样本数与本研究相似2-2 3,证实本研究的可行性。综上,nDM-MAFLD患者机体存在丙酮酸代谢紊乱、磷脂代谢紊乱及嘌呤代谢紊乱，可通过对以上代谢方向进一步研究，以期为nDM-MAFLD患者提供更佳的临床治疗方案。参考文献1中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组，中国医师协会脂肪性肝病专家委员会.非酒精性脂肪性肝病防治指南（2 0 18 年
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