1、202311期 总第404期ASFV感染以肺水肿、发烧、皮肤发绀、网状内皮系统出血为主要特征，死亡率高达100%，严重危害养猪业，世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定上报动物疫病之一，是我国一类动物疫病1。非洲猪瘟的传播史已逾一个世纪，1921年非洲东部肯尼亚最早报道ASF，20世纪50年代传入欧洲、葡萄牙、西班牙等国，开始了在西欧的流行2。20世纪70年代传入巴西等欧美地区，2007年ASFV叩响了亚洲的大门，俄罗斯、格鲁吉亚相继暴发疫情。我国于2018年8月在沈阳首次报道ASFV，截至2022年7月，我国已累计报道192起，扑杀生猪共计120多万头，目前没有再出现区域性暴发流行。疫情暴发
2、初期，我国生猪养殖存栏量急剧下降，猪肉曾一度供不应求，从而导致生猪和猪肉产品价格上涨幅度过大4。尽管全世界对ASFV疫苗研究已有几十年，但还没有一个疫苗批准上市，因此，了解ASFV主要保护性抗原结构及其疫苗的研究进展，对于防控ASF疫情具有十分重要的意义。1非洲猪瘟病毒的病原学特征1.1结构特点ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，也是目前已知的唯一虫媒大型DNA囊膜病毒。病毒粒子呈正二十面体对称结构，直径约200 nm，长度为170190 kb，有160175个开放阅读框（ORFs），可编码150200 种蛋白质，包括多种结构蛋白及参与 DNA复制、修复、转录的酶和因子等，其表达
3、受时间非洲猪瘟病原学特征及其疫苗的研究进展刘小琬1，许辉1，王寒1，岳双明1，周远成2，3*（1.四川水利职业技术学院，四川 成都 611200；2.四川省畜牧科学研究院畜禽生物制品四川省重点实验室，四川 成都 610066，3.畜科生物工程有限公司四川省动物生物制品工程技术研究中心，四川 成都 610200）中图分类号：S852.651文献标识码：A文章编号：1001-8964（2023）11-0028-05收稿日期：2023-04-30作者简介：刘小琬（1990-），女，四川成都人，硕士，执业兽医师，研究方向：动物微生物学、动物传染病及病理学。E-mail：*通信作者：周远成（1984-）
4、，男，博士，副研究员，研究方向：预防兽医学。E-mail：摘要：非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起家猪或野猪感染的一种高度致死性、急性、出血性传染病。2018年8月，中国首次报道非洲猪瘟疫情，对我国养猪业的危害极其严重。本文以ASFV为研究对象，分别从病毒的结构特点、主要病毒蛋白、传播途径、致病机理等方面归纳总结了ASFV的病原学特点，分析讨论了ASF灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗的研究现状，提出目前我国ASF疫苗研发所面临的各种挑战，为疫苗的研发提供新的认识和途径，为科学防控非洲猪瘟提供参考。关键词：非洲猪瘟；病毒；侵染；疫苗综述28202311期 总第404期调控。1.2
5、ASFV的病毒蛋白ASFV的开放阅读框可编码病毒不同抗原表位，其中结构蛋白有pp220、p30、p54、p72、A104R和CD2v等，非结构蛋白有F334L、K196R 和 NP419L，未 知 功 能 蛋 白 有B602L、C44L、Cp312R和K205R。其中p54、K205R、A104R 和 B602L 这 4 种蛋白产生的抗体具有更强、更持久的抗体滴度。ASFV可在主动脉内皮细胞及巨噬细胞中复制，通过胞吞作用进入细胞，前期有试验研究表明，p30、p54、pp62、p72及CD2v蛋白有助于病毒的快速吸附和入侵。p30 蛋 白 是 ASFV 重 要 的 结 构 蛋 白，由CP204L
6、 基因所编码，相对分子量为 30 ku，是ASFV早期表达的内膜蛋白，在感染早期可检测到表达，并持续存在于整个感染周期。因其有较强的抗原性和免疫原性，可刺激机体产生特异性抗体，常用于血清学诊断。周改静等4利用原核表达p30蛋白建立了阻断ELISA检测方法，对208份血清样品进行检测，结果与Ingenasa公司试剂盒检测的结果一致。p54蛋白是由E183L编码的ASFV的另一个结构蛋白，分子量约为25 ku，在其N端附近有一个潜在的跨膜区域和Gly-Gly-X氨基酸序列，对病毒形态的形成非常重要，对包膜前体聚集及病毒粒子组装转运有很重要的作用。p54蛋白诱导产生的抗体能够抑制ASFV附着到易感细
7、胞中，感染后最早一个星期就能检测，并能在血液中持续数周，也常被应用于ASFV的血清学诊断中。p72蛋白是病毒二十面体衣壳的主要成分，由B646L基因编码，分子量大小约为73.2kDa，抗原性及免疫原性强而稳定，产生的抗体可阻断ASFV与巨噬细胞的结合。在病毒感染末期能检测到p72蛋白表达，它与病毒的吸附、入侵有关，p72的表达是病毒复制的标志，广泛应用于病毒检测方法的建立。周远成等5利用真核表达载体及辅助蛋白B602L基因协同表达p72蛋白，重组腺病毒感染细胞后可以同步表达非洲猪瘟p72、B602L蛋白，将该重组腺病毒接种实验动物，可刺激实验动物产生特异性抗体，为今后建立特异性强、稳定性好和结
8、合能力高的ASFV血清学诊断方法奠定了良好的基础。CD2v蛋白是由EP402R基因编码，具有跨膜结构的糖蛋白，类似于T淋巴细胞表面的黏附受体CD2，是唯一已知的细胞CD2的同源物，主要参与细胞间的黏附、毒性增强以及免疫应答调节过程，与ASFV的组织趋向性、免疫逃避机制等密切相关，在ASFV感染的发病机制中可能有一定的作用，属于晚期表达蛋白。CD2v蛋白可破坏淋巴细胞功能，影响机体对病毒感染后的清除，并阻碍机体产生免疫保护作用。1.3传播途径ASF在一个世纪前就已出现，在全球经济一体化的趋势下，已导致全球60多个国家流行。ASFV是一类可经虫媒传播的病毒，在软蜱中可存活数月至数年，带毒的软蜱通过
9、叮咬家猪使病毒得以扩散，可感染家猪和野猪。发病动物的分泌物、排泄物、组织及被污染的饲料、饮水、泔水、车辆等也可传播病毒，可经由呼吸道、消化道、肌肉等多种途径感染猪群。我国ASF的暴发，主要是由于生猪调运频繁、散养户过多、基层生物防控意识薄弱及感染猪只副产品的大范围运输导致的。1.4临床表现ASFV感染猪只后会在淋巴结中大量繁殖，扩散后形成病毒血症，并在肺脏、肾脏、肠道等器官中进一步复制，从而引起严重的病理损伤，导致血管通透性增加，引起脏器严重出血。尤其是高毒力株感染后，最急性ASF的症状表现为病猪发热，成堆拥挤在一起，往往无明显症状就突然倒地死亡；急性ASF的临床症状表现为高热稽留，共济失调，
10、四肢发绀，多脏器出血，充血性脾肿大，肺脏水肿，淋巴细胞减少症和血小板减少症等6。低毒力株一般病死率低，临床症状不明显，呈持续性感染，表现为妊娠母猪流产，逐渐消瘦、跛行，关节肿大和皮肤溃疡等，并会长期排毒7。1.5致病机制ASFV主要侵袭宿主的单核-巨噬细胞，感染过程非常复杂，影响因素众多，还依赖多个细胞因子8。前期研究证实，ASFV进入细胞的内吞途径主要由网格蛋白介导和发动蛋白介导。除此之外，ASFV也能通过大胞饮的方式进入细胞，这主要是依赖细胞膜局部的不稳定性来实现9。ASFV进入细胞后，ASFV颗粒从早期的内吞体移动到晚期的内吞体，并依赖内吞体内综述29202311期 总第404期的酸性环
11、境完成脱壳。ASFV感染会导致细胞内胆固醇向“病毒工厂”富集，这可能对ASFV的膜融合和病毒复制起到至关重要的作用。ASFV病毒粒子的组装涉及依赖微管的波形蛋白的重排，病毒粒子成熟后，依靠微管蛋白转运到细胞膜，并通过出芽方式从细胞中释放10。2非洲猪瘟疫苗的研究进展ASF流行100多年，目前还没有一种成熟的疫苗可以防控，因该病毒具有强大而复杂的免疫逃逸机制，主要保护性抗原尚未完全明确，病毒基因型多且易变异，所以关于ASF疫苗使用的争议从未间断，尤其是在疫苗研发评估、临床应用方面需谨慎。即便道路坎坷，学者们仍在为ASFV疫苗的研制不断努力，并取得一定的成效，目前主要研究的是灭活疫苗、减毒活疫苗、
12、亚单位疫苗。2.1灭活疫苗灭活疫苗是目前技术已经很成熟的一种传统疫苗研制方法，通过细胞培养出大量的病毒，经过一系列化学或物理方式使病毒丧失致病性，同时保持病毒抗原颗粒的完整性，从而刺激机体产生保护性抗体。关于ASFV灭活疫苗的最新研究是在2014年进行的，用新型现代佐剂对其进行了安全性测试，但是这些方法并没有让接种猪群得到有效保护。Estefania等11在低温下用低浓度的二乙烯亚胺（BEI）灭活病毒，联合新的强效佐剂，通过皮内、肌内同时双重接种，4周后用相同剂量和注射方式进行增强免疫，接种6周后肌肉注射强毒株攻毒，结果所有动物均有ASF的临床症状和病理表现，说明采用灭活疫苗没有对ASFV攻击
13、产生有效保护。ASF灭活疫苗采用了各种新型的保护佐剂，迄今为止研究结果显示ASF灭活疫苗无法提供有效保护，可能是由于病毒表面蛋白差异性很大，不是所有的抗原在失活后还保留完整结构，因此影响了免疫效果，也表明细胞免疫在预防ASFV中的重要性。而要产生细胞反应，宿主细胞中必然有大量的病毒复制，这为减毒活疫苗的有效性提供了理论基础。2.2减毒活疫苗2.2.1传统减毒活疫苗减毒活疫苗毒性明显减少，既保持了原有的抗原性，又诱导体内产生强烈持久的免疫应答，但因其存在毒力返强及病毒变异的问题，极大地限制了该类疫苗的应用。葡萄牙在1962年启动了非洲猪瘟弱毒疫苗田间试验，结果出现母猪流产、皮肤坏死、关节炎、肺部
14、损伤等慢性感染现象12-13。利用从软蜱或者慢性感染猪只体内分离到的天然弱毒株（OURT88/3和NH/P68）而制备的减毒活疫苗（LAV），在接种猪只后可以对同源毒株产生很好的免疫保护，不同的免疫途径、接种剂量、攻毒株会产生不同的保护率14。通过非敏感细胞Vero细胞连续传110代致弱的LAV，在免疫猪群后，其体内复制能力降低，毒力逐步丧失，毒力基因的表达能力明显下降，不能抵抗亲本毒株的攻击，也就不能提供有效的保护。2.2.2基因工程减毒活疫苗ASF减毒活疫苗具有毒株特异性，传统天然弱毒及人工培养弱化制备的LAV，其免疫效果差异巨大，包括残余毒力、病毒血症和亚临床症状等，因此越来越多的学者开
15、始研究基因缺失弱毒苗，认为其安全性及可靠性更高。张艳艳等15以 SY18 为亲本株构建了ASFV MGF和CD2v基因缺失疫苗候选株，并对其安全性和免疫保护效果进行了特性研究，结果显示，该双基因缺失株能够抵抗亲本强毒株SY18株的攻击。Elisabeth等16用 Ba71 ASFV毒株基因缺失苗（缺失CD2基因）免疫猪只，能激活免疫系统并产生较强的抗体水平，有效抵抗亲本毒株Ba71和异源 E75毒株（两种基因型株）的致命攻击。这些结果为将来研发ASFV交叉保护疫苗开辟了新途径，表明基于CD2v的减毒活疫苗具有较大的开发前景，这对于在病毒流行和多种毒株传播地区的ASFV防控至关重要。目前ASFV
16、重组致弱活疫苗主要集中于敲除TK、9GL、UK、EP402R、NL、MCF 360/55基因，可以让病毒毒力减弱且兼具较好的免疫原性。备受关注的哈兽研的非洲猪瘟 7 基因缺失减毒活疫苗（ASFV-7GD）已开展相关临床试验，若能通过安全性和免疫原性检测，同时找到稳定的生产细胞系，有可能成为首个商品化ASF疫苗。2.3亚单位疫苗传统亚单位疫苗是将可控蛋白质分解或水解后纯化，进而筛选出具有免疫活综述30202311期 总第404期性的小分子片段制备成疫苗。因没有病毒核酸，克服了传统减毒活疫苗灭活不完全、毒力返强等问题，安全性更好，但保护效力相对较弱。利用杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、新城疫病毒、伪狂
17、犬病毒作为病毒载体，能刺激细胞免疫，提供更优秀的免疫保护效率，布局该技术路径的包括普莱柯生物股份、中牧股份等企业。ASFV的CD2v不是强免疫原性抗原，因此需接种较大剂量的蛋白质才能诱导产生较高的抗体水平。用杆状病毒表达的p54/p30融合蛋白免疫猪群，可以产生一定量的中和抗体，并在攻毒后改善病程，减少病毒血症的发生，同时保护猪只免受E75 的致命攻击。利用杆状病毒来表达的CD2v/p54/p30 蛋白，在免疫猪群后能产生中和抗体抵抗强毒株的攻击，但会出现不同程度的病毒血症。ASFV基因组结构庞大复杂，编码蛋白多且容易发生变异，是影响疫苗研发和免疫效果的重要因素之一。p72蛋白在体外单独表达时
18、容易出现错误折叠，用辅助蛋白 B602L 共表达时可得到正确折叠构象的p72蛋白17。将表达ASFV B646L、EP153R、EP402R的抗原重组痘苗病毒免疫猪只后，能够诱导IFN-分泌和T淋巴细胞增殖分化，但不能诱导机体体液免疫应答18。3展望伴随经济全球化发展，跨地域的人员和贸易流通加快，养殖密度不断提高，养殖模式越来越多样化等，给ASF的防控带来更加严峻的挑战，而ASF疫苗的研究历来是一个世界性难题，尽管各国科学家们进行了各种不同的尝试，但由于其基因组结构复杂，免疫逃避机制尚未研究透彻，至今仍无商业化的疫苗上市，给世界养猪业带来了严重的损失和威胁。随着生物学技术的不断发展，以及对AS
19、FV发病机制、免疫逃逸机制等的深入研究，相信在不久的将来，安全、可控的ASF疫苗定会成功问世。参考文献：1 冯全文，范志新，田昊伦，等.非洲猪瘟疫苗研发中面临的问题和难点分析 J.中国兽医学报，2020，40（11）：2262-2269.2 张永强，吴晓东，王志亮.非洲猪瘟的流行历史与现状 J.中国动物检疫，2015，32（9）：11-15.3Tao Dapeng，Sun Daipeng，Wei Shu，et al.Oneyear of African swine fever outbreak in China J.Acta Tropica，2020，211：105602.4 周改静，罗俊聪，
20、石正旺，等.非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA抗体检测方法的建立 J.畜牧兽医学报，2022，53（12）：9.5 周远成，邝声耀，阴文奇.表达非洲猪瘟病毒p72，B602L蛋白的重组腺病毒载体，重组腺病毒及构建方法：中国，CN111549040A P.2020-08-18.6 Zakaryan H，Karalova E，Voskanyan H，et al.Evaluationofhemostaseologicalstatusofpigsexperimentally infected with African swine fevervirus J.Veterinary Mi
21、crobiology，2014，174（1/2）：223-228.7 Snchez-Cordn P J，Montoya M，Reis A L，et al.African swine fever：A re-emerging viral diseasethreateningtheglobalpigindustry J.TheVeterinary Journal，2018，233（3）：41-48.8 Hernez Bruno，Guerra Milagros，Salas Mara L，et al.African swine fever virus undergoes outerenvelope di
22、sruption，capsid disassembly and innerenvelopefusionbeforecorereleasefrommultivesicularendosomesJ.PLoSPathogens，2016，12（4）：e1005595.9 牟豪，赵光夫，余远迪，等.非洲猪瘟病毒的侵染机制及疫苗研究进展 J.中国兽医学报，2021，41（7）：1414-1418.10雷程红，刘存，崔尚金.非洲猪瘟病毒流行病学和致病机制研究及防控对策 J.猪业科学，2018，35（9）：100-102.11 Estefana C F，Jose M S V，Aleksandra K，et
23、al.HighdosesofinactivatedAfricanswinefevervirus are safe，but do not confer protection againsta virulent challenge J.Vaccines，2021，9（3）：242.12 Argilaguet J M，Prez-Martn E，Gallardo C，et al.Enhancing DNA immunization by targeting ASFVantigens to SLA-bearing cellsJ.Vaccine，2011，29（33）：5379-5385.13戈胜强，韩乃
24、君，吕艳，等.葡萄牙使用非洲猪瘟弱毒疫苗的历史案例分析 J.中国动物检疫，2021，38（8）：57-62.（下转第33页）综述31202311期 总第404期各组不同光照制度对1826周蛋鸡产蛋率的影响结果见表2。各组周末产蛋率统计表周龄1920212223242526标准产蛋率/%15.040.060.175.285.390.592.693.21#舍周末产蛋率/%46.981.492.095.097.097.396.696.82#舍周末产蛋率/%20.760.287.092.095.596.596.996.93#舍周末产蛋率/%25.366.382.088.093.495.896.196.
25、3表2就产蛋率达90%以上的时间而言，第1组比第2组早8d，比第3组早2d，三组时间分别为21周龄、22周龄、23周龄。2.2累计产蛋枚数就累计产蛋枚数而言，第1组比第 2 组多 6.2 枚/羽，比第 3 组多 3.2 枚/羽（表3）。各组累计产蛋枚数统计表周龄181920212223242526均只累计产蛋枚数1#舍累计产蛋3121312705326755834447037163038032938720138812038777047.12#舍累计产蛋49855401016896024145032697535147036323537038537220540.93#舍累计产蛋1711787920
26、18552831584035508036474237447037820037802343.9表33讨论科学合理的光照制度对蛋鸡的产蛋率影响至深。光照延长频次、时长等均会对鸡群产生不同的刺激反应。同等光照强度下，不同的光照制度对产蛋率和累计产蛋数的提升具有不同影响。3.1光照对蛋鸡的作用机理蛋鸡各个饲养阶段均受光照的影响：育雏期促进生长发育，育成期影响性成熟，产蛋期调节性激素的分泌。光照时间的长短和强度的高低，对鸡群的生长发育有很大影响，过长或过强的光照均可引起蛋鸡早产早衰。3.2光照制度光照制度是指蛋鸡饲养过程中各个不同阶段对光照时间和光照强度的规定。不同品种对光照敏感度均有差异，主要体现在光
27、照强度：光照强度过高，引起啄癖、脱肛；突然增强，可使鸡群产破壳蛋、软壳蛋、大蛋、双黄蛋、小蛋等畸形蛋的几率增加，增加鸡的猝死率；光照过弱，会降低采食及饮水，降低蛋鸡的生产性能。4结论4.1首次加光时长首次加光至关重要，必须引起鸡群强烈的刺激才能达到效果。强烈的刺激需要在改变光照强度的前提下，延长光照的时间，产生足够的刺激，在育成期光照基础上首次加光2h最佳。4.2光照频次频次过少，鸡群易出现产蛋疲劳，75%以上增速快，75%以后增速放缓；频次过多，鸡群对光照延长不敏感，由刺激转化为适应，对产蛋率增长的影响微乎其微。通过本次试验数据，以育成期光照为基础，分6次加光最佳。参考文献：1 Saif Y
28、 M.禽病学 M.苏敬良，高福，索勋，译.12版.北京：中国农业出版社，2012.试验研究14 Krug P W，Holinka L G，ODonnell V，et al.The progressive adaptation of a Georgian isolateof African swine fever virus to vero cells leadstoagradualattenuationofvirulenceinswinecorresponding to major modifications of the viralgenome J.Journal of Virology，2
29、015，89（4）：2324-2332.15张艳艳，陈腾，张静远，等.非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗株的构建和免疫保护特性 J.中国兽医学报，2019，39（8）：7.16 Elisabeth L，Laia B C，Elizabeth R M,et al.DeletionmutantsoftheattenuatedrecombinantASF virus，BA71CD2，show decreased vaccineefficacy J.Viruses，2021，13（9）：1678.17吴慧如，梁晓磊，邵洋洋，等.非洲猪瘟疫苗研究进展 J.畜牧与兽医，2021，53（9）：130-134.18张新，王秋霞，李文霞，等.基于病毒载体的非洲猪瘟疫苗研究进展及展望 J.中国预防兽医学报，2022，44（8）：903-909.（上接第31页）枚33
