1、基金项目:广州市市场监督管理局科技项目(编号:k j );广州检 验 检 测 认 证 集 团 有 限 公 司 科 技 项 目(编 号:k j G Z)作者简介:林晓君(),女,广州检验检测认证集团有限公司助理工程师.E m a i l:q q c o m收稿日期:改回日期:D O I:/j s p j x 文章编号 ()分散固相萃取超高效液相色谱四极杆/飞行时间质谱法测定禽肉中松香酸类物质D e t e r m i n a t i o no f a b i e t i ca c i dc o m p o u n d s i np o u l t r yb yu l t r ap e r f o
2、 r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y q u a d r u p o l e t i m e o f f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r yc o u p l e dw i t hd i s p e r s i v es o l i dp h a s ee x t r a c t i o n林晓君L I N X i a o j u n严婉盈Y AN W a n y i n g何敏恒HE M i n h e n g黄嘉乐HU ANGJ i a l e伍依琪WUY i q i叶玲Y EL i
3、 n g张瑞瑞ZHANGR u i r u i(广州检验检测认证集团有限公司国家加工食品质量监督检验中心 广东,广东 广州 )(G u a n g z h o uI n s p e c t i o na n dT e s t i n gC e r t i f i c a t i o nG r o u pC o,L t d,N a t i o n a lQ u a l i t yT e s t i n gC e n t e rf o rP r o c e s s e dF o o dG u a n g d o n g,G u a n g z h o u,G u a n g d o n g ,C
4、h i n a)摘要:目的:建立超高效液相色谱四极杆/飞行时间质谱法(U P L C Q TO F/M S)测定禽肉中松香酸类物质.方法:样品使用乙腈提取,盐析分层后,上清液由C 固相萃取剂净化,U P L C Q TO F/M S电喷雾负离子模式测定.结果:种松香酸类物质在 g/L质量浓度范围内线性关系良好,相关 系数R ,平 均回 收 率为 ,相对标准偏差(R S D s)为 (n);方法检 出 限(L O D s)为 g/k g,方法 定 量限(L OQ s)为 g/k g.结论:试验方法操作简便,快捷,回收率和灵敏度高,精密度好,能够满足禽肉中种松香酸类物质的检测需求.关键词:分散固相
5、萃取;超高效液相色谱四极杆/飞行时间质谱;禽肉;松香酸A b s t r a c t:O b j e c t i v e:A nu l t r ap e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y q u a d r u p o l e/t i m e o f f l i g h tm a s s s p e c t r o m e t r y(U P L C Q T O F/M S)m e t h o dw a s e s t a b l i s h e d f o r t h ed e t e r m i n a t i
6、o no fa b i e t i ca c i d s i np o u l t r y M e t h o d s:T h es a m p l e sw e r ee x t r a c t e dw i t ha c e t o n i t r i l e,t h e ns a l t e do u ta n ds t r a t i f i e d T h es u p e r n a t a n tw a sp u r i f i e db yC s o l i dp h a s ee x t r a c t a n ta n df i n a l l yd e t e r m i
7、 n e db yU P L C Q T O F/M Si nE S In e g a t i v em o d e R e s u l t s:A b i e t i c a c i d c o m p o u n d s e x h i b i t e d a g o o d l i n e a rr e l a t i o n s h i pi nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f g/L w i t hg o o dc o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tR T h ea v e r a g
8、e r e c o v e r i e so ft h r e ea b i e t i ca c i dc o m p o u n d s w e r ee x p e r i m e n t s,t h ea v e r a g er e c o v e r yr a t e w a s w i t h r e l a t i v e s t a n d a r dd e v i a t i o n s(R S D s,n)o f ,a t t h es p i k e dl e v e lo f,g/k g T h el i m i t so fd e t e c t i o n(L O
9、 D s)w e r e g/k ga n dt h em e t h o dl i m i t so fq u a n t i f i c a t i o n(L OQ s)w e r e g/k g C o n c l u s i o n:T h i sm e t h o d w a sc o n v e n i e n to p e r a t i o n,r a p i d,h i g hr e c o v e r ya n ds e n s i t i v i t ya n dg o o dp r e c i s i o nt h a t c o u l dm e e tt h ed
10、 e t e r m i n a t i o nr e q u i r e m e n t so ft h r e ea b i e t i ca c i d si np o u l t r y K e y w o r d s:d i s p e r s i v e s o l i dp h a s e e x t r a c t i o n;U P L C Q T O F/M S;p o u l t r y;a b i e t i ca c i d松香是一种天然树脂,由松树的含油树脂加工制得,通过进一步分离纯化可以得到松香酸类化合物,主要为松香酸、脱氢松香酸和海松酸,被应用于药品、包装材料、
11、油墨和涂料等工业领域.同时,松香酸也可以被应用于皮肤病治疗中,对治疗不同类型的银屑病有一定的成效.松香还具有较好的黏附性,可用于畜禽脱毛,但畜禽表皮和肌肉中可能残留.有研究显示,松香酸能抑制水蚤和虹鳟鱼等生物的生长发育,对人体肺泡细胞、上皮细胞、成纤维细胞、红细胞和多核白细胞具有毒性作用.G B 规定,松香酸甘油酯可作为添加剂使用,但松香不允许使用,因此建立对松香酸类物质的F OO D&MA CH I N E R Y第 卷第 期 总第 期|年 月|相关检测方法,对保障消费者的健康安全尤其重要.目前,有关禽肉中违法添加物的检测方法主要集中于液相色谱法、气相色谱法、液相色谱串联质谱法 、气相色谱质
12、谱法 和酶联免疫法 等.其中色谱法选择性低,检出限高,对于基质复杂的样品,分离难度大,容易影响分析结果;酶联免疫法灵敏度高、且有较强的特异性 ,但操作过程繁琐,对于多组分化合物的检测存在一定的局限性;质谱法具有高通量、选择性高、灵敏度高的特点.研究拟以分散固相萃取技术为基础,建立高分辨四极杆/飞行时间质谱法测定禽肉中的松香酸类物质,利用基质曲线校正结果,准确定性定量,以期为 禽 肉 中 违 法 添 加 物 的 分 析 筛 查 技 术 研 究 提 供依据.材料与方法材料与试剂禽肉:市售;松香酸、脱氢松香酸、海松酸标准品:纯度,上海安谱实验科技股份有限公司;氨水、甲 酸 铵、甲 酸、乙 腈、乙 酸
13、 乙 酯、甲 醇:HP L C级,美国赛默飞公司;十八烷基键合硅胶(C)、N丙基乙二胺(P S A)、石墨化碳黑(G C B)、氨丙基键合硅胶(NH)固相萃取剂、中性氧化铝(C NW)、氯化钠、无水硫酸镁:分析纯,上海安谱实验科技股份有限公司.仪器与设备高分辨质量飞行时间质谱仪:A P I 型,美国A BS C I E X公司;液相色谱系统:L C A D型,日本岛津公司;超纯水系统:M i l l i QA d v a n t a g eA 型,法国默克密理博公司;高速离心机:k 型,德国西格玛公司;多管漩涡振荡器:M u l t iR e a x型,德国海道夫公司;色 谱 柱:X b r
14、i d g eB EH C(mm mm,m),沃特世科技(上海)有限公司.试验方法标准溶液的配制准确称取松香酸、脱氢松香酸和海松酸标准品,用乙腈溶解并定容,单标储备液质量浓度为 m g/L,混合标准液质量浓度为 m g/L.用空白基质液稀释成各级质量浓度为,g/L的标准曲线.前处理条件优化称取g搅碎后的样品,分别加入 m L水和 m L乙腈,涡旋振荡 s,分别加入无水硫酸镁g和氯化钠g,涡旋震荡 m i n,于高速离心机中以 r/m i n的速度离心 m i n.移取m L上层乙腈相于m L离心管中,分别加入 m gC 固相萃取剂,涡旋振摇m i n,再以 r/m i n速度离心m i n,取
15、上清液过 m有机滤膜,待测.检测条件()色谱条件:流动相A相为乙腈,B相为氨水,流速m L/m i n;进样体积 L;柱温 ;梯度洗脱程序:m i n,A;m i n,A;m i n,A;m i n,A;m i n,A.()质谱条件:采用电喷雾电离(电离源)和大气压化学电离(校正源)复合源测定,负离子模式;一级(T O F)扫描质量 范 围 D a;二 级 扫 描 质 量 范 围 D a;校正液流速m L/m i n;气帘气 k P a;雾化气 k P a;加热 辅 助气 k P a;脱溶 剂 气温 度 ;离子源喷射电压 V;去簇电压 V;碰撞能量()e V;T O F I D A M S监测
16、模式;每 个样品进行一次自动校正,以确保系统在批内的精准质量数稳定.基质效应对试验所选样品进行批量测定,选择空白样品,处理后制得基质液,分别用空白基质液和乙腈配制等浓度标准溶液,以丰度比例为评判依据,考察基质效应.加标回收试验通过低浓度加标,以 倍信噪比为基准,测得方法的定量限.向阴性样品中加入混合标准溶液,使样品质量分数为定量限的,倍,做组平行试验,进行测定后,统计结果,计算回收率和相对标准偏差.结果与讨论色谱条件优化负模式条件下,流动相使用乙腈氨水、乙腈水、乙腈mm o l/L甲酸铵和乙腈甲酸种不同的体系,考察松香酸、脱氢松香酸和海松酸种化合物的母离子丰度.结果发现,乙腈氨水作为流动相时,
17、种化合物的母离子丰度最高,是其他种流动相的倍以上,这是由于海松酸、松香酸和脱氢松香酸均含有羧基结构,因此在离子化过程中,容易失去质子,形成稳定的MH负离子.负模式下乙腈氨水体系所得的丰度仍为正模式下的倍左右.因此,最终选择乙腈氨水体系为流动相,负模式条件下测定,通过调节梯度洗脱程序,使同分异构体松香酸和海松酸达到基线分离(见图).质谱条件及参数E S I负模式下,扫描海松酸、松香酸和脱氢松香酸的一级 母 离 子 M H,获 得m/z 和m/z (松香酸、海松酸互为同分异构体).调节去簇电压(D P)和碰撞电压(C E)优化母离子及二级碎片离子安全与检测S A F E T Y&I N S P E
18、 C T I ON总第 期|年 月|图种目标物的提取离子流色谱图F i g u r eE x t r a c t i o n i o nc h r o m a t o g r a mo f t h r e ec o m p o u n d s的丰度以达到最佳.由于离子的精确质量分数即可用于定性,因此使用母离子定性定量,丰度较高的二级碎片辅助参考定性.具体质谱参数见表.表脱氢松香酸、松香酸和海松酸的质谱参数T a b l eM a s s s p e c t r o m e t r yp a r a m e t e r so fd e h y d r o a b i e t i ca c i d
19、,a b i e t i c a c i da n dp i m a r i c a c i d化合物母离子理论值(m/z)母离子实测值(m/z)主要二级碎片(m/z)误差()脱氢松香酸 松香酸 海松酸 提取溶剂的选择试验初期对比了甲醇、乙腈和乙酸乙酯的提取效果,以 g/L的加标水平的回收率为判定依据.由图可知,甲醇对脱氢松香酸、松香酸和海松酸种化合物的提取率较低,只有 左右,可能是由于甲醇与水混溶后,在加入盐的情况下未析出,导致提取液杂质较多,且基质效应严重,而乙酸乙酯回收率与甲醇的相当,可能是由于乙酸乙酯极性较低,目标化合物具有羧基结构,可与水形成氢键,因此与乙酸乙酯具有一定的极性差异,导
20、致提取不充分.乙腈对种化合物均有较好的回收率,提取分层后,杂质也较少,因此最终选择乙腈为提取溶剂.固相萃取剂的选择为了选择合适的固相萃取剂进行净化,选择 m g的C、G C B、NH、P S A和中性氧化铝种不同类型的固相萃取剂进行对比,探究其对脱氢松香酸、松香酸和海松酸种化合物回收率的影响.由图可知,由于目标物含有羧基极性基团,NH、P S A中的N能对极性基团产图不同溶剂的回收率结果F i g u r eR e c o v e r yr e s u l t s f o rd i f f e r e n t s o l v e n t s(n)图不同固相萃取剂的回收率结果F i g u r
21、eR e c o v e r yr e s u l t s f o rd i f f e r e n t s o l i dp h a s ee x t r a c t a n t s(n)生较强的吸附,而中性氧化铝则具有较高的活性,对极性基团也有较强的吸附,回收率均低于,因此不能使用此种固相萃取剂进行净化.而G C B的回收率可以达到 以上,C 的能达到 以上,由于G C B对含有平面结构的化合物也有一定的吸附,因此回收率仍不够理想,C 为烷基结构,与目标物之间的极性作用力不强,因此吸附也较少.最终选择C 为固相萃取剂.提取时间的选择对比,m i n下不同提取时间对目标物回收率的影响.一般在
22、目标物受热不分解的情况下,提取时间越长,回收率越高,当提取时间为 m i n时,脱氢松香酸、松香酸和海松酸的回收率均在 以上.当涡旋时间 m i n时,回收率的上升趋势减小,为了节省时间,提高效率,选择 m i n为最适提取时间.基质效应由于禽肉搅碎后,组织中大量的蛋白质、脂肪、氨基酸等杂质会被释放,可能会产生严重的基质效应.分别使用鸡、鸭、鹅种空白基质液和乙腈,配制 g/L脱氢松香酸、松香酸和海松酸的混合标准溶液,通过仪器测定丰度,计算出基质标准丰度值与纯溶剂标准的丰度值比值,以评判基质效应.由表可知,不同基质中,脱氢|V o l ,N o 林晓君等:分散固相萃取超高效液相色谱四极杆/飞行时
23、间质谱法测定禽肉中松香酸类物质表基质效应试验结果T a b l eR e s u l t s f o rm a t r i xe f f e c t e x p e r i m e n t化合物鸡鸭鹅脱氢松香酸 松香酸 海松酸 松香酸、松香酸和海松酸的丰度均为抑制,且抑制程度小于纯溶剂标准的,说明基质负效应明显,因此使用基质曲线进行定量计算.线性参数及方法灵敏度使用不同禽类的空白基质液配制混合标准曲线,用仪器测得丰度.以质量浓度为横坐标,母离子丰度为纵坐标进行方程拟合,曲线方程及拟合的相关系数见表.由表可知,曲线方程的相关系数较大,说明方程线性良好,通过信噪比的,倍,测得方法检出限和定量限分别
24、为,g/k g.方法的定量能力和灵敏度可满足一般样品的测定要求.表基质曲线方程及灵敏度数据T a b l eM a t r i xc u r v ee q u a t i o na n ds e n s i t i v i t yd a t a化合物基质曲线方程R检出限/(gk g)定量限/(gk g)脱氢松香酸鸡Y X 鸭Y X 鹅Y X 松香酸鸡Y X 鸭Y X 鹅Y X 海松酸鸡Y X 鸭Y X 鹅Y X 方法回收率及精密度选择基质影响最严重的鹅肉进行加标回收试验,选取阴性样品,以方法定量限的,倍浓度进行加标.由表可知,不同水平的平均回收率为 ,相对标准偏差(R S D)为 ,说明方法回
25、收率及精密度适用于一般禽肉中脱氢松香酸、松香酸和海松酸的测定.表回收率及相对标准偏差结果T a b l eR e s u l t so f r e c o v e r yr a t ea n dr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n(n)化合物添加水平/(gk g)平均回收率/相对标准偏差/脱氢松香酸 松香酸 海松酸 方法的实际应用随机选择市售的 个禽肉样品进行测定,每个样品次平行,鸡、鸭、鹅各 个,所有基质均未检出海松酸.个鹅肉检出松香酸,含量为 m g/k g,对阳性样品再次检测后,含量与此检测相比,偏差均小于,说明其可能是由松香酸甘
26、油酯分解产生,根据含量可排除非法使用松香的风险.结论采用乙腈对禽肉中的脱氢松香酸、松香酸和海松酸进行了提取,使用C 固相萃取剂进行净化,同时使用基质曲线对定量结果进行校正,回收率达到 以上;在优化的梯度洗脱条件下,种化合物在 m i n内完全出峰,同分异构体松香酸和海松酸完全基线分离,且峰型良好;结合高分辨飞行时间质谱测得所有离子的相对分子质量,对目标物准确定性定量;方法学数据表明,回收率、检出限、精密度均适用于一般禽肉样品的测定.试验针对不同的禽肉基质,分别配制基质曲线进行定量,虽然能准确定量,但处理过程仍较繁琐,且不同禽肉的部位,基质组成不一样,造成的基质效应程度也可能不一样.后续建议通过
27、前处理衍生、同位素稀释或微萃取等处理手段来降低基质效应的影响.安全与检测S A F E T Y&I N S P E C T I ON总第 期|年 月|参考文献1 马晓霖,胡琳莉,李水清,等.松香及其衍生物的应用研究进展J.广州化工,2019,47(24):3740.MA X L,HU L L,LI S Q,et al.Research progress on application ofrosin and its derivativesJ.Guangzhou Chemical Industry,2019,47(24):3740.2 刘满军,石会丽,牛安琦,等.松香酸钠化学合成及毒性研究J.广东
28、化工,2021,48(19):3435.LIU M J,SHI H L,NIU A Q,et al.Study on rosin acid sodiumchemical synthesis and toxicityJ.Guangdong Chemical Industry,2021,48(19):3435.3 KAMAYA Y,TOKITAN,SUZUKIK,etal.Effectsofdehydroabietic acid and abietic acid on survival,reproduction,andgrowth of the crustacean Daphnia magna J
29、.Ecotoxicology andEnvironmental Safety,2005,61(1):8388.4 PENG G M,ROBERTS J C.Solubility and toxicity of resin acidsJ.Water Research,2000,34(10):2 7792 785.5 AYARS G H,ALTMAN L C,FRAZIER C E,et al.The toxicity ofconstituents of cedar and pine woods to pulmonary epitheliumJ.Journal of Allergy and Cli
30、nical Immunology,1989,83(3):610618.6 LIU J J,LIU M G,LI X,et al.Development of ultrasonicassistedclosed insyringe extraction and derivatization for the determinationof labile abietic acid and dehydroabietic acid in cosmetics J.Journal of Chromatography A,2014,1 371(12):2029.7 ZHU Y,ZHANG S,GENG Z,et
31、 al.Simultaneous determination ofabietic acid and dehydroabietic acid residues in duck meat byHPLCPADFLDJ.Food Anal Meth,2014(7):1 6271 633.8 司丽丽,张威,王丰收.高效液相色谱法测定妥尔油脂肪酸中松香酸含量J.日用化学品科学,2020,43(4):4648.SI L L,ZHANG W,WANG F S.Determination of abietic acid intall oil fatty acid by high performance liqu
32、id chromatographyJ.Detergent&Cosmetics,2020,43(4):4648.9 EKEBERG D,FLTE P O,EIKENES M,et al.Qualitative andquantitative determination of extractives in heartwood of scots pine(Pinus sylvestrisL.)by gas chromatography J.Journal ofChromatography A,2006,1 109(2):267272.10 PAVEL C,RICHARD C,KAMIL K,et a
33、l.Determination of shortterm changes in levoglucosan and dehydroabietic acid in aerosolswith condensation growth unitaerosol counterflow twojets unitLCMSJ.Chemosphere,2018,210(11):279286.11 刘益庆,钱明明,卢洋,等.消肿片中松香酸的 HPLC 和 UPLCMS/MS 检测方法研究J.中国药师,2020,23(12):2 5022 505.LIU Y Q,QIAN M M,LU Y,et al.Detecti
34、on of abietic acid inXiaozhong tabletsbyHPLCandUPLCMS/MS J.ChinaPharmacist,2020,23(12):2 5022 505.12 张毅,罗耀,温景岚.液相色谱串联质谱法测定畜禽肌肉和表皮组织中松香酸、脱氢松香酸和胡椒酸J.食品安全质量检测学报,2020,11(18):6 4246 430.ZHANG Y,LUO Y,WEN J L.Simultaneous determination ofabietic acid,dehydroabietic acid and pipericacid in muscle andskin t
35、issue of livestock and poultry by liquid chromatographytandem mass spectrometryJ.J Food Saf and Qual,2020,11(18):6 4246 430.13 沈金灿,黄昌雄,肖陈贵,等.液相色谱串联质谱法测定畜禽表皮中松香酸和脱氢松香酸J.食品科学,2021,42(12):275280.SHEN J C,HUANG C X,XIAO C G,et al.Simultaneousdetermination of abietic acid and dehydrogenated abietic acid
36、inlivestock and poultry skin by liquid chromatographytandem massspectrometryJ.Food Sci,2021,42(12):275280.14 向俊,唐万里,刘慧,等.湖南省各地区畜禽肉中磺胺类药物残留情况分析J.食品与机械,2020,36(9):8286,107.XIANG J,TANG W L,LIU H,et al.Detection and analysis ofsulfonamides residues in meat poultry in Hunan provinceJ.Food&Machinery,2020
37、,36(9):8286,107.15 GELMINI F,BERETTA G,ANSELMI C,et al.GCMS profilingof the phytochemical constituents of the oleoresin fromCopaiferalangsdorffiiDesf.and a preliminaryin vivoevaluation of itspsoriatic effectJ.International Journal of Pharmaceutics,2013,440(2):170178.16 仇新媛,姚忠,耿志明,等.酶联免疫吸附测定法检测白条鸭表皮组
38、织中的脱氢松香酸J.肉类研究,2019,33(12):4549.CHOU X Y,YAO Z,GENG Z M,et al.Determination ofdehydroabietic acid in duck skin by enzymelinked immunosorbentassayJ.Meat Res,2019,33(12):4549.17 YANG F,WANG H,YANG J,et al.An indirect competitiveimmunoassay for analysis of carminic acid in meat productsJ.Food Analytical Methods,2017,10(11):3 6873 693.18 LIN L,JIANG W,XU L G,et al.Development of ICELISA andimmunochromatographic strip assay for the detection offlunixinmeglumine in milkJ.Food and Agricultural Immunology,2018,29(1):193203.|V o l ,N o 林晓君等:分散固相萃取超高效液相色谱四极杆/飞行时间质谱法测定禽肉中松香酸类物质
