1、山东医药2023 年第 63 卷第 26 期葛根素治疗冠状动脉支架内再狭窄的核心靶点筛选与细胞学验证孙云雷1，曹月娟2，赵振营31 天津中医药大学研究生院，天津300000；2 天津市人民医院心内二科；3 天津市人民医院药学部摘要：目的基于网络药理学、分子对接的方法筛选葛根素治疗冠状动脉支架内再狭窄（ISR）的核心靶点，并通过细胞学实验验证相关靶点。方法在NCBI公共数据平台基因表达综合数据库（GEO）中下载基因表达谱芯片数据GSE46560，使用R语言软件筛选该基因表达谱的差异基因，与Genecard数据库中ISR相关靶点整合，获得ISR疾病靶点。在TCMSP、SwissTargetPred
2、iction网站下载葛根素的作用靶点，与ISR疾病靶点交集，获得药物疾病关键靶点；使用String网站和Cytoscape软件分析蛋白蛋白相互作用网络并筛选出核心靶点；使用AutoDockvina软件将核心靶点与葛根素的三维核心活性成分结构进行分子对接，计算分子对接核能值，评价配体分子与受体蛋白的结合能力。取大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞进行培养，将细胞分为空白对照组、Ang组、Ang+葛根素组，采用细胞划痕实验观察各组6、12、24、48 h细胞迁移率；采用Western blotting法检测各组细胞过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）表达；采用ELISA法检测细胞炎症因子肿瘤坏死因子（TN
3、F-）、白细胞介素6（IL-6）含量。结果共获得ISR疾病相关靶点528个、葛根素作用靶点142个，将二者取交集，获得药物疾病关键靶点56个。将56个疾病药物关键靶点输入String11.5网站，获得疾病药物核心靶点TNF、AKT1、SOD1、VEGFA、ABCB1、CASP3、PTGS2、PPAR。分子对接显示，各核心靶点蛋白与葛根素中对应的活性化合物均有较好的结合能力。细胞实验表明，与空白对照组比较，Ang组PPAR蛋白表达降低，TNF-、IL-6表达升高；与Ang组比较，Ang+葛根素组PPAR表达升高，TNF-、IL-6表达降低。结论共筛选得到PPAR等7个葛根素治疗ISR的核心靶点；
4、经验证，葛根素可能通过激活PPAR、抑制炎症因子表达从而抑制血管平滑肌细胞增殖，从而达到治疗ISR的目的。关键词：冠脉支架内再狭窄；葛根素；网络药理学；过氧化物酶体增殖物激活受体；血管平滑肌细胞；细胞增殖doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.26.003 中图分类号：R541.4 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）26-0010-05Screening and cytological validation of core targets of puerarin in the treatment of coronary in-stent res
5、tenosisSUN Yunlei1，CAO Yuejuan，ZHAO Zhenying1 Graduate School of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300000，ChinaAbstract：Objective Based on the methods of network pharmacology and molecular docking，the core targets of puerarin in the treatment of coronary in-stent restenosis（
6、ISR）were screened，and the related targets were verified by cytological experiments.Methods The gene expression profile data GSE46560 was downloaded from the NCBI public data platform gene expression comprehensive database（GEO）.The differential genes of the gene expression profile were screened by R
7、language software，and were integrated with ISR-related targets in Genecard database to obtain ISR disease targets.We downloaded the action target of puerarin on TCMSP and SwissTargetPrediction websites and intersected with ISR disease target to obtain the drug-disease key target.We used String websi
8、te and Cytoscape software to analyze the protein-protein interaction network and screened the core target；AutoDockvina software was used to dock the core target gene with the three-dimensional core active component structure of puerarin，and we calculated the docking nuclear energy，and evaluated the
9、binding ability of ligand molecule and receptor protein.The vascular smooth muscle cells of rat thoracic aorta were 基金项目：天津市“131”创新型人才培养工程项目（2016）。第一作者简介：孙云雷（1996-），男，硕士研究生在读，主要研究方向为中西医结合治疗心血管疾病。E-mail：通信作者简介：曹月娟（1975-），女，教授，主任医师，硕士研究生导师，主要研究方向为心血管疾病防治。E-mail：开放科学（资源服务）标识码（OSID）10山东医药2023 年第 63 卷第 2
10、6 期cultured and divided into the blank control group，Ang group，and Ang+puerarin group.The cell migration rates at 6，12，24 and 48 h were observed by Scratch test，and the expression of peroxisome proliferator-activated receptor （PPAR）was detected by Western blotting.The content of tumor necrosis facto
11、r-（TNF-）and interleukin-6（IL-6）was measured by ELISA.Results A total of 528 ISR disease-related targets and 142 puerarin action targets were obtained，and 56 drug-disease key targets were obtained by intersection of the two.Fifty-six disease-drug key target genes were input into String11.5 website to
12、 obtain disease-drug core targets TNF，AKT1，SOD1，VEGFA，ABCB1，CASP3，PTGS2，and PPAR.Molecular docking showed that all the core target proteins had good binding ability to the corresponding active compounds in puerarin.Cell experiments showed that compared with the blank control group，the expression of
13、PPAR protein decreased and the expression of TNF and IL-6 increased in the Ang group，while the expression of PPAR increased and TNF-and IL-6 decreased in the Ang+puerarin group in comparison with those of the Ang group.Conclusion Seven core target genes of puerarin in the treatment of ISR are screen
14、ed out，and puerarin can inhibit the proliferation of vascular smooth muscle cells by activating PPAR and inhibiting the expression of inflammatory factors to achieve the purpose of treating ISR.Key words：coronary in-stent restenosis；puerarin；network pharmacology；peroxisome proliferator-activated rec
15、eptor；vascular smooth muscle cell；cell proliferation经皮穿刺冠状动脉介入是冠心病患者血运重建的重要手段，然而冠脉支架内再狭窄（ISR）以及由此引发的再次靶血管血运重建严重影响介入治疗的长期预后。血管平滑肌细胞（VSMC）迁移和增殖在ISR的病理生理学中发挥关键作用。介入操作对血管壁的机械刺激和血管壁内皮损伤后，可诱发表达多种炎症介质和细胞因子，促使血管中层VSMC发生表型转化并获得增殖能力，VSMC增殖并向内膜移行，伴有细胞外基质的改变，导致新生内膜形成并增厚，发生不良的血管结构重塑，从而使血管腔缩小甚至完全闭塞1。抑制VSMC迁移和增殖能够
16、有效减少ISR发生。研究显示，血管紧张素（Ang）能够促进VSMC迁移和增殖，加快ISR的发生，其机制可能与 NF-B、PI3K/AKT、MAPK 等炎症信号通路有关2。葛根素是从中药葛根中提取的一种黄酮苷，主要用于治疗心脑血管疾病、糖尿病周围血管疾病、颈椎病、肺心病等。现代药理学研究发现，葛根素能够扩张血管，降低心肌耗氧指数，改善心肌缺血，在心脑血管疾病中发挥良好的临床疗效；葛根素还能抑制二磷酸腺苷、提高高密度脂蛋白水平，降低血栓形成风险3。葛根素在心脑血管疾病中的作用可能与其调控炎症因子和炎症通路的作用有关4。2022年3月2023年2月，我们基于网络药理学和分子对接技术，筛选葛根素治疗I
17、SR的核心靶点，并通过细胞学实验验证相关靶点的作用及其机制，旨在为临床预防和治疗ISR提供新的思路。1 材料与方法 1.1葛根素治疗ISR核心靶点的筛选1.1.1ISR疾病靶基因的筛选在NCBI公共数据平台基因表达综合数据库（GEO）（https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下载基因表达谱芯片数据GSE46560，使用R4.2.1软件对该芯片数据进行分析，将差异倍数logFC绝对值1和P0.05的基因作为ISR的差异表达基因，即ISR潜在治疗靶点，结果以火山图形式展示。另外，在 GeneCards数据库（https：/www.genecards.org/）中输入“i
18、n-stentrestenosis”进行检索，下载并收集获得的ISR相关基因。将两个数据库收集的ISR疾病相关靶基因汇总、去重，获得ISR疾病靶基因。1.1.2葛根素作用靶点的筛选在TCMSP数据库（https：/old.tcmsp- 数据库（http：/www.swisstargetprediction.ch/）中输入葛根素化学式，物种选择“Homo sapiens”，下载葛根素相关靶点。将两个数据库收集的葛根素靶点汇总、去重，获得葛根素作用靶点。1.1.3疾病药物关键靶点的筛选通过Uniprot网站（https：/www.uniprot.org/）对收集到的ISR、葛根素靶点进行名称标准化
19、校正，再将ISR、葛根素靶点输入 Venn Diagrams 在线网站（https：/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）获得交集靶点，即疾病药物关键靶点。1.1.4疾病药物核心靶点的筛选将获得的疾病药物关键靶点输入String11.5网站，选择物种为“Homo sapiens”，设置“highest confidence”为 0.4，删除无相互作用节点，构建蛋白蛋白相互作用网络（PPI）图，并运用Cytoscape3.9.1软件分析PPI图，计算各个靶点的Betweenness值，取Betweenness值100的靶点作为疾病药物核心靶点，绘
20、制可视化图。1.1.5疾病药物核心靶点的分子对接将11山东医药2023 年第 63 卷第 26 期“1.1.4”筛选获得的核心靶点输入 PCSBPDB 网站（https：/www.rcsb.org/），同时将葛根素结构输入Chem 3D 20.0软件，获得各靶点与葛根素的三维核心活性成分结构。使用Pymol软件去除靶点的小分子配体和水分子，使用 AutoDockTools1.5.7软件加氢，使用Gridbox包裹整个靶点，再使用AutoDockvina软件进行分子对接，使用Pymol绘制可视化图片。分子对接核能值-5.0 kcal/mol表明配体分子与受体蛋白有较好的对接活性，-7.0 kca
21、l/mol表明二者间有强烈的对接活性。1.2葛根素抑制VSMC增殖机制的细胞学验证1.2.1材料大鼠胸主动脉VSMC（天津市胸科医院）、葛根素（Sigma）、Ang（Med Chem Express）、过氧 化 物 酶 体 增 殖 物 激 活 受 体（PPAR）一 抗（Abcam）、GAPDH 一抗（Abcam）、HRP 标记的山羊抗小鼠/兔IgG二抗（雅酶）、蛋白制胶电泳与转膜系统（碧云天）、倒置显微镜（OLYMPUS）、酶标仪（Thermofisher）。1.2.2细胞培养与传代将细胞加入含有10%胎牛血清和1%抗生素的完全培养基，置于T25细胞培养瓶中，在37、5%CO2培养箱中培养。每
22、23 d换液。待细胞生长至培养瓶底80%90%时，按照1 2或1 3进行细胞传代，取第310代细胞用于后续实验。1.2.3细胞分组与给药将细胞按5104/孔接种到6孔板，分为空白对照组、Ang组、Ang+葛根素组。加入完全培养基培养 1 d，待细胞铺满板底后，以无血清培养基饥饿处理12 h。Ang组加入含1 mol/L Ang的无血清培养基3 mL，Ang+葛根素组加入含 1 mol/L Ang与 200 mol/L 葛根素的无血清培养基3 mL，空白对照组加入3 mL无血清培养基。1.2.4细胞增殖能力观察采用细胞划痕实验。取各组细胞，使用200 L枪头在各组板底划横线，拍照记录0、6、12
23、、24 h照片，使用Image J软件计算划痕空白面积，计算各组6、12、24 h细胞迁移率。细胞迁移率=（0 h空白面积某一时间点空白面积）/0 h空白面积100%。1.2.5细胞 PPAR 蛋白检测采用 Western blotting法。各组加入相应药物培养24 h后，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂，充分混匀后置于冰上裂解30 min。4 下10 000 r/min离心，取上清液。使用BCA 法将各组蛋白浓度配平，加入蛋白上样缓冲液，煮沸使蛋白变性。使用PAGE凝胶进行电泳分离，将蛋白以湿转法转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭。加入 PPAR、GAPDH 一抗（稀释浓度均为15 000
24、），4 孵育过夜。TBST洗膜，加入二抗室温孵育30 min，ECL显影曝光蛋白。使用Image J软件对蛋白条带进行灰度值分析，计算PPAR蛋白的相对表达量。1.2.6细胞肿瘤坏死因子（TNF-）、白细胞介素6（IL-6）检测采用ELISA法。各组培养24 h后，取上清，使用ELISA试剂盒检测TNF-、IL-6含量。1.3统计学方法采用GraphPad Prism 9.3.1软件进行数据处理与绘图。符合正态分布的数据以-x s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，重复测量数据比较采用重复测量方差分析；非正态分布的数据以频次或百分比表示，使用秩和检验进行多组间比
25、较。P100的靶点 TNF、AKT1、SOD1、VEGFA、ABCB1、CASP3、PTGS2、PPAR，将其设为核心靶点，绘制可视化图，见OSID码图2。2.1.3葛根素与核心靶点分子对接结果核心靶点 TNF、AKT1、SOD1、VEGFA、ABCB1、CASP3、PTGS2、PPAR与葛根素的分子对接核能值分别为-7.2、-7.8、-9.1、-7.8、-6.8、-7.7、-9.8、-7.9 kcal/mol。使用 Pymol 软件将对接核能值-7.0 kcal/mol的结果进行可视化，见OSID码图3。2.2葛根素抑制VSMC增殖机制的细胞学验证结果2.2.1葛根素对细胞增殖能力的影响给药
26、 12、24 h 时，Ang组细胞迁移率较空白组升高（P 均0.05）。给药24 h时葛根素组细胞迁移率较Ang组降低（P0.05）。见表1。2.2.2葛根素对细胞PPAR蛋白表达的影响空12山东医药2023 年第 63 卷第 26 期白对照组、Ang组、Ang+葛根素组 PPAR蛋白表达水平分别为 1.00 0.17、0.56 0.18、0.96 0.16。Ang组 PPAR 表达较空白对照组降低，Ang+葛根素组PPAR表达较Ang组升高（P均0.05）。2.2.3葛根素对细胞炎症因子表达的影响Ang组TNF-、IL-6表达较空白对照组升高，Ang+葛根 素 组 TNF-、IL-6 表 达
27、 较 Ang 组 降 低（P 均0.05）。见表2。3 讨论 ISR的形成机制复杂，虽然支架置入有效防止了动脉血管的弹性回缩，强化的抗凝、抗血小板药物治疗极大控制了血栓的形成，但这些措施仍难以有效抑制 ISR。中医认为，ISR 的发病机制为气血不通，不通则痛，而发为再狭窄。葛根属于解表类中药，具有发表解肌、透疹、解热生津、升阳止泻的功效，常用于治疗外感表证发热、头痛项强、烦热消渴、泄泻、痢疾、麻疹不透等疾病。葛根始载于 神农本草经：“味甘，平，主消渴，身大热，呕吐，诸痹，起阴气，解诸毒”。本草经集注 记载葛根：“味甘，平，无毒。主治消渴，身大热，呕吐，诸痹，起阴气，解诸毒。治伤寒中风头痛，解肌
28、发表出汗，开腠理，治金疮，止痛，胁风痛。生根汁，大寒，治消渴，伤寒壮热”。葛根素是从葛根藤、野葛的干燥根中提取的一种黄酮苷，主要用于治疗心脑血管疾病，包括动脉粥样硬化、心力衰竭、心肌梗死、中风和高血压。研究表明，葛根素在心脑血管疾病中的作用可能与NF-B、PI3K/AKT、Bcl-2/Bax信号通路有关4。本研究通过网络药理学分析获得528个ISR疾病靶点和142个葛根素作用靶点，得到56个药物疾病作用靶点。通过计算葛根素-ISR靶点的PPI相互作用网络中的 Betweeness 值，我们发现 TNF、AKT1、SOD1、VEGFA、ABCB1、CASP3、PTGS2、PPAR的Between
29、ess值均大于100，说明这8个靶点可能是葛根素治疗 ISR 的关键核心靶点。利用AutoDockvina软件计算配体分子和受体蛋白之间的分子对接核能值，分数均-5.0 kcal/mol，表明二者间有较好的对接活性。结合Betweeness值与分子对接核能值，预测葛根素可能通过与 TNF、AKT1、SOD1、VEGFA、CASP3、PTGS2、PPAR结合，从而抑制ISR发生。TNF作为炎症因子的一种，参与动脉粥样硬化与 VSMC 增殖，是预测 ISR 的血清标志物之一5。AKT1通过细胞代谢、转录调控、细胞周期调控等途径参与癌症、炎症、糖尿病及心血管疾病的发生发展。CHE等6发现，含有AKT
30、1 siRNA的支架能够减少 ISR 发生。SOD1是超氧化物歧化酶（SOD）一种亚型，SOD通过催化超氧阴离子自由基歧化成氧和过氧化氢来发挥抗氧化的作用，调节机体氧化与抗氧化之间的平衡。BRSEN等7对置入支架的兔子进行高脂喂养，发现接受体外SOD治疗能够明显减少ISR的发生，这也表明细胞内氧化敏感信号通路在 ISR 中具有重要的病理生理作用。VEGFA 参与了血管损伤后的内膜新生，是ISR的重要标志物之一8。CASP3是半胱氨酸蛋白酶家族的一种亚型，线粒体内的细胞色素在线粒体收到损伤时被动释放到细胞外，激活CASP3，诱导细胞凋亡。动物实验显示，CASP3能够抑制VSMC增殖，从而减少IS
31、R的发生9。PTSG2也称为环加氧酶2，同时充当双加氧酶和过氧化物酶，在前列腺素合成中发挥关键作用，而前列腺素的合成与ISR发生有密切联系10。PPAR属于配体激活的转录因子核受体家族成员，在脂肪细胞、骨骼肌、心脏、肾VSMC等细胞中广泛表达11。PPAR能够抑制由Ang、生长因子等激活的ERK和MAPK信号通道，减少炎症反应，减轻血管损伤，抑制VSMC异常增殖12；同时，Ang诱导的血管炎症反应可下调PPAR表达，诱导其核输出信号和蛋白质损失。PPAR的两种改变都伴随着PPAR与DNA结合活性的降低，诱导PPAR从细胞核到细胞质重新分布；同时相关炎症通道又增加PPAR的多泛素化/蛋白酶活性，
32、诱导PPAR降解13。研究表明，PPAR激动剂吡格列酮能够有效抑制VSMC增殖，减少 ISR 发生14。本研究的细胞学验证以PPAR作为靶点，药理研究表明，木犀草苷、淫羊藿苷等黄酮类药物均能上调PPAR表达，从而发挥抑制炎症的作用15，同属黄酮类药物的葛根素也有可能发挥相似的作用。表1各组不同时间点细胞迁移率比较（%，-x s）组别Ang组葛根素组空白对照组细胞迁移率6 h12.31 1.656.34 4.048.87 2.4712 h34.03 3.20*17.66 4.5617.02 4.9524 h57.10 9.06*31.52 6.3333.03 9.80注：与空白对照组比较，*P0
33、.05;与Ang组比较，P0.05。表2各组细胞TNF-、IL-6表达比较（ng/L，-x s）组别Ang组葛根素组空白对照组TNF-126.46 9.35*59.84 7.1443.96 10.89IL-623.86 11.02*9.20 5.233.14 1.07注：与空白对照组比较，*P0.05;与Ang组比较，P0.05。13山东医药2023 年第 63 卷第 26 期VSMC具有收缩型和合成型两种主要表型，在正常生理条件下，VSMC主要是收缩表型，合成表型较少。在血管损伤、血流动力学改变、细胞炎症因子的刺激下，VSMC从收缩性表型转变为合成表型，促使VSMC异常增殖，迁移并增厚血管壁
34、，最终导致动脉粥样硬化和内膜增生16。研究表明，Ang能够促使血管由收缩型转换成合成型，同时Ang激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等炎症信号通路，诱导体内炎症反应，促使VSMC异常增殖17。PPAR能够作用于单核细胞，减少血管黏附分子分泌，减少细胞炎症反应，促进胆固醇逆向转运加强，阻止动脉粥样硬化形成；减少间质金属蛋白酶产生，降低纤溶酶激活物抑制剂和生长反应因子1含量，发挥抗动脉粥样硬化作用；由Ang、生长因子、高血糖等激活的ERK和MAPK信号通路，减少炎症反应，减轻血管损伤，抑制VSMC异常增殖12。本研究结果显示，与空白对照组比较，Ang组能够诱导VSMC增殖，激活相关炎症通路，促使细
35、胞产生TNF-、IL-6等炎症因子；与 Ang组比较，加入葛根素能够在24 h内有效抑制Ang诱导的细胞增殖。这表明葛根素能够激活PPAR表达，抑制相关炎症通路，减少炎症因子分泌，从而抑制VSMC异常增殖。综上所述，本研究通过网络药理学及分子对接对葛根素-ISR靶点的筛选及计算发现葛根素是治疗ISR的潜在药物，预测葛根素可能通过PI3K/AKT等信号通路发挥降脂、抗炎、抑制VSMC增殖等途径来减少ISR的发生，其中可能涉及TNF、AKT1、SOD1、VEGFA、CASP3、PTGS2、PPAR等相关靶点。细胞实验表明，葛根素能够抑制 Ang诱导的 VSMC增殖，其机制可能是通过上调PPAR、抑
36、制下游炎症因子表达来发挥作用。这为葛根素用于临床治疗ISR提供了新的思路。参考文献：1LOOSER P M，KIM L K，FELDMAN D N.In-Stent Restenosis：Pathophysiology and TreatmentJ.Curr Treat Options Cardiovasc Med，2016，18（2）：10.2刘玉，王海军，温进坤，等.Ang促进大鼠血管平滑肌细胞增殖和迁移 J.基础医学与临床，2012，32（1）：89-91.3侯筱婷.葛根素对心脑血管疾病影响的研究进展 J.中西医结合心脑血管病杂志，2018，16（14）：2002-2004.4JIANG
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