1、 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中药制剂研究复方血竭跌打膏的制剂工艺、指纹图谱及含量测定研究郭星妤1，俞越童2，崔述生3，孙波3，翟恩爱1，于淑琳1，邹慧琴1，闫永红1（1.北京中医药大学中药学院 北京 102401；2.中国中医科学院中药研究所 北京 100700；3.北京市鼓楼中医医院 北京 100009）摘要：目的制备复方血竭跌打膏，建立高效液相色谱（HPLC）指纹图谱并对其主要成分进行定量分析。方法制备O
2、/W型乳膏剂，结合星点设计-效应面法（CCD-RSM）优化药膏基质处方，并进行中试放大验证；采用HPLC建立指纹图谱并检测三七、续断指标成分含量。结果优选出最佳基质处方为：硬脂酸10.7 g、单硬脂酸甘油酯6.0 g、十二烷基硫酸钠1.0 g、羊毛脂3.3 g；并基于此进行了中试放大验证实验，相对误差为2.66%，结果显示上述基质处方科学合理，稳定可行。HPLC指纹图谱显示11批样品中有19个共有峰，相似度0.9；建立了三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及川续断皂苷含量测定方法。结论用优选得到的基质处方制备出的软膏均匀细腻、稳定性好，高效液相色谱方法检测结果可靠，可用于质量标准的研究
3、。关键词：乳膏剂 HPLC指纹图谱 三七 续断 含量测定doi:10.11842/wst.20220416002 中图分类号:R284 文献标识码:A复方血竭跌打膏由血竭、乳香、没药等十味中药配伍组成，原方为崔氏速效损伤灵药膏，来源于北京市鼓楼中医医院，是国家级名老中医、首都名中医崔述生教授在长期临床实践中研发出的用于治疗急性软组织损伤的验方，临床疗效确切。随着使用需求不断扩大，由蜂蜜混合、现用现配制成的糊剂已无法满足临床使用及药品存储需求。水包油型（O/W）乳膏剂能够较好的分散树脂类油溶性药物和水溶性药物，具有容易涂布、无油腻感、便于清洗的优点，更适合本制剂的临床使用需求1。传统的中药质量评
4、价方法包括定性鉴别与含量测定，而中药复方制剂具有多成分、多靶点、协同作用发挥疗效的特点，其质量评价标准要针对多成分测定、全过程评价2。课题组前期已完成对原料药的提取工艺优化3，本研究在中医药理论指导下结合现代制剂技术，制备出工艺稳定、质量可控的复方血竭跌打膏，建立了HPLC指纹图谱并测定了三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及川续断皂苷含量，以期为复方血竭跌打膏临床扩大使用提供安全可靠的保障，并促进临床验方从“方”向“药”的发展4。1 材料 1.1仪器AK20002电子天平（成都倍赛克仪表研究所）；电风鼓吹干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（郑州
5、恒岩仪器有限公司）；BY-400C型医用离心机（北京白洋医疗器械有限公司），Waters e2695高效液相色谱仪（Waters 2489 PDA检测器，美国）；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱 收稿日期：2022-04-16 修回日期：2022-07-05 企事业单位委托科技项目（2018110031000294）：崔氏速效损伤灵改进剂型药膏质量标准及临床药理研究，负责人：闫永红。通讯作者：邹慧琴，博士，副研究员，主要研究方向：中药质量研究与中医药情报战略分析；闫永红，博士，教授，主要研究方向：中药品质评价 与高等教育。1803 Modernization of Tradit
6、ional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5（4.6250 mm，5 m）；FW-100高速万能粉碎机型（北京科伟永兴仪器有限公司）；HH-S6A电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；KQ-500DE数控超声波清洗；RE-52AA 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。1.2试药血竭（批号：1806002）、乳香（批号：1805002）、没药（批号：1805002）、续断（批号：1801006）、三七（批号：1804001）、延胡索（批号：18
7、06003、210912）、红花（批号：1805004、201214001、210613001）、青黛（批号：1805002）、骨碎补（批号：1806001、180101、1906030），鹿筋购自安国兴华药业有限公司。硬脂酸，硬脂醇，白凡士林，羊毛脂，单硬脂酸甘油酯，液体石蜡，甘油，三乙醇胺，十二烷基硫酸钠，尼泊金乙酯，吐温80均为药用辅料；柚皮苷对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：5562），延胡索乙素对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：5066），血竭素高氯酸盐对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：Y17M9H56341），人参皂苷Rg1对照品（上海源叶生物科技有限
8、公司，批号：G16S10Y97436）；人参皂苷 Rb1对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：7672）；三七皂苷R1对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：5365）；川续断皂苷对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：5688）；甲醇、正丁醇、氨水、无水乙醇均为分析纯；乙腈为色谱纯；娃哈哈纯净水。2 方法与结果 2.1乳膏剂制备工艺2.1.1处方基质筛选以软膏的均匀度、细腻度、稠度、涂展性、有无气泡、油腻性等6方面为外观性状评价指标；以膏体是否发粗、有无油水分离两方面为高、低温实验评价指标；以有无出现油水分离、药物沉淀两方面为离心实验评价指标5-8，筛选最优处方9-11，
9、评分结果见表 1。初步定为处方7：硬脂酸10 g、液体石蜡7 g、单硬脂酸甘油酯5 g、羊毛脂2 g、白凡士林6 g、十二烷基硫酸钠1 g、甘油10 g。具体制法为：将硬脂酸、液体石蜡、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、羊毛脂，置于烧杯中水浴加热至熔融，油相备用；再取十二烷基硫酸钠、甘油、水，置于烧杯中水浴加热至溶解，水相备用；分别加入浓缩药液，将水相加入油相乳化，加入药物极细粉搅拌均匀，即得。2.1.2基质配比优化（1）单因素实验考察基质用量采用单因素实验考察硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸钠等基质的用量，确定星点设计实验的因素和水平，单因素实验考察因素与水平见表2。此外，由于白凡士林 液体石蜡
10、的用量对药膏离心稳定、表2单因素考察因素与水平水平1234因素硬脂酸（g）5101520单硬脂酸甘油酯（g）36912十二烷基硫酸钠（g）0.511.52甘油（g）5101520羊毛脂（g）1357表1基质处方筛选结果处方号处方1处方2处方3处方4处方5处方6处方7评分外观性状（30分）25211220181825离心实验（10分）1010108101010高温实验（10分）6587999低温实验（10分）6109101099综合评分47463945474653表3CCD实验因素的代码水平及其对应的物理量因素A硬脂酸（g）B单硬脂酸甘油酯（g）C十二烷基硫酸钠（g）D羊毛脂（g）水平-27.5
11、1.50.51-110312012.54.51.53115624217.57.52.551804 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中药制剂研究耐寒耐热性影响较大，故对二者比例进行考察。实验结果显示：甘油用量为 10 g 时综合评分最高；白凡士林:液体石蜡用量为3 g 6 g时，外观性状和稳定性都较好，综合评分最高。而硬脂酸用量在10 g、15 g综合评分最高；单硬脂酸甘油酯用量在3 g、6 g综合评分最高；十二烷基
12、硫酸钠用量在1 g、2 g综合评分最高；羊毛脂用量在1 g、3 g综合评分最高。综上，固定100 g处方中，白凡士林用量为3 g，液体石蜡用量为6 g，甘油用量为10 g，选择硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸钠、羊毛脂四项为响应面考察因素，用星点设计-效应面法（CCD-RSM）优化处方基质配比。（2）CCD-RSM优化处方基质配比参考文献12-14，根据单因素考察结果，采用design-expert 8.0.6软件设计实验方案和处理数据结果。因素水平表见表3，响应面实验方案与结果见表4。将表4中的实验结果用design expert 8.0.6软件处理，得到方差分析结果，见表5，同时进行回
13、归方程拟合，得到二次回归方程：Y=46.33-1.88A+5.37B-1.79C-1.21D-0.94AB+0.81BC+0.063AD+0.81BC+1.56BD-0.19CD-2.53A2-0.66B2-0.16C2-0.78D2（R2=0.9414，P0.0001）。根据拟合出的二次回归方程，采用 design expert 8.0.6软件进一步做出各因素间交互作用的三维响应面图，见图1。表4CCD实验方案与结果实验方案123456789101112131415161718192021222324252627282930硬脂酸151012.51012.517.512.510101012.
14、5151512.512.512.51512.512.512.515157.512.51010151512.510单硬脂酸甘油酯664.564.54.54.56334.5664.54.54.534.54.57.5334.54.536631.53十二烷基硫酸钠211.521.51.51.52111.5111.52.50.521.51.51.5211.51.521211.52羊毛脂243233142432433343532233424432外观性状162620221813232424212321182419241523182323181623202518212020离心实验1010810108610
15、6591010810749610565741010567高温实验9999949894879961058810481083109454低温实验101089888877971057767785678678644总分4555455045334650463749454746424830473951373838463352453635351805 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 拟合方程的相关系数
16、R2=0.9414，表明模型预测值与实测值有较高的关性，回归方程拟合度好，预测性好；由表4方差分析可知，拟合出的模型P0.05，不表5响应面方差分析表方差来源ModelA-硬脂酸B-单硬脂酸甘油酯C-十二烷基硫酸钠D-羊毛脂ABACADBCBDCDA2B2C2D2残差失拟项净误差总和平方和（SS）1149.38084.380693.37077.04035.04014.06010.5600.06310.56039.0600.560175.74011.8100.67016.74071.58060.25011.3301220.970自由度（df）14111111111111111510529均方（M
17、S）82.10084.380693.37077.04035.04014.06010.5600.06310.56039.0600.560175.74011.8100.67016.7404.7706.0302.270F值17.20017.680145.29016.1407.3402.9502.2100.0132.2108.1900.12036.8302.4800.1403.5102.660P值0.0001*0.0008*0.0001*0.0011*0.01610.10660.15750.91040.15750.01190.73610.00010.13650.71320.08070.1461注：*P
18、ACD，A、B、C、D四个因素的P值均小于0.05，表明四个因素都具有显著影响，交互作用中BD有显著影响，其余交互作用无显著影响。采用design expert 8.0.6软件在使综合评分最大情况下，得到最佳基质用量为：硬脂酸10.7 g、单硬脂酸甘油酯6.0 g、十二烷基硫酸钠1.0 g、羊毛脂3.3 g。（3）验证实验按确定的最佳基质配比条件平行制备出三批复方血竭跌打膏，对软膏的外观性状、高温实验、低温实验、离心实验进行综合评分，结果见表6。由表6可知，相对误差为2.66%，说明实测值与预测值偏差较小，拟合出的模型具有良好的预测性，优选出的最佳基质配比科学合理，稳定可行。2.2指纹图谱2.
19、2.1色谱条件Agilent ZORBAX SB-C18 色 谱 柱（4.6250 mm，5 m）；流动相水（A）-乙腈（B）梯度洗脱条件见表7；检测波长 283 nm；进样量 10 L；柱温 40；流速1.0 mLmin-1。2.2.2供试品的制备称取 5 g 药膏，加 30 mL 甲醇超声（250 W，频率40 KHz）提 取 30 min，放 冷 后 过 滤，取 续 滤 液 过0.22 m微孔滤膜，即得。2.2.3HPLC指纹图谱的建立（1）方法学考察精密度实验结果显示，取样品（0519）制备1份供试品溶液，连续进样6针，以最高峰为参照，测得峰面积大于80000的共有峰相对保留时间RSD
20、0.62%，相对峰面积RSD4.84%，表明仪器精密度良好。重复性实验结果显示，取样品（0519）平行制备6份供试品溶液，以最高峰为参照，同样标准测得共有峰相对保留时间RSD0.15%，相对峰面积RSD4.62%，表明该方法重复性良好。稳定性实验结果显示，取样品（0519）制备1份供试品溶液，分别于0、6、12、18、24 h进样，以最高峰为参照，同样标准测得共有峰相对保留时间RSD0.47%，相对峰面积RSD0.9，且对峰进行归属结果如图2所示。2.3含量测定2.3.1色谱条件Agilent ZORBAX SB-C18 色 谱 柱（4.6250 mm，5 m）；流动相水（A）-乙腈（B）梯度
21、洗脱（0-30 min，81%-80%A；30-60 min，80%-62%A）；检 测 波 长203 nm；进样量10 L；柱温30；流速1.0 mLmin-1。2.3.2溶液的制备（1）混合对照品溶液的制备精密称取三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷Rb1和川续断皂苷对照品适量，用甲醇溶解定容至10 mL 容量瓶中，配制成浓度分别为 0.978、1.447、1.528、2.087 mgmin-1的混合对照品溶液。（2）供试品溶液的制备称取 20 g药膏，加 50 mL 甲醇超声（250 W，频率40 KHz）提取1 h，放冷后过滤，蒸干滤液，加20 mL水溶解残渣，用水饱和正丁醇萃取
22、 2次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次30 mL，取正丁醇液，蒸干，加甲醇溶解残渣定容至5 mL容量瓶中，过0.22 m微孔滤膜，取续滤液，即得。（3）阴性样品溶液的制备按复方血竭跌打膏处方及工艺制备缺三七药膏表6验证实验结果实验号123综合评分555455预测值-53.25-相对误差（%）2.66注：相对误差%=|预测值-实测值|/预测值100%。表7HPLC梯度洗脱程序表时间（min）0520264676869395A（%）909068676028159090B（%）1010323340728510101807 Modernization of Tradition
23、al Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 和缺续断药膏，同“2.3.2（2）”项下供试品溶液制备方法制成缺三七阴性样品溶液和缺续断阴性样品溶液。2.3.3系统适用性实验专属性考察结果显示，混合对照品溶液、供试品溶液、缺三七阴性样品溶液、缺续断阴性样品溶液色图211批样品的HPLC指纹图谱注：1-2：骨碎补成分；2：柚皮苷；3-8：血竭成分；3：血竭素；9：延胡索乙素。图3高效液相色谱图注：A：混合对照品溶液；B：供试品溶液；C：缺续断阴性样品溶液；
24、D：缺三七阴性样品溶液；1：三七皂苷R1；2：人参皂苷Rg1；3：人参皂苷Re；4：川续断皂苷；5：人参皂苷Rb1。1808 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中药制剂研究谱图分离度良好、阴性无干扰，见图3。线性关系考察结果显示，三七皂苷R1在48.9-978.0 gmL-1、人参皂苷 Rg1在 72.4-1447.0 gmL-1、人参皂苷 Rb1在 76.4-1528.0 gmL-1、川续断皂苷在104.4-208
25、7.0 gmL-1范围内相关系数r0.999。精密度实验结果显示，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和川续断皂苷的峰面积RSD分别为1.54%、1.23%、1.14%、0.72%，表明仪器精密度良好。稳定性实验结果显示，24 h内三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和川续断皂苷含量的RSD值分别为1.91%、1.98%、1.96%、1.99%，表明溶液24 h内稳定。重复性实验结果显示，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和川续断皂苷含量的RSD值分别为1.78%、1.71%、1.97%、1.79%，表明此方法重复性良好。加样回收率实验结果显示，三七皂苷R1、人参皂苷
26、Rg1、人参皂苷Rb1和川续断皂苷的平均加样回收率分别为99.64%、99.81%、100.84%、98.83%，RSD 值分别为 2.22%、2.69%、3.16%、2.45%，表明此方法回收率良好。2.3.4中试样品的含量测定取三批中试药膏，按上述建立的含量测定方法进行含量测定，分别计算每克药膏中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和川续断皂苷的含量。结果显示，药膏中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和川续断皂苷的平均含量分别为 41.48 gg-1、200.08 gg-1、199.37 gg-1、150.45 gg-1，可为后续制定质量标准提供参考。3 讨论复方血竭跌打
27、膏药味复杂，方中乳香、没药等树脂类药物主要成分为油脂性，红花、续断等的提取物为水溶性，通过预实验发现乳剂型基质能更好的溶解分散原料药物。而一般认为O/W型乳膏较W/O型乳膏药物释放和透皮吸收快15，更适合本制剂的临床使用需求，因此将其制备为O/W型乳膏。CCD-RSM是一种通过建立多元二次回归模型来拟合自变量与效应变量之间的函数关系，对获得的函数模型分析得出最佳实验条件的统计方法16，具有实验精度高、预测性好、实验简单等优点17-18。因此，本实验选择 CCD-RSM对处方基质配比进行优化，建立的多元二次回归方程拟合度好，并通过验证表明优选出的基质处方稳定可靠。中药复方制剂多成分协同发挥疗效，
28、指纹图谱综合全面的特点更有利于科学实际的建立制剂质量评价标准19，同时能反应复方制剂质量的稳定性与一致性2。本实验分别比较了100%甲醇、80%甲醇、50%甲醇的提取效率以及30、35、40柱温对色谱图的影响，通过全波长扫描，选择出峰最多、分离度最好的检测波长，确定了最终的色谱条件。基质中加入的防腐剂尼泊金乙酯在该检测条件下出峰，且响应值最大，但由于该峰对其他峰干扰较小且在其他检测波长下的分离效果并不理想，而基质中的其他成分对色谱图无影响，综合考虑将尼泊金乙酯纳入指纹图谱的建立。由于本复方药味复杂，指纹图谱并未涵盖所有成分，因此进一步对处方当中的臣药续断以及贵重药三七的皂苷成分进行定量分析，为
29、建立质量标准提供参考。本研究在建立三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和川续断皂苷的含量测定方法时，比较了波长为190 nm、203 nm、212 nm时色谱峰的分离效果，结果4个成分在203 nm时基线较稳定，峰型较好且分离度良好，因此选择检测波长为203 nm。在预实验中拟同时测定人参皂苷Re的含量，但由于测定时发现人参皂苷Re含量较少，色谱峰面积小且不稳定，因此不予考虑。综上，本实验制备的复方血竭跌打膏均匀细腻、易于涂布、质量稳定，指纹图谱结果显示制剂工艺稳定可行，后续将在上述实验基础上开展透皮实验，继续完善对本复方的临床前研究。参考文献 21武晏屹,白明,田硕,等.中药乳膏剂临
30、床外用技术特点分析.中华中医药杂志,2020,35(10):5152-5155.2赵冬青.中药复方制剂的质量控制方法探讨.中医药管理杂志,2022,30(3):200-202.3俞越童,邹慧琴,姚月保,等.基于AHP-CRITIC法结合正交设计优选复方血竭跌打膏中四味中药提取工艺.世界科学技术-中医药现代化,2020,22(8):2807-2816.4张雷,彭惠平.备案制背景下医疗机构中药制剂由“方”到“药”的发展思考.中华中医药杂志,2022,37(2):618-621.5皮凤娟,黄娟,张庆莲.复方大黄软膏制备工艺研究.中医外治杂志,2017,26(5):59-61.6朱倩云,李筱青,李成网
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34、系的研究进展.中国中西医结合外科杂志,2020,26(1):170-172.Study on Preparation Technology,Fingerprint and Content Determination of Fufang Xuejie Dieda OintmentGuo Xingyu1，Yu Yuetong2，Cui Shusheng3，Sun Bo3，Zhai Enai1，Yu Shulin1，Zou Huiqin1，Yan Yonghong1(1.College of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Tra
35、ditional Chinese Medicine,Beijing 102401,China；2.Institute of Traditional Chinese Medicine,Chinese Academy of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100700,China；3.Beijing Gulou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100009,China)Abstract:Objective To prepare Fufang Xuejie Dieda Ointment,to
36、establish HPLC fingerprint and quantitatively analyze its main chemical components.Methods O/W cream was prepared,the ointment matrix formulation was optimized by central composite design-response surface methodology(CCD-RSM)and then verified by pilot samples.HPLC was used to establish fingerprint a
37、nd detect the contents of Notoginseng Radix et Rhizoma and Dipsaci Radix.ResultsThe optimal ratio of the matrix is as follows:10.7 g stearic acid,6.0 g glycerin monostearate,1.0 g sodium dodecyl sulfate and 3.3 g lanolin.The relative error according to the pilot-plant test was 2.66%,which illustrate
38、d that the matrix formulation was reasonable and stable.HPLC fingerprint showed that there were 19 common peaks in 11 batches of samples,and the similarity was above 0.9.Meanwhile,the method for determining content of Notoginsenoside R1,Ginsenoside Rg1,Ginsenoside Rb1 and Akebia saponin D was establ
39、ished.ConclusionThe ointment prepared with the optimal matrix formulation is uniform,fine and stable.The detection results of the HPLC method is reliable,which could be used in the further research on quality standard.Keywords:Ointment,HPLC fingerprint,Notoginseng Radix et Rhizoma,Dipsaci Radix,Content determination（责任编辑：李青）1810
