1、武汉工程大学学报第45卷复合菌分解低品位磷矿研究周娜1，胡锦刚1，池汝安2，肖春桥*11.武汉工程大学环境生态与生物工程学院，湖北 武汉 430205；2.武汉工程大学兴发矿业学院，湖北 武汉 430074摘要：为实现低品位磷矿资源利用，探究复合菌的解磷作用。将 4 株解磷菌，假单胞菌 LA、棘孢木霉LZ1、巨大芽孢杆菌 EC3、沙雷氏菌 LX1 进行了组合，筛选出解磷效果最佳的复合菌。研究了不同碳源、氮源及复合菌组合方式等因素对复合菌解磷效果的影响，利用单因素和正交实验优化了复合菌分解低品位磷矿的条件。研究表明复合菌 LA+EC3解磷效果最好，可溶磷质量浓度达到 397.86 mg/L；蔗糖
2、和硫酸铵分别为复合菌 LA+EC3 的最适碳源和氮源，先单菌培养再组合的方式解磷效果更好；复合菌分解低品位磷矿的最优条件为：复合菌接种量 10%、蔗糖质量浓度 10 g/L、硫酸铵质量浓度 0.5 g/L、初始 pH 5。结果表明，复合菌的解磷效果并不都优于单菌株，不同复合菌组合方式、初始接种量、初始 pH、碳源和氮源对复合菌解磷效果有显著影响。关键词：解磷菌；复合菌；低品位磷矿；分解中图分类号：TD97文献标识码：ADOI：10.19843/ki.CN42-1779/TQ.202212002Solubilization of Low-Grade Phosphate Rock by Compl
3、ex BacteriaZHOU Na1，HU Jingang1，CHI Ruan2，XIAO Chunqiao*11.School of Environmental Ecology and Biological Engineering，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430205，China；2.Xingfa School of Mining Engineering，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，ChinaAbstract：To realize the utilization of low-grad
4、e phosphorus ore resources，the phosphorus-solubilizingeffect of complex bacteria was explored.Four phosphate-solubilizing strains，Pseudomonas LA，Trichodermaaculeatus LZ1，Bacillus megaterium EC3 and Serratia LX1，were combined to select the complex bacteriawith the best effects on phosphorus solubiliz
5、ation.The effects of different carbon sources，nitrogen sourcesand the combination of complex bacteria on phosphorus solubilization were studied，and the conditions forsolubilization of low-grade phosphate ore by complex bacteria were optimized by using single-factor andorthogonal experiments.The stud
6、y showed that the complex bacteria LA+EC3 have the best effect onphosphorus solubilization，and the mass concentration of soluble phosphorus reaches 397.86 mg/L.Sucroseand ammonium sulfate are the most suitable carbon and nitrogen sources for the complex bacteria LA+EC3.The optimal conditions for the
7、 solubilization of low-grade phosphorus ore by the complex bacteria are asfollows：10%inoculum of complex bacteria，sucrose mass concentration of 10 g/L，ammonium sulfatemass concentration of 0.5 g/L，and initial pH of 5.The results showed that the phosphorus solubilizationeffects of complex bacteria ar
8、e not always better than that of single strains，and different combinations ofcomplex bacteria，initial inoculum，initial pH，carbon and nitrogen sources have significant effects on thephosphorus solubilization effect of complex bacteriaKeywords：phosphate-solubilizing bacteria；complex bacteria；low-grade
9、 phosphate ore；solubilization第45卷第5期2023年10月文章编号：1674-2869（2023）05-0536-07武汉工程大学学报Journal of Wuhan Institute of TechnologyVol.45 No.5Oct.2023收稿日期：2022-12-01基金项目：国家自然科学基金（51674178）作者简介：周娜，硕士研究生。E-mail：*通讯作者：肖春桥，博士，教授.E-mail：引文格式：周娜，胡锦刚，池汝安，等.复合菌分解低品位磷矿研究 J.武汉工程大学学报，2023，45（5）：536-542.第5期磷是作物生长发育不可或缺的
10、元素，全国第二次土壤普查结果显示我国 75%的土壤缺磷1。化学磷肥的主要来源为磷矿石作为我国重要的产业原料和支农工业，磷矿资源在我国的经济发展中占据着重要地位2-3。我国磷矿总量虽然位居世界第二，但多数品位不高4-6，中低品位磷矿占到 80%以上，这些磷矿难以分选和加工而成为高浓度磷肥或复肥7。我国中低品位磷矿的利用主要有选矿法、湿法、热法、微生物法等8-12。其中，传统的化学方法对设备、技术水平要求较高，且工艺大都较为复杂，易造成严重的污染问题13。与化学方法相比，微生物浸矿具有对环境友好、易操作成本低等特点14。解磷微生物能够通过分泌有机酸、质子交换、酶解作用等机制将难溶性的磷转为可溶性的
11、磷15，因此解磷微生物能够充分利用中低品位磷矿，避免资源的浪费，缓解精矿缺乏的难题16。20世纪 90年代，我国就开始使用具有解磷能力的菌剂，目前关于解磷微生物的研究包括有解磷微生物对难溶性磷的分解能力、机理及应用等17-19。除了对环境友好、节约矿产资源之外，将解磷菌及磷矿粉施入土壤，能够增加土壤中的磷素20-22。同时可以增产作物提高作物抗逆性，固定土壤重金属等23-25。但迄今为止大多数研究都针对单一菌种，对复合菌的研究较少。微生物之间具有多种相互作用如协同、竞争、拮抗和寄生等，在复合菌中一种菌株的代谢产物或可作为其他菌株的能源物质相互促进生长，多种菌株共同作用能够促进污染物降解26，相
12、比于单菌，复合菌功能更加稳定高效27。基于上述背景，本研究选用了 4 株解磷菌进行组合，筛选出解磷效果最佳的复合菌，并对该复合菌分解磷矿粉的条件进行了优化。为复合菌在高效分解磷矿粉的应用提供了参考。1实验部分1.1实验材料1.1.1低品位磷矿磷矿粉：实验中所用低品位磷矿粉为来自湖北省宜昌市，将磷矿石磨碎过筛后取粒径为0.0740.150 mm之间的磷矿粉作为实验磷矿粉。低品位磷矿组成如表1所示。表1低品位磷矿粉的主要组成及质量分数Tab.1Main components and mass fractions of low-grade phosphate ore%P2O518.98MgO1.27
13、SiO226.94CaO33.55Fe2O32.52Al2O35.08K2O2.42MnO0.025Na2O0.86F0.0031.1.2实验菌株实验菌株为本实验室从湖北省宜昌某磷矿废弃地中筛选的解磷菌株，分别为假单 胞 菌 LA（Pseudomonas LA），棘 孢 木 霉 LZ1（Trichoderma aculeatus LZ1），巨大芽孢杆菌 EC3（Bacillus megaterium EC3），沙雷氏菌LX1（SerratiaLX1）。为方便后续实验，依次编号为A、B、C、D。1.1.3培养基LB培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，蒸馏水 1 000
14、 mL，pH 7.0。PKO培养基：葡萄糖 10.0 g，酵母浸粉 0.5 g，（NH4）2SO40.5 g，KCl 0.2 g，MgSO47H2O 0.1 g，CaCl21.0 g，FeSO4 7H2O 0.03 g，Ca3（PO4）25 g，蒸 馏 水1 000 mL，pH 7.0。磷矿粉培养基：葡萄糖10.0 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO47H2O 0.3 g，KCl 0.3 g，NaCl 0.3 g，FeSO47H2O 0.03 g，磷矿粉 10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。1.2实验方法1.2.1解 磷 复 合 菌 筛 选将 假 单 胞 菌 LA（Pseu
15、domonas LA），棘 孢 木 霉 LZ1（Trichodermaaculeatus LZ1），巨 大 芽 孢 杆 菌 EC3（Bacillusmegaterium EC3），沙雷氏菌 LX1（Serratia LX1），分别在 LB培养基内培养至对数期，按照表 2复合菌株组合方案，取菌液总量为4 mL，各菌株间菌液体积比为1 1，接入至含50 mL PKO培养液的锥形瓶中，将锥形瓶置于恒温摇床中，30、165 r/min培养7 d，在第3、5、7 d取样测量pH、可溶磷质量浓度，重复3次。表2菌株的组合方案Tab.2Schemes of strains combination编号1234
16、5678组合方案CKABCDABACAD编号910111213141516组合方案BCBDCDABCABDBCDACDABCD周娜，等：复合菌分解低品位磷矿研究537武汉工程大学学报第45卷1.2.2不同复合菌组合方式对复合菌解磷效果的影响组合方式：先培养后组合：将各菌株先在不同LB培养基中分别培养至对数期，再各取1 mL菌液进行混合，接入含 50 mL PKO 培养基的锥形瓶中培养；先组合再培养：将各菌株接入同一LB培养基培养至对数期，再取等量混合培养菌液至含 50 mL PKO培养基的锥形瓶中培养。选取 3组解 磷 效 果 最 好 的 解 磷 复 合 菌 进 行 上 述 实 验，30、16
17、5 r/min 培养 7 d，每天取样测量可溶磷质量浓度。1.2.3碳源和氮源对复合菌解磷效果的影响以PKO培养基为基础，选取解磷效果最佳的复合菌，控制单一变量，分别在不同碳源（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和果糖）和不同氮源（尿素、硫酸铵、氯化铵和蛋白胨）条件下，将筛选出的最佳解磷复合菌于 30、165 r/min恒温摇床中培养 7 d，测定可溶磷质量浓度。1.2.4复合菌分解低品位磷矿的条件优化单因素实验：以解磷效果最佳的复合菌进行实验，在不同接种量（4%、10%、15%、20%和 25%）、初始 pH（5、6、7、8和9）、碳源质量浓度（0、5、10、15和20 g/L）和氮源质量浓度（0.2
18、、0.3、0.4、0.5 和 0.6 g/L）条件下，于30，165 r/min将解磷复合菌在磷矿粉培养基种培养 7天，测定可溶磷质量浓度。正交实验：根据单因素实验结果，选取对复合菌解磷影响较大的因素设计正交实验，具体见表3。表3复合菌解磷条件优化正交实验设计Tab.3Orthogonal experimental design for optimization ofphosphate solubilizing conditions by complex bacteria实验序号123影响因素接种量/%41015pH579碳源质量浓度/（g/L）51015氮源质量浓度/（g/L）0.30.40
19、.51.3测试方法用梅特勒 Seven Compact pH 计 S210 测量待测样的 pH值；利用钒钼酸铵比色法检测可溶磷质量浓度；用 Excel 2019、SPSS 18.0和 Origin 2019进行了数据分析和作图。2结果与讨论2.1解磷复合菌筛选由表 4 可知，复合菌 AB、AC 和 ABC 在第 5 d的适合可溶磷质量浓度分别为 354.30、397.86 和347.51 mg/L，均高于单菌，菌株 ABC 间具有良好的协同作用。同时，复合菌的解磷效果并不都优于单菌株。菌株 D与菌株 ABC复合时，可溶磷质量浓度均低于单菌，表现出强的拮抗作用。由此并不是组合内的菌株越多，解磷效
20、果就越好28，表4不同组合复合菌解磷效果Tab.4Phosphate solubilizing effects of different complex bacteria编号123456789101112131415处理CKABCDABACADBCBDCDABCABDBCDACDABCD3 d可溶磷质量浓度/(mg/L)4.623.04156.1312.6689.7614.98130.0613.52110.3213.21172.155.34119.5324.6614.01 12.1312.5521.1210.4911.5613.1822.44241.35 5.8864.5923.4221.22
21、 14.1116.13 12.1022.2411.73pH7.830.075.890.126.780.105.870.226.210.116.040.144.960.127.480.126.940.157.800.167.370.086.240.245.970.137.700.217.680.267.250.125 d可溶磷质量浓度/(mg/L)4.752.13323.2213.23220.884.55316.3726.17163.7415.62354.3019.66397.8629.0542.082.4635.463.3112.542.2320.021.03347.5119.82278.50
22、26.5425.501.8226.442.3373.28 3.19pH7.830.134.020.115.230.244.660.316.170.135.030.213,820.515.860.156.280.127.150.026.980.024.860.225.490.227.520.125.810.287.130.047 d可溶磷质量浓度/(mg/L)4.981.12319.347.32189.5612.05220.5825.64162.5115.24200.0326.32371.5744.4431.952.1021.341.228.850.9621.11 2.56296.5534.63
23、263.06 57.1434.422.2010.55 1.73104.584.57pH7.820.113.990.325.110.114.530.156.20.115.140.214.020.346.370.116.590.017.200.097.100.026.110.135.680.266.120.017.020.147.110.21538第5期这与菌株间的相互作用有关，需要进一步研究。利用相关分析发现可溶磷质量浓度和 pH 之间呈显著负相关（r=-0.840，p0.01）。菌液中的pH值越低，解磷效果相对越好。通过分泌有机酸来分解难溶性磷酸盐是解磷微生物的主要解磷途径之一，这与秦利均等2
24、9的研究结果一致，分解程度与酸度密切相关，即菌株产酸能力越强，酸度越大，可溶磷质量浓度越高，反之越低。2.2不同复合菌组合方式对复合菌解磷效果的影响从图1中可以看出，先培养后组合解磷效果明显优于先组合后培养（p碳源质量浓度氮源质量浓度初始 pH，其中最优方案组合为复合菌AC的接种量（10%）、碳源质量浓度（10 g/L）、氮源质量浓度（0.5 g/L）、初始pH 5。图2不同碳源和氮源对可溶磷质量浓度的影响Fig.2Effects of different carbon and nitrogen sources onmass concentration of soluble phosphate
25、图3单因素实验结果：（a）接种量，（b）pH，（c）碳源质量浓度，（d）氮源质量浓度Fig.3Single-factor experiment results：（a）inoculationamount，（b）pH，（c）carbon source mass concentration，（d）nitrogen source mass concentration540第5期3结论（1）复合菌 AB、AC 和 ABC 在第 5 d的可溶磷质 量 浓 度 达 到 最 高，分 别 为 354.30、397.86 和347.51 mg/L，均高于单菌，菌株 ABC 间具有良好的协同作用。复合菌的解磷效果并
26、不都优于单菌株。菌株 D与菌株 ABC复合时，其可溶磷质量浓度均低于单菌，表现出强的拮抗作用。菌株的解磷能力与菌株的产酸能力显著相关。（2）不同复合菌组合方式对复合菌解磷效果有显著影响。以先培养后组合的方式组合的复合菌解磷效果明显优于以先组合再培养的复合菌解磷效果。复合菌AC解磷效果最佳，且解磷效果最稳定。（3）筛选出了解磷效果最佳且最稳定的复合菌株AC，即假单胞菌LA（Pseudomonas LA），巨大芽孢杆菌 EC3（Bacillus megaterium EC3）。该组复合菌株在第5 d可溶磷质量浓度可达397.86 mg/L，后续实验表明其解磷效果稳定。同时，复合菌AC的最适碳源和氮
27、源分别为蔗糖和硫酸铵。（4）单因素实验表明初始接种量、初始 pH、碳源质量浓度和氮源质量浓度对复合菌 AC 解磷效果有显著影响。综合正交试验分析发现，影响复合菌 AC 解磷效果的影响因子主次顺序为：接种量 碳源质量浓度氮源质量浓度初始 pH，复合菌分解低品位磷矿的最优条件为：复合菌接种量10%、蔗糖质量浓度10 g/L、硫酸铵质量浓度0.5 g/L、初始pH 5。参考文献1 刘垒，范道春，薛胜平.生物磷肥的研究进展 J.磷肥与复肥，2018，33（4）：13-14，17.2 赵玉凤，李文超，王海军.中国磷矿资源开发利用现状与思考 J.产业创新研究，2021（16）：62-63，69.3 周文雅
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30、complex bacteria culture conditions编号123456789均值1均值2均值3R最优水平主次顺序最优参数A（接种量）/%444101010151515246.2254.0182.971.22ACDBA2B1C2D3B（初始pH）579579579237.9228.9216.321.71C（碳源质量浓度）/（g/L）510151510510515189.6253.7239.964.12D（氮源质量浓度）/（g/L）0.30.40.50.50.30.40.40.50.3219.6213.7249.936.23可溶磷质量浓度/（mg/L）210.1312.43259.
31、3225.51269.0515.42312.3822.36259.3334.96190.4112.33191.2225.11168.1323.56189.3114.28周娜，等：复合菌分解低品位磷矿研究541武汉工程大学学报第45卷中低品位磷矿的浸磷效率研究 J.矿物学报，2011，31（2）：280-283.12 苗俊艳，王艳语，许秀成.中低品位磷矿及磷尾矿的综合利用现状 J.硫磷设计与粉体工程，2019（6）：4，11-13，27.13 孙伟，渠光华，王大鹏.磷矿的微生物浸出研究进展 J.矿产保护与利用，2021，41（4）：50-58.14 林燕青，吴承祯，洪伟，等.解磷菌的研究进展 J
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