1、28 2023.9试验研究0 引言乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸是畜禽养殖中常见的有机酸1。有机酸在饮用水中添加非常关键，能够为生物体提供能量，参与免疫调节，调控肠道细胞代谢，平衡肠道电解质2，提高畜禽抵抗力和生存率，在替抗减锌的新形势下有重要意义，但高浓度有机酸又会损害畜禽肌体黏膜组织，影响畜禽生长。因此有机酸的检测对畜禽饮用水科学配伍上起到一定数据支撑。用于有机酸的测定方法很多，如分光光度法3、电位滴定法4、高效液相5、气相色谱法6、液相质谱法7、离子色谱法8等。但这些方法一般需要对样品进行预分离或衍生化，操作繁琐，大量使用有机试剂对人员环境影响大，且同时分离检测机酸种类较少。
2、离子色谱是一种用于分析阴、阳离子和小分子极性化合物的新型液相色谱分析技术，由于其操作简单、分析快、高灵敏度、绿色环保等突出优势，在环境、能源电力、食品、生物医药等领域有广泛的应用。1 试验方法1.1 仪器与材料仪器为ICS-1100离子色谱仪（美国Dionex公司）包括分析柱：IonPac AS11-HC（4 mm250 mm），保护柱：IonPac AG11-HC（4 mm50 mm），抑制器：收稿日期：2023-07-19作者简介：李延隆（1989-），女，河北承德人，工程师，研究方向：畜牧环境检测及推广。*通信作者简介：陈宜军（1966-），男，北京人，工程师，研究方向：畜牧环境技术推广
3、与服务。李延隆，陈宜军固相萃取离子色谱法测定畜禽饮用水中7种有机酸J现代畜牧科技，2023，100（9）：28-30doi:10.19369/ki.2095-9737.2023.09.008LI Yanlong，CHEN YijunDetermination of 7 Organic Acids in Livestock and Poultry Drinking Water by Solid Phase Extraction-ion ChromatographyJModern Animal Husbandry Science&Technology，2023，100（9）：28-30固相萃取离子
4、色谱法测定畜禽饮用水中7种有机酸李延隆，陈宜军*（北京市畜牧总站，北京 100020）摘要：该文建立非梯度离子色谱测定畜禽饮用水中乳酸、甲酸、乙酸等7种有机酸的方法。方法采用常见阴离子测定的AS11-HC（4 mm250 mm）分析柱和AG11-HC（4 mm50 mm）保护柱，以1 mmol/L NaOH为淋洗液，流速为1.0 mL/min，柱温为30 的色谱条件，该方法的重复性（RSD）为0.77%1.35%，相关系数r2为0.999 10.999 9，最低检出限为1.7310-31.3810-2 mg/L。在此基础上测试H柱，RP柱等8种SPE柱对有机酸的损失情况。结果表明此方法能在较短
5、时间里对7种有机酸进行分离测定，试验结果与梯度法没有明显差异。关键词：畜禽饮用水；离子色谱；有机酸；非梯度；SPE柱中图分类号：S815文献标识码：Adoi：10.19369/ki.2095-9737.2023.09.008Determination of 7 Organic Acids in Livestock and Poultry Drinking Water by Solid Phase Extraction-ion ChromatographyLI Yanlong，CHEN Yijun*（Beijing General Station of Animal Husbandry，Beij
6、ing 100020，China）Abstract：A non-gradient ion chromatography method was established to determine seven organic acids，including lactic acid，formic acid，acetic acid，in livestock and poultry drinking waterThe method utilized the AS11-HC（4 mm250 mm）analytical column and AG11-HC（4 mm50 mm）guard column co
7、monly used for anion determination，with 1 mmol/L NaOH as the eluent，a flow rate of 1.0 mL/min，and a column temperature of 30 The repeatability（RSD）of this method ranged from 0.77%to 1.35%，with correlation coefficients（r2）between 0.999 1 and 0.999 9The lowest detection limits were 1.7310-3 to 1.3810-
8、2 mg/LIn addition，eight different solid-phase extraction（SPE）columns，including H columns and RP columns，were tested for their potential loss of organic acidsThe results showed that this method can effectively separate and determine the seven organic acids within a relatively short time，the experimen
9、tal results were not significantly different from the gradient methodKeywords：livestock and poultry drinking water，ion chromatography，organic acids，non-gradient，SPE column292023.9试验研究ASRS 500（4 mm），PELL纯水机。试 剂：N a O H（5 0%），乳 酸（9 9.0%，ANPEL）、甲酸（99.0%，ANPEL）、乙酸（99.0%，ANPEL）、丙酸（99.0%，ANPEL）、丁酸（99.0%，A
10、NPEL）、戊酸（99.0%，ANPEL）、异戊酸（99.0%，ANPEL）均为色谱级标准品。材料：0.45m滤膜（ANPEL），SPE柱包括C18（CNW）、P（CNW）、H（CNW）、Ag（CNW）、Ba（CNW）、Na（CNW）、RP（CNW）。1.2 方法1.2.1 标准溶液配制、样品采集及样品前处理标准储备溶液：分别配制乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸浓度为1 000 mg/L的储备液，于4 下保存备用。根据NY 50272008无公害食品 畜禽饮用水水质中5.1水样的采集与保存要求，对养殖场饮用水进行采样保存。配制已知浓度标准溶液作为模拟样品，过0.45 m滤膜后迅速进样
11、。上述同样的模拟样品，根据SPE柱填料不同的分别进行使用前活化平衡，样品过柱后准备上级分析。1.2.2 色谱条件分析柱为AS11-HC（4 mm250 mm），保护柱为AG11-HC（4 mm50 mm），以NaOH作为淋洗液，浓度1.0 mmol/L，流速为1.0 mL/min，柱温为30 进行检测。1.2.3 标准曲线绘制分别移取标准储备液进行稀释，得到不同浓度标准混合液，浓度分别为0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 mg/L。2 结果与讨论2.1 色谱条件的确立在常见阴离子测定中普遍使用30 mmol/L的淋洗液进行洗脱，但由于本次试验的7种有机酸均保留性较弱，保留时间短
12、，因此需要选择浓度较低的淋洗液，于是在0.55 mmol/L进行测试，结果显示在5 mmol/L时乳酸和乙酸，甲酸、丙酸和丁酸出峰不能完全分离。在0.5 mmol/L时甲酸出峰时间延长会与丁酸叠峰。经探究发现淋洗液流速在0.8 mL/min时，分离度最好，但在1.0 mL/min的流速下，既能保证峰的分离度还能进一步缩短出峰时间。如图1所示，以NaOH为流动相，浓度为1 mmol/L，流速1.0 mL/min的色谱条件下，完整检测过程为40 min，7种有机酸可以做到基线分离。2.2 色谱条件的优化待测目标为有机酸，在仪器配件中，AS11-HC这种高容量、高效率色谱柱可对复杂样品基质内的多种有
13、机酸和无机阴离子实现有效分离。图2为日常测定阴离子时出现明显的出峰前移，出峰没有影响，但在测定有机酸这种出峰早，保留短，需要低浓度洗脱，洗脱时间长的实验中可以大幅缩短检测时间。图1 7种有机酸的标准色谱1：乳酸；2：乙酸；3：丙酸；4：甲酸；5：丁酸；6：异戊酸；7：戊酸图2 日常测定阴离子出峰时间变化14：出峰前移时间；14：正常出峰时间2.3 前处理方法选择样品前处理方法主要有超声辅助提取（UAE）9、液液萃取（LLE）10、膜萃取（ME）、固相萃取（SPE）11等。但超声辅助提取需要单独购买设备，占地比较大。液液萃取操作繁琐且费时费力，并且使用了大量有毒的有机溶剂，对人类健康和环境构成危
14、害。膜萃取缺乏高效萃取拆分剂，不能能动控制和强化萃取拆分过程。固相萃取是一种物理提取过程，基于液固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、净化。大大提高检测灵敏度，比液液萃取更快，更节省溶剂，可自动化批量处理。综上所述，选择SPE柱作为前处理方式。2.4 仪器方法验证2.4.1 标准曲线每个浓度样品分别测定3次，取3次所得峰面积的平均值，以峰面积（Y）为纵坐标，物质浓度（X）为横坐标建立7种有机酸的标准曲线，各组份标准曲线方程、线型范围、相关系数，见表1。9080706050403020100-10112S20.001.252.503.755.006.257.508.
15、7510.00min3344S0.900.800.700.600.500.400.300.200.100.00-0.1015260.0 5.010.015.020.025.030.035.040.00min37430 2023.9试验研究2.4.2 检出限及定量限以线性范围中最低浓度的信噪比3倍计算得到检出限，10倍得到定量限，结果见表1。2.4.3 空白加标回收率及重复性向空白水样中加入各组分浓度为10.0 mg/L的标准混合溶液，进行6次重复测定。由表1可以看出该方法线性良好，检出限及定量限均低于其他检测方法，加标回收率异戊酸略低但同样符合一般标准中80%120%的要求，重复性在0.771
16、.35，表明此方法稳定可靠，综上可知此方法能够满足进一步样品测定需求。2.5 实际样品测定按照建立好的方法对畜禽饮用水进行检测，检测结果表明乳酸、丁酸、乙酸、丙酸在部分养殖场有不同程度的低浓度检出，可能是饲料添加剂中的有机酸污染了饮用水，为后续养殖场科学布局、科学饲养提供研究基础。2.6 SPE柱效果比较根据1.2.1的前处理方法对0.45 m滤膜和7种SPE柱的过柱样品进行3次重复测试，平均回收率见表2。表1 线性方程、相关系数、检出限、定量限、平均加标回收率、重复性组分线性方程相关系数R2检出限LOD（mg/L）定量限LOQ（mg/L）平均加标回收率（%，n=6）RSD（%，n=6）乳酸Y
17、=0.057X-0.0120.999 52.6710-38.8910-399.51.35乙酸Y=0.073X+0.0000.999 11.7310-35.7510-399.20.94丙酸Y=0.060X+0.0000.999 22.5810-38.5810-399.00.62甲酸Y=0.078X-0.0130.999 42.4210-38.0510-399.10.77丁酸Y=0.051X-0.0050.999 54.4210-31.4710-299.61.11异戊酸Y=0.043X-0.0050.999 31.3810-24.6110-298.31.33戊酸Y=0.041X-0.0110.99
18、9 93.3210-31.1110-299.50.90由表2可以发现，样品在经过0.45m滤膜时，各组分的平均回收率在99.1%101.3%，有较好保留效果，损失较低。P柱对各组分的清除效果最好，回收率最高只有17.3%。横向比较来看，除了P柱，乳酸、乙酸、甲酸在其他SPE柱中均有较好的回收率；丙酸在RP柱中回收率较差；在丁酸、异戊酸和戊酸中，刨除0.45 m滤膜，其他的SPE柱的回收率出现明显降低，如果考虑去除样品中的这3种酸可以使用C18柱、RP柱及P柱。表2 各组分在前处理后所得回收率 单位：%组分0.45mAgBaC18HNaPRP乳酸99.6106.8103.2101.896.195
19、.203.3106.6乙酸99.798.294.6114101.9104.10 17.3 115.4丙酸99.597.698.497.299.898.8010.875.9甲酸99.2102.5106.4105.295.095.509.4106.9丁酸101.390.889.733.492.188.201.81.4异戊酸99.189.782.38.889.285.90N1.1戊酸99.731.666.46.582.075.90N1.5注：N为未检出。3 结论目前离子色谱测定有机酸多数都是用梯度淋洗的方法进行，但试验方法往往受到仪器条件制约，可能仪器不具备梯度淋洗的条件或者受耗材限制。本文采用戴安
20、公司的ICS-1100型离子色谱系统，建立了适用于无梯度的老机型，同时利用已淘汰的分析柱缩短检测时间，可以同时准确高效的检测畜禽饮用水中的乳酸、甲酸等7种有机酸。结果表明此方法重复率好、特异性强、灵敏度高与梯度法8无明显差异，方法具备较强的通用性。在前处理上，由于很多样品基质复杂，需要用到一种或以上的SPE柱，本文对常用的8种SPE柱进行回收率比较，为样品组分的净化还是去除提供数据支持和研究基础。参考文献1王良，盛文文，王磊，等不同类型脂肪酸的代谢特点与生理功能及其在猪生产中的应用研究进展J畜牧与兽医，2019，51（12）：135-1392陈福，何邵平，田科雄，等短链脂肪酸的生理功能及其在畜
21、禽生产中的应用J动物营养学报，2019，31（7）：3 039-3 0483陈峰二阶导数红外分光光度法同时定量分析有机酸、酯J分析实验室，1994，13（3）：41-434王惠敏，王英，樊艳茹电位滴定法测定消食化滞液中总有机酸的含量J宁夏医学杂志，2019，41（11）：984-986，9605马倩，肖依文，汪涯，等HPLC同步测定南丰蜜桔成熟过程中9种有机酸J食品工业，2019，40（3）：306-3106Darko E，Thurbide K B Active control of selectivity in organic acid analysis by gas chromatogra
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