1、试验研 究 ，鸡传染性支气管炎病毒血清学和分子生物学检测技术研究进展李倩青海民族大学预科教育学院，青海 西宁 摘要鸡传染性支气管炎病毒（，）是一种致病性较强的病毒，不仅严重损害鸡的呼吸道，还会对其他器官造成影响，早发现、早治疗是防治该病出现大规模传播的重要手段。为了更好地防治该病，研究者们一直致力于建立快速准确的检测技术，特别是在血清和分子水平上。对传染性支气管炎（，）实验室检测技术的相关研究和优缺点进行了综述。在实际检测过程中，应结合具体情况，选择正确的方法，确保测试结果的准确性。关键词鸡传染性支气管炎病毒；血清学检测；分子生物学检测 ：?引言鸡传染性支气管炎病毒（，）的致病性比较强，且传播
2、范围广，传染速度快，不仅会对鸡的呼吸道和消化道产生极其严重的损害，还会对鸡群的生产性能产生影响，严重的可导致死亡。此外，病毒还会对繁殖系统产生损害，使输卵管永久性的退化。因 血清型别较多，且各血清型别之间缺少有效的相互防护，新毒株产生时会导致机体对 的免疫力降低。为寻找快速准确的检测方法，从血清学和分子生物学方面进行研究，是防控鸡传染性支气管炎（，）的重要研究内容。?血清学检测技术 常用检测技术及其方法比较 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（，）法操作步骤比较简单，对于病毒的检测比较准确。从 年 等人创立了 技术后，因其灵敏度高、特异性强、操作简单、快速而被广泛用于各种动物病的诊断与免疫分析。
3、美国、英国、日本在该技术的使用方面比较先进，都有相应的商业测试工具。在我国已有文献报导，利用免疫层析技术，将整个病毒包裹在一块反应盘上，用间接 法对鸡群进行检测。庄金秋 等 利用微分离心 非连续浓度梯度蔗糖离心 琼脂糖凝胶层析法，既能保证核酸质量，又能减少由于蔗糖浓度梯度导致的核酸丢失，从而增强核酸酶联免疫吸附试验的可信度。病毒中和试验病毒中和试验（，）主要针对鸡胚进行使用，采用气道环法，是一种在早期使用的鉴定方法，能够对 进行检测。刘秀芹 等 利用气道环切法，对山东地区 病毒的血清型别进行了鉴别，并取得了较好的效果。尽管此法具有良好的敏感性和特异度，但是其存在步骤繁琐、费时费力、对实验条件要
4、求苛刻等缺点。琼脂扩散沉淀法琼脂 扩 散 沉 淀 法（，）是一种快速、简便、特异性强的方法，自从这一方法被提出后，在 的血清学分析中得到了广泛的使用。在鸡群体中，病毒的阳性比率升高，表明存在 的感染，可在此基础上，对其进行抗体的配制。目前已有多种疫苗和疫苗的制备技术，既能保持病毒的完整，又能增强 检测的特异性。另外，用受感染的小鸡的气道分泌液作抗原，用 与一种已知的抗体结合，可以发现分泌液中所含的病毒。琼脂扩散试验抗原是由鸡胚胎中致命的博德特利菌系来生产的。不同免疫状态下 种血清检测法的比较对 只试验鸡进行第 次疫苗注射，后采血进行初免抗体检测，同时对这 只鸡进行第 次疫苗注射，后采血进行二免
5、抗体检测。对照组 只鸡 年第 期（总第 期）畜禽业试验研究未进行疫苗注射，在同时期采血作为阴性血清。表 显示出 种检测方法检测效果有区别，主要在于敏感性不同。法检测一免、二免的鸡血清中，血清中的血清学检测阳性率均为 ；检测结果显示免疫组之间差别较大；在一免和二免 种抗体中，的阳性率分别为 和 。表 不同免疫状态下 种血清学方法检测结果比较免疫状态 阳性 份阴性 份阳性率 阳性 份阴性 份阳性率 阳性 份阴性 份阳性率 初免 二免 阴性对照 种血清学方法检测结果之间一致性的计算通过对 种方法进行对比，得出了反映这 种方法两两之间相关性的 值。在 值为 时，表明这 种方法的符合度是 ，而在 值为时
6、，表明这 种方法的符合度是 。从表 可以看出，与 的 值是 ，与 之间的 值是 ，而 与 之间的 值是 ，这 者之间的符合度是最低的。表 三种血清学方法检测结果之间一致性的 值的计算项目比较 比较 比较 观察的一致性比例 偶然的一致性比例 值 注：比较 为 ；比较 为 ；比较 为 其他血清检测方法 血凝和血凝抑制试验血凝试验（，）是一种灵敏、特异的检测方法。蔡俊呈 等 研究表明，型磷酸酯酶 对 具有较强的凝血能力，且该凝血能力可被特异的抗血清阻断。后来，研究者将这一理论进行深入研究，提出了简便、准确的检测技术，阿克赛德使它规范化。这一技术已被公认为最有希望作为一种标准技术来监测产品中 抗体含量
7、的改变。已有研究表明，在 中，胰蛋白酶、卵磷脂酶 和乙醚等对 种血球有不同的凝集作用。的血液凝聚能力与 、有关，的 蛋白的血液凝聚能力最强，而甲醛对 蛋白的杀伤作用最强。对于 的凝集作用，人们普遍认为可能与其与 病毒表面上的 ，位点上的半乳糖链相连所形成的一种唾液酸的结构有关。血凝抑制试验（，）是临床上使用较多的一种检测方法。的检测技术在养殖业使用更加切合实际，也更加节省时间和精力。然而，因为 抗原的制备过程非常繁琐，还需要超速离心，而且要进行长时间的冷冻存。且需要根据病毒的浓度进行使用，抗原具有不稳定性，该种技术还没有形成统一的使用规范，还有待于更多的改进。荧光抗体技术荧光抗体技术（，）在
8、血清学诊断方面应用比较多，也可以用于免疫学诊断。布劳恩赫公司第一个将萤光抗体技术用于鸡群诊断检测，在感染了急性疾病的鸡气道上使用萤光标记的抗体来侦测 。有研究者利用实验制备了抗原，对不同感染类型的鸡进行检测，发现在 内，人工感染的鸡的肾中 出现了特异的荧光，而在其他时候，也有一些鸡出现了特异的荧光。经人工接种后，所有病死鸡的肾中都出现了 的特异荧光；在人工侵染的鸡胚中 出现特异的荧光。在 个天然感染的样本中，有 个样本的免疫反应呈阳性，该技术检测免疫反应与传统技术监测免疫反应的结果一致，且大大缩短了免疫反应过程，适用于临床诊断和疫苗免疫反应的监控。目前，被公认为是一种简单、快速可靠、敏感度高、
9、价格低廉的 诊断技术。胶体金免疫层析技术胶体金免疫层技术（）是一种操作比较简单的方法，使用的时候不需要其他仪器的辅助，这种方法具有很好的开发价值，未来的使用前景较好。但该方法需要抗体的含量比较高，而且抗体都必须具有很好的活性。吴忆春 在相关实验中，研制出了一种试验研 究 ，新型的 免疫胶体金检测试剂盒，该试剂盒可用于禽流感的早期检测、预防和治疗，并可对其他家禽呼吸系统疾病进行快速检测。?分子生物学检测方法 逆转录 聚合酶链反应逆转录 聚合酶链反应技术（，）是一种准确度较高的检测方法，可以对不同的病毒亚型进行检测，对一种血清进行检测的时候，检测结果不受其他亚型的影响。而且还可以针对一些差别很大的
10、菌种，进行特异性引物的筛选。对于突变频率高的病毒，可以对其进行血清型和基因分型；对于 、等保守区，可以对其进行群体特异的扩增。唐第深 以 的 区段为基础，通过设计引物，采用 技术，对 的 区段进行了检测。有研究者以 毒株 的基因序列为基础，通过 技术，对 毒株进行了 技术的研究。利用 强、弱毒疫苗毒株的序列特点，通过对其 基因多变区进行扩增，扩增出的基因片段能够提升检测的准确性，这是一种复合鉴定技术，是一种很好的技术诊断方式。环介导逆转录等温扩增技术环介导逆转录等温扩增技术（，）是一种基于 的快速、灵敏、新颖的核酸分析技术，适用于养殖场检测。有研究者以 型株为研究对象，以 技术为基础，采用 技
11、术对 型株进行鉴定，结果表明该技术对 型株的检出率高于 ，且特异性强、灵敏度高。研究者分别以 为参考，以 为参考，以 为参考，用 技术对 进行了研究。核酸探针技术有研究者对 免疫后的鸡支气管内 全基因组进行了分析。在免疫后第 、天时，利用 方法对其进行了扩增，并通过荧光素酶报告基因进行了定点杂交验证。核酸探针技术的应用为病毒的检测提供了新的方法，进一步提升不同群体的检测准确度。在 个群体中，电子显微镜检出 个群体，其中 个群体可用 法检出。核酸探针技术用于 基因的检测具有迅速特性，全部处理时间不大于 。在对该基因的检测过程中，需要确定基因的位点，基因四位点构建了一种 快速测定方法。与 扩增法比
12、较，种试验均显示：在最初的感染过程中，该病毒对细胞内的细胞有广泛的嗜性，并随着时间的推移和其自身的特点而逐渐向目标器官转移。基因芯片技术基因芯片技术是以先进的芯片技术为基础研发出来的一种检测技术，该技术具有高通量、检测结果比较客观等优点。现在已成功地建立了 和 的基因芯片。双荧光定量 技术，将非对称 技术与基因微阵列技术相融合，并通过增大 标签引物的密度，使微阵列与目标基因的杂交更加高效，更好地实现了对目标基因的检测。该技术可突破传统生物分析手段只能对几个目标基因进行快速、准确测定的局限，降低了分析结果的主观性，并可实现对不同类型的混杂传染病的同步诊断。?结束语 的血清型别较多，变种层出不穷，
13、不同种血清型之间的相互保护性较差，造成了机体的免疫应答失效，给 的防控带来了困难。近年来，国内外对 的血清学和分子生物学检测技术进行了大量的研究，但是各种检测技术都有各自的优势和不足。在实际的养殖和临床研究中，需要根据实际情况选用合适的检测方法，情况比较复杂时，需要联合使用 种或多种检测方法。随着在分子水平上更加深入的研究，检测技术将不断发展。参考文献：庄金秋，阮震，张颖，等 鸡传染性支气管炎病毒血清学和分子生物学检测技术研究进展 中国动物检疫，（）：刘秀芹 鸡传染性支气管炎的流行病学，临床症状和免疫预防 养殖技术顾问，（）：龚振华，金国栋，王丽萍，等 鸡传染性支气管炎的免疫防控研究进展 动物医学，（）：蔡俊呈，任涛，陈礼斌，等 鸡传染性支气管炎病毒研究进展 广东畜牧兽医科技，（）：吴忆春 鸡传染性支气管炎病毒 基因型毒株的分离鉴定与致病性分析 黑龙江畜牧兽医，（）：唐第深 鸡传染性支气管炎诊断治疗措施 中国畜禽种业，（）：作者简介：李倩（），女，河北泊头人，硕士研究生，讲师，研究方向：生物化学与分子生物学。
