1、2023年第45卷第9期China Poultry Vol.45，No.9.2023预防兽医预防兽医鸡源鸡源EphrinAEphrinA2 2基因的克隆表达基因的克隆表达及其单克隆抗体研制及其单克隆抗体研制相汝苹1，2，3，4，姚晓慧1，2，3，4，谢泉1，2，3，4，万志敏1，2，3，4，邵红霞1，2，3，4，秦爱建1，2，3，4，叶建强1，2，3，4，李拓凡1，2，3，4*（1.扬州大学兽医学院，禽类预防医学教育部重点实验室，江苏省动物预防医学重点实验室，江苏扬州225009；2.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009；3.扬州大学农业科技发展研究院（国际联
2、合实验室），江苏扬州225009；4.教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏扬州225009）摘要：研究旨在研制抗鸡EphrinA2蛋白的特异性单克隆抗体。试验用PCR和同源重组技术构建了鸡EphrinA2真核及原核表达载体，以纯化的EphrinA2原核表达产物免疫小鼠，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，用间接ELISA方法筛选出阳性细胞克隆；用SDS-PAGE、间接免疫荧光试验和Western blot验证表达产物及单抗的特性。结果显示：原核表达的重组蛋白His-EphrinA2-RBD主要位于细菌包涵体中；获得2株能稳定分泌抗EphrinA2蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株，分别
3、命名为4H6和1G9；单克隆抗体4H6不仅能特异性识别真核表达载体pcDNA3.1-EphrinA2在DF-1细胞中表达的EphrinA2蛋白，而且能有效识别LMH和DF-1细胞中内源性的EphrinA2蛋白。结果表明，单克隆抗体4H6与鸡EphrinA2蛋白反应性和特异性均良好，能够应用于鸡EphrinA2相关基础研究。关键词：鸡源EphrinA2；蛋白表达；单克隆抗体；间接免疫荧光试验；Western blot中图分类号：S855.3文献标识码：A文章编号：1004-6364（2023）09-25-06收稿日期：2022-09-28；修回日期：2022-12-12基金项目：江苏省自然科学基
4、金青年项目（BK20220579）；中国博士后科学基金面上资助项目（2020M681747）；国家自然科学面上基金项目（31972661）作者简介：相汝苹（1998-），女，硕士研究生，研究方向为家禽病毒学与免疫学，E-mail：*通讯作者：李拓凡（1991-），男，博士，讲师，主要从事家禽病毒性免疫致病机理及免疫防控研究，E-mail：doi：10.16372/j.issn.1004-6364.2023.09.005Cloning and Expression of Chicken EphrinA2 Gene and Generation ofIts Monoclonal AntibodyX
5、IANG Ruping1,2,3,4,YAO Xiaohui1,2,3,4,XIE Quan1,2,3,4,WAN Zhimin1,2,3,4,SHAO Hongxia1,2,3,4,QIN Aijian1,2,3,4,YE Jianqiang1,2,3,4,LI Tuofan1,2,3,4*（1.Ministry of Education Key Laboratory for Avian Preventive Medicine,Key Laboratory of Jiangsu Preventive Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzh
6、ou,Jiangsu 225009；2.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of ImportantAnimal Infectious Diseases and Zoonoses,Yangzhou,Jiangsu 225009；3.Institutes of Agricultural Science and Technology Development,Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu 225009；-252023年第45卷第9期China Poultry Vol.45，No.9
7、.2023预防兽医预防兽医Ephrin家族是已知最大的生长因子受体家族受体酪氨酸激酶亚家族 Eph 的膜结合配体 1-2。依据在细胞膜上的锚定方式及结合受体不同，Ephrin分为Ephrin A和Ephrin B两个家族 3-4。Ephrin通过与Eph受体相互作用调控信号通路 5，是调节细胞黏附、形态以及细胞间信息传递的重要分子 6。研究表明，Eph/Ephrin信号通路在肿瘤发生、血管生成中起着至关重要的作用 4，7。在临床上，许多 Eph 和 Ephrins 在一些肿瘤细胞中高表达 2，8，且与肿瘤的恶性程度、预后以及治疗有关 9-10，如肝癌、卡波西氏肉瘤以及前列腺癌等 8，11-12
8、。此外，研究表明EphrinA2还可通过降解破坏髓样来源的抑制细胞（MDSC），从而影响肿瘤微环境，抑制肿瘤生长、扩散 13。然而，鸡源EphrinA2的生物学功能及其在相关疾病中的作用尚未见报道。探究鸡EphrinA2生物学功能将有助于解析鸡肿瘤性疾病的发病机理，但由于鸡EphrinA2与其他种群的同源性较低，商品化的抗体并不能满足基础研究需求。本研究在构建鸡源EphrinA2原核与真核表达载体基础上，制备了抗鸡源EphrinA2蛋白的特异性单克隆抗体，为后续探究鸡EphrinA2蛋白的生物学功能提供了有效生物材料。1材料与方法1.1试验材料pCold 原核表达载体、pcDNA3.1真核表达
9、载体、SP2/0细胞、DF-1细胞、LMH细胞以及BL21（DE3）工程菌均由本实验室保存；感受态细胞DH5购自北京擎科生物科技有限公司；SPF级5周龄BALB/c小鼠购自扬州大学兽医学院比较医学中心；纯化的GST-EphrinA2-RBD蛋白由本实验室保存。1.2主要试剂质粒小提试剂盒、总RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒、核酸胶回收试剂盒、Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶、EXnaseTM连接酶和2TaqMaster Mix均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Super DNA Marker购自康为世纪生物科技有限公司；ECL超敏发光液购自苏州新赛美生物科技有限
10、公司；转染试剂Mirus购自MIRUS公司；DMEM、Opti-MEM培养基、蛋白Marker均购自赛默飞世尔科技有限公司；His单克隆抗体和GAPDH单克隆抗体购自武汉艾博抗有限公司；HRP、FITC标记的山羊抗小鼠IgG均购自Jackson Immuno Research公司；单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自北京博奥龙免疫技术有限公司。1.3试验方法1.3.1引物设计参考鸡源EphrinA2基因序列（GenBank 序列登录号：NM_204983）、pCold 序列和pcDNA3.1序列设计并合成能扩增出相应线性化载体、EphrinA2-RBD基因片段（受体结合区）以及EphrinA2基因全长
11、的引物，用于构建pCold-EphrinA2-4.Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety,Ministry of Education,Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu 225009）Abstract：The purpose of this study was to develop specific monoclonal antibodies against chicken EphrinA2 protein.Theeukaryotic an
12、d prokaryotic expression vectors of chicken EphrinA2 gene were constructed by PCR and homologous recombinationtechniques.Mice were immunized with purified EphrinA2 prokaryotic expression product.The mouse spleen cells were fusedwith SP2/0 myeloma cells,and the positive cell clones were screened by i
13、ndirect ELISA.The characteristics of the expressedproduct and monoclonal antibody were verified by SDS-PAGE,indirect immunofluorescence assay and Western blot.The resultsshowed that the recombinant prokaryotic protein His-EphrinA2-RBD was mainly expressed in pellet.Two hybridoma cell lines(designate
14、d as,4H6 and 1G9,respectively)which could stably secrete specific antibodies against chicken EphrinA2 werescreened by ELISA.Indirect immunofluorescence assay and Western blot showed that monoclonal antibody 4H6 could not onlyspecifically recognize the overexpressed chEphrinA2 protein in DF-1 cells t
15、ransfected with eukaryotic expression vector pcDNA3.1-EphrinA2,but also effectively identify the endogenous EphrinA2 protein in LMH and DF-1 cells.The results showed thatmonoclonal antibody 4H6 possesses good reactivity and specificity with chicken EphrinA2 protein,and could be applied in chicken Ep
16、hrinA2 related basic researches.Key words：chicken EphrinA2;protein expression;monoclonal antibody;indirect immunofluorescence assay;Western blot-262023年第45卷第9期China Poultry Vol.45，No.9.2023RBD原核表达载体和pcDNA3.1-EphrinA2真核表达载体。具体引物序列见表1，引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。表1构建重组质粒的引物序列构建载体pCold-EphrinA2-RBDpcDNA3.1-Ephr
17、inA2PCR扩增片段线性化pCold EphrinA2-RBD线性化pcDNA3.1EphrinA2引物名称及序列（53）pCold-F：AAGCTTGTCGACCTGCAGTCTAGATpCold-R：GGTACCGAGCTCCATATGCCTACCpCold-EphrinA2-RBD-F：ATGGAGCTCGGTACCTCGGACCGCTACGCCGTCTATTpCold-EphrinA2-RBD-R：CAGGTCGACAAGCTTTTAGTTCGTCGGCCGAACGTAAACCpCF：GAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGpCR：GCTCGGTACCAAGCTTAAGT
18、TTAAACGPc-EphrinA2-F：AGCTTGGTACCGAGCATGCCGCGCTGGGAGGCGGCPc-EphrinA2-R：ATATCTGCAGAATTCCTAAGAGCCCAGCAGAGTCCAG扩增片段大小/bp4 4004005 0006001.3.2目的基因扩增利用总RNA提取试剂盒从DF-1细胞中提取RNA，之后通过反转录试剂盒将 RNA 反转录为cDNA，RNA提取以及反转录的具体操作步骤参见试剂盒说明书。以pCold 质粒为模板，pCF、pCR 为上、下游引物，进行 PCR 扩增出线性化pCold；以DF-1细胞的cDNA为模板，以pCold-EphrinA2-R
19、BD-F 和 pCold-EphrinA2-RBD-R 为上、下游引物，PCR 扩增出 EphrinA2-RBD原核表达基因片段。以pcDNA3.1质粒为模板，pCF、pCR为上、下游引物，PCR扩增出线性化pcDNA3.1；以DF-1细胞的cDNA为模板，Pc-EphrinA2-F和Pc-EphrinA2-R为上、下游引物，PCR扩增出 EphrinA2 真核表达基因片段。分别将PCR所得pcDNA3.1与pCold 线性化载体，以及EphrinA2-RBD原核表达片段与EphrinA2真核表达片段的PCR产物分别胶回收。1.3.3重组载体的构建将线性化载体与胶回收产物按照克隆载体与插入片段
20、摩尔比为1 2的最适比例进行同源重组连接。重组反应体系于37反应30 min。反应结束后，取重组产物转化DH5，次日分别挑取6个单菌落加入含氨苄青霉素的液体培养基中，于37 摇床内放大培养1214 h。用特异性引物进行菌液PCR鉴定，并将菌液PCR阳性者质粒并送测序。将测序结果正确的质粒保存于-20。1.3.4EphrinA2-RBD蛋白原核表达将原核重组质粒pCold-EphrinA2-RBD转化BL21细菌。待转化结束后取转化产物涂板，平板倒放于37 培养箱中培养12 h，次日分别挑取单菌落加入含氨苄青霉素的液体LB培养基中，于37 摇床内放大培养12 h。之后以1 100比例取50 L菌
21、液加入5 mL液体LB培养基中，37 震荡培养3 h，待培养结束后，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行低温诱导蛋白表达。将诱导结束的菌液离心弃上清后加入PBS，超声破碎15 min。破碎结束后，取样品于4 10 000 r/min离心10 min，分离上清与沉淀，随后分别加入上样缓冲液98 煮沸10 min，离心3 min，用SDS-PAGE和Westernblot进行表达鉴定。不可溶性表达产物经包涵体洗涤液洗涤、不同浓度尿素变性复性、透析纯化14。并用SDS-PAGE鉴定纯化效果。纯化的蛋白保存于-80 备用。1.3.5抗鸡源EphrinA2蛋白单克隆抗体制备将纯化后His-Ephr
22、inA2-RBD蛋白作为免疫原，免疫5周龄BALB/c小鼠（50 g/只）。初次免疫用同等剂量的弗式完全佐剂将蛋白充分乳化后，对小鼠进行腹腔注射。随后每次间隔15 d后用不完全弗式佐剂乳化蛋白免疫小鼠。免疫4次后，用间接ELISA检测血清抗体效价，效价达到1 12 800后进行冲击免疫，3 d后取脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，HAT培养基筛选。用ELISA方法筛选分泌抗EphrinA2蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株，并经23轮亚克隆最终获得阳性杂交瘤细胞。将建株的杂交瘤细胞以106个细胞腹腔注射提前石蜡致敏的BALB/c小鼠制备单克隆抗体腹水。用亚类鉴定试剂盒对单克隆抗体进行亚类鉴定，具体操作详见
23、试剂盒说明书。1.3.6间接ELISA检测小鼠血清效价将GST-EphrinA2-RBD重组蛋白用碳酸盐缓冲液稀释为1 g/mL包被酶标板，过夜后用含5%脱脂乳的PBST封闭液封闭。用PBST将待检血清以及阴性血清按1 200稀释（杂交瘤细胞上清则直接加入原液），37 反应1 h后，PBST洗涤3遍；预防兽医预防兽医-272023年第45卷第9期China Poultry Vol.45，No.9.20231 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpM1D.PCR扩增EphrinA2基因注：M.Super DNA Marker；1.EphrinA2基因扩增产物。600 bp5
24、 000 bp3 000 bp2 000 bp1 500 bp1 000 bpM1C.PCR扩增线性化真核表达载体注：M.Super DNA Marker；1.线性化pcDNA3.1载体。5 000 bp1 000 bp500 bp250 bpM1B.PCR扩增线EphrinA2-RBD片段注：M.Super DNA Marker；1.EphrinA2-RBD片段。400 bp5 000 bp3 000 bp2 000 bp1 500 bp1 000 bpM1A.PCR扩增线性化原核表达载体注：M.Super DNA Marker；1.线性化pCold 载体。4 400 bp图1EphrinA
25、2基因原核及真核表达载体的构建二抗为 1 10 000 稀释 HRP 标记的羊抗鼠 IgG，37 反应1 h后，PBST洗涤3遍；TMB显色液37 避光显色10 min；加入2 mol/L H2SO4终止反应，用酶标仪（UMR-9600型，杭州优米仪器有限公司）检测OD450值（OD4500.2判定为阳性）。1.3.7抗鸡源EphrinA2蛋白单克隆抗体反应性将DF-1与LMH细胞接种6孔板或96孔板，待细胞汇合度为70%80%时，将真核重组质粒pcDNA3.1-EphrinA2 转染细胞。以 6 孔板为例，转染步骤如下：取4 g pcDNA3.1-EphrinA2重组质粒混于200 L Op
26、ti-MEM培养基中，吹吸均匀后加入8 L转染试剂Mirus混匀，静置45 min后将转染复合物滴入培养基中，6 h后换新鲜培养基。转染48 h后，裂解细胞或使用预冷的丙酮 乙醇（3 2）固定液固定细胞，以制备的单克隆抗体或抗His单克隆抗体等作为一抗进行Western blot或间接免疫荧光（IFA）分析15。2结果与分析2.1EphrinA2基因原核及真核表达载体的构建结果显示，pCold 线性化载体及EphrinA2-RBD基因片段均成功扩增且大小符合预期，大小分别约为4 400 bp和400 bp（见图1A、图1B）。真核表达载体的pcDNA3.1线性化载体和EphrinA2基因片段也
27、均扩增成功且大小符合预期，大小分别约为5 000 bp和600 bp（见图1C、图1D）。扩增后的PCR产物与线性化载体经同源重组连接、鉴定并测序验证后，将原核表达载体和真核表达载体分别命名为 pCold-EphrinA2-RBD 和 pcDNA3.1-EphrinA2。2.2EphrinA2-RBD原核表达鉴定SDS-PAGE分析蛋白表达结果见图2A。结果显示，转化pCold-EphrinA2-RBD重组子的细菌裂解产物上清和沉淀中均含有与预期大小相符合的目的蛋白条带，约为16 ku，但EphrinA2-RBD主要在细菌的包涵体中以不可溶形式表达。融合蛋白EphrinA2-RBD纯化效果良好
28、（见图2B），且能被抗His单抗有效识别（见图2C）。2.3抗鸡源EphrinA2单克隆抗体的制备通过间接ELISA方法检测小鼠血清效价为1 12 800，随后取该小鼠脾细胞进行细胞融合。经两次亚克隆后，最终获得4H6与1G9两株阳性杂交瘤细胞株。亚类鉴定试剂盒检测结果显示：4H6单克隆抗体重链属于IgG1，而1G9单克隆抗体重链属于IgM（见表2）。2.4抗鸡源EphrinA2单克隆抗体反应性Western blot 结果表明，以 GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）作为内部参照，单克隆抗体4H6能有效识别在DF-1细胞中表达的外源性EphrinA2 蛋白以及 DF-1 细胞与 LMH 细胞
29、中内源性EphrinA2蛋白（见图3）。转染pc3.1的细胞裂解产物的两条蛋白条带即为内源性表达的 EphrinA2，其中分子量较小的是条带与预期大小相近，而较大的条带可能是蛋白翻译后修饰所致。IFA试验进一步证明，4H6株可识别转染了pcDNA3.1-EphrinA2的LMH细胞中高表达的EphrinA2蛋白，呈特异性荧光（见图4A）；而使用阴性小鼠血清孵育时则无特异性荧光（见图4B）。3讨论Eph受体是受体酪氨酸激酶（RTK）中最大的预防兽医预防兽医-282023年第45卷第9期China Poultry Vol.45，No.9.2023亚家族16。Eph与其配体Ephrin构成了一个功能
30、多样的细胞信号网络17，两者间的互作调控着信号通路的双向激活18。据报道，Eph 受体及其Ephrin配体与病毒感染、细胞黏附以及血管生成有关，且已被证明会影响癌细胞的生长、转移和入侵16。EphA2是受体酪氨酸激酶Eph家族中的一员，EphrinA2 是其重要的结合配体之一19。然而，EphrinA2在禽类相关疾病中的作用研究未见报道。EphrinA2的受体结合结构域（RBD）是其与受体EphA2的互作功能区，阻断二者之间的互作会影响EphA2/EphrinA2信号通路正常转导3-4，6。故为了便于未来开展EphrinA2重要功能域与其他蛋白的互作研究，在构建EphrinA2原核表达载体时，
31、选择了克隆表达EphrinA2的RBD。尽管构建的原核表达载体pCold-EphrinA2-RBD表达的His-EphrinA2-RBD主要以不可溶的沉淀形式存在，但纯化后的蛋白能够有效诱导小鼠能有效产生抗 EphrinA2 蛋白的多抗，表明本研究表达的Ephrin A2-RBD原核表达产物具有良好的免疫原性。EphrinA1和EphrinA2同属EphrinA家族，二者均能结合 EphA2 并传导相应的信号2，4，6。Nekrasova等20利用大肠杆菌表达的单体、非糖基化形式的重组Ephrin A1-RBD蛋白能够有效激活293T 细胞中表达的 EphA2 并刺激其磷酸化；而Ferluga
32、等21发现，去糖基化的EphrinA1并不能有效诱导胶质母细胞瘤细胞中EphA2受体内化和降解，也不能激活参与细胞迁移和增殖的下游信号通路。因此，未来的研究需要验证重组鸡Ephrin A2-RBD蛋白的活性及其对不同鸡源细胞中EphA2的作用。在所获的两株抗鸡Ephrin A2单克隆抗体中，单克隆抗体4H6为IgG1亚类，而单克隆抗体1G9为IgM亚类，故主要对单克隆抗体4H6 进行了特异鉴定。结果证实，单克隆抗体4H6不仅具有ELISA反应性，而且具有很好的IFA以及 Western blot 反应性。值得注意的是，在Western blot中检测到的两条蛋白条带中，较大的条带可能与鸡Eph
33、rinA2蛋白存在某种翻译后的修饰有关，而具体的修饰类型是否与人源Ephrin蛋白类似以及该修饰在信号传导中的作用有待进一步研究。Noberini等22使用小分子抑制剂尝试选择性阻断配体与EphA2受体的结合来抑制前70 ku55 ku40 ku35 ku25 ku15 kuM12315 kuC.分析蛋白表达Western blot注：M.蛋白Marker；1.纯化后pCold -EphrinA2-RBD蛋白；2.纯化前pCold -EphrinA2-RBD蛋白；3.pCold 菌体破碎产物。图2EphrinA2-RBD原核表达及其纯化100 ku70 ku55 ku40 ku35 ku25
34、ku15 kuM123B.分析蛋白纯化效果SDS-PAGE注：M.蛋白 Marker；1.纯化后pCold-EphrinA2-RBD 蛋白；2.纯化前pCold-EphrinA2-RBD蛋白；3.pCold 沉淀表达蛋白。70 ku55 ku40 ku35 ku25 ku15 kuM1234A.分析蛋白表达SDS-PAGE注：M.蛋白 Marker；1.pCold-EphrinA2-RBD菌体破碎上清；2.pCold-EphrinA2-RBD菌体破碎沉淀；3.pCold 菌体破碎上清；4.pCold 菌体破碎沉淀。15 ku15 ku表2单克隆抗体亚类鉴定单克隆抗体4H61G9IgA0.040
35、0.037IgM0.0410.630IgG10.2880.043IgG2a0.0400.044IgG2b0.0430.059IgG30.0400.065123EphrinA2GAPDH图3抗EphrinA2单克隆抗体Western blot分析注：单克隆抗体4H6孵育；1.转染pcDNA3.1-EphrinA2质粒的DF-1细胞裂解产物；2.DF-1细胞裂解产物；3.LMH细胞裂解产物。A.单克隆抗体4H6孵育的转染pcDNA3.1-EphrinA2质粒的LMH细胞B.阴性小鼠血清孵育的转染 pcDNA3.1-EphrinA2质粒的LMH细胞图4抗EphrinA2单克隆抗体IFA分析（100）
36、预防兽医预防兽医-292023年第45卷第9期China Poultry Vol.45，No.9.2023列腺等肿瘤生长，至于单克隆抗体4H6能否通过与EphrinA2的RBD结合，干预EphrinA2与Eph的互作及其信号通路激活，进而影响禽类细胞或肿瘤的增殖仍有待深入探究。此外，鼠IAPE内源性反转录病毒的Env蛋白能与EphrinA2互作，并作为功能性受体启动病毒感染23，至于鸡EphrinA2又是否能作为某些禽类病毒的受体介导感染入侵也值得深入探索。4结论本研究在表达具有良好抗原性的His-EphrinA2-RBD 蛋白的基础上，成功制备了两株抗鸡EphrinA2 的单克隆抗体 4H6
37、 和 1G9。其中，4H6在 IFA 和 Western blot 中能有效识别鸡 EphrinA2蛋白。参考文献：1 RUDNO-RUDZINSKA J，KIELAN W，FREJLICH E，et al.Areview on Eph/Ephrin，angiogenesis and lymphangiogenesis ingastric，colorectal and pancreatic cancers J.Chinese journalof cancer research，2017，29（4）：303-312.2 PASQUALE E B.Eph receptors and ephrins
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