1、中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.189DOI:10.19803/j.1672-8629.20230498 中图分类号：R917文献标志码：A 文章编号：1672-8629（2024）01-0089-05基金项目：国家重点研发计划（2021YFF0600804）。作者简介：王绿音，女，硕士，助理研究员，激素类药物质量控制研究。*通信作者：梁成罡，男，研究员，激素类药物质量控制研究。E-mail:#为共同通信作者。随着女性生育年龄的推迟和不孕不育率的逐年增加，辅助生殖药物市场规模持续增长1。促卵泡激素是辅助生殖技术临床应用最
2、为广泛的药物，其中重组人促卵泡激素（recombinant human follicle stimulating DMB 衍生-高效液相色谱法测定重组人促卵泡激素中的唾液酸含量 王绿音，李懿，孙悦，胡馨月，张慧，李晶#，梁成罡*（中国食品药品检定研究院化学药品检定所，国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室，国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室，北京 102629）摘要：目的建立采用 4,5-亚甲二氧基-1,2-苯二胺二盐酸盐（DMB）衍生-高效液相色谱-荧光检测器（HPLC-FLD）法（DMB 衍生法）同时测定重组人促卵泡激素（rhFSH）中 2 种唾液酸组分 N-羟
3、乙酰神经氨酸（Neu5Gc）和N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）含量的方法。方法将DMB 衍生法与邻苯二胺衍生-高效液相色谱法（邻苯二胺衍生法）进行对比研究，对 DMB 衍生法中的水解条件进行优化并确定最终方法为 rhFSH 原液经酸水解后，采用 DMB 进行衍生，经 Agilent ZORBAX 300SB-C18色谱柱（250 mm4.6 mm，5 m）分离，采用荧光检测器检测。结果与邻苯二胺衍生法相比，DMB 衍生法能够实现 Neu5Gc 与Neu5Ac 相关杂质的有效分离。该方法 Neu5Gc 和 Neu5Ac 分别在 0.5 5.0 g mL-1（r=0.999 9）和 25 250
4、gmL-1（r=0.999 8）浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系；Neu5Gc和 Neu5Ac 的检测限分别为11.07、10.30 ngmL-1，定量限分别为 33.21、20.60 ngmL-1，两者回收率分别为（99.631.33）%（n=9）和（100.621.58）%（n=9），RSD 分别为1.3%（n=9）和1.5%（n=9）。结论该方法专属性强、灵敏度高、精密度和准确度良好，可用于准确测定 rhFSH中唾液酸 Neu5Gc 和 Neu5Ac 的含量。关键词:重组人促卵泡激素；高效液相色谱法；DMB 衍生；荧光检测器；N-羟乙酰神经氨酸；N-乙酰神经氨酸；含量；唾液酸 Dete
5、rmination of sialic acid in recombinant human follicle stimulating hormone by high performance liquid chromatography with DMB derivatizationWANG Lyuyin,LI Yi,SUN Yue,HU Xinyue,ZHANG Hui,LI Jing#,LIANG Chenggang*(Institute for Chemical Drug Control,National Institutes for Food and Drug Control,Key La
6、boratory of the Ministry of Health for Research on Quality Study and Evaluation of Biotech Products,Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on Quality Study and Evaluation of Chemical Drugs,Beijing 102629,China)Abstract:Objective To develop a 4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dih
7、ydrochloride(DMB)derivatization method based on high-performance liquid chromatography-fluorescence detector(HPLC-FLD)(DMB derivatization method)that can concurrently quantify both N-glycolylneuraminic acid(Neu5Gc)and N-acetylneuraminic acid(Neu5Ac)in rhFSH.Methods A comparative study was undertaken
8、 between the o-phenylenediamine derivatization method based on high-performance liquid chromatography(o-phenylenediamine derivatization method)and DMB derivatization method.The optimized DMB derivatization method with refined hydrolysis conditions was established and demonstrated as follows:The rhFS
9、H solution was first subjected to acid hydrolysis,followed by derivatization with DMB.The resulting solution was then separated using an Agilent ZORBAX 300SB-C18 chromatographic column(250 mm4.6 mm,5 m)and analyzed by a fluorescence detector.Results When compared to the o-phenylenediamine derivatiza
10、tion,the optimized DMB derivatization method proves to be more effective in separating Neu5Gc and Neu5Ac related impurities.The optimized DMB derivatization method showcases superior specificity,with both Neu5Gc and Neu5Ac demonstrating a strong linear relationship with peak area within the concentr
11、ation ranges of 0.55.0 g mL-1(r=0.999 9)and 25250 g mL-1(r=0.999 8).The limit of detection and quantification(LOD and LOQ)for Neu5Gc are impressively low as 11.07 ngmL-1 and 33.21 ngmL-1 respectively,comparable to the levels of Neu5Ac(LOD:10.30 ngmL-1,LOQ:20.60 ngmL-1).Besides,the recovery rates for
12、 Neu5Gc and Neu5Ac are(99.631.33)%(n=9)and(100.621.58)%(n=9),with low RSDs of 1.3%(n=9)and 1.5%(n=9),respectively.Conclusion The method demonstrates commendable specificity,exceptional sensitivity,and noteworthy precision and accuracy,which would be ideally suited for the precise quantification of N
13、eu5Gc and Neu5Ac content in rhFSH.Keywords:recombinant human follicle stimulating hormone(rhFSH);high-performance liquid chromatography;DMB derivatization;fluorescence detector;N-glycolylneuraminic acid;N-acetylneuraminic acid;content;sialic acid基础与临床研究中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.
14、21,No.190光检测器（美国 Waters 公司，型号：Alliance e2695-2475）；电子天平（METTLER TOLEDO 公司，型号：AG245）；超纯水机（美国Millipore 公司，型号：Milli-Q IQ7000）。1.2 试药rhFSH 原液样品（编号13来自企业 A，编号46来自企业B，编号7来自企业C，均由本实验室保存）；Neu5Ac对照品（USP reference standard，批号：FOH186，每1 mg 中含 0.894 mg Neu5Ac），Neu5Gc 对照品（USP reference standard，批号：R134L0，每1 mg中含
15、 0.975 mg Neu5Gc）；DMB（日本 TaKaRa 公司，批号：AM72030A，内含 DMB Solution 和 Coupling Solution）；邻苯二胺、硫酸氢钠、盐酸、乙酸均为分析纯，购自国药化学试剂有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，购自Fisher 公司；实验用水为纯化水。2 实验方法2.1 DMB 衍生法2.1.1 溶液制备 对照品储备液制备：精密称取 Neu5Ac对照品 25 mg，置 25 mL 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为 Neu5Ac 对照品储备液；精密称取 Neu5Gc 对照品 25 mg，置 25 mL 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为
16、Neu5Gc对照品储备液；精密量取上述 Neu5Gc对照品储备液 1 mL，置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为 Neu5Gc 对照品储备液 II。混合对照品溶液：精密量取 Neu5Ac 对照品储备液 2.5 mL，Neu5Gc 对照品储备液 II 5.0 mL于10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即为每1 mL含Neu5Ac 250g 和 Neu5Gc 5g 的混合对照品溶液（标准曲线溶液 1）。标准曲线溶液：取混合对照品溶液 1 000、600、400、200、100L，分别加水 0、400、600、800、900L，混匀，配置成 Neu5Ac 理论浓 度 为 250、15
17、0、100、50、25gmL-1，Neu5Gc 理论浓度为 5.0、3.0、2.0、1.0、0.5gmL-1的系列标准曲线溶液，标记为标准曲线溶液1、2、3、4、5。精密吸取上述系列标准曲线溶液 25L，加入 0.5 mol L-1硫酸氢钠溶液 25L，涡旋混匀，离心，80保温1 h，冷至室温。精密吸取 10L，加入 DMB 标记溶液（DMB SolutionCoupling Solution水=154）100 L，涡旋混匀，离心，50 保温 2.5 h，冷至室温。供试品溶液：取rhFSH 原液，用原液缓冲液将其稀释至每1 mL约含1 mg 的溶液，按“标准曲线溶液”项下方法操作，即得。空白对
18、照溶液：制备不含rhFSH 的原液缓冲液，按“标准曲线溶液”项下方法操作，即得。hormone，rhFSH）因生物活性、纯度和安全性上均优于尿提取人卵泡刺激素，市场份额已达 70%以上2-3。因此，提高和完善 rhFSH 药物的质量控制方法，对该类药物的监管具有重要意义。唾液酸化程度是治疗性重组糖蛋白生物制品的关键质量属性，因其会对药物的疗效、半衰期、稳定性和安全性等产生影响，在生产、储存和可比性研究中需要对其进行密切监测和控制4。用于生产治疗性糖蛋白的细胞主要是哺乳动物细胞系5，其表达产生的糖蛋白含有 N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac）和N-羟乙
19、酰神经氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）2 种唾液酸，而在人体中，由于单磷酸胞苷-N-乙酰神经氨酸羟化酶（cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）基因中一个关键外显子的缺失，只能生成 Neu5Ac6。药物中外源性唾液酸 Neu5Gc 存在潜在的免疫原性风险，可诱发与慢性炎症相关的疾病（如癌症、心血管和自身免疫疾病）；该复合物还可能诱导补体激活效应，导致药物的清除从而影响疗效7。已上市的 rhFSH 药物，均系非人哺乳动物细胞表达，含有上述 2 种唾液酸。然而，现行质量标
20、准采用邻苯二胺衍生-高效液相色谱法（邻苯二胺衍生法），仅测定 rhFSH 原液中 Neu5Ac 的含量，缺少对Neu5Gc 的控制。为了确保患者的用药安全，研究建立可同时测定 rhFSH 原液中Neu5AC 和 Neu5Gc 含量的方法十分必要。中华人民共和国药典（2020 年版）测定唾液酸含量采用的是比色法，该法测定的是总唾液酸，无法区分 Neu5Ac 和 Neu5Gc8。已上市产品均采用邻苯二胺衍生法仅对 Neu5Ac 进行测定，研究尝试在原方法基础上进行优化使其可以同时定量Neu5Ac与Neu5Gc，发现无法实现 Neu5Gc与Neu5Ac 相关杂质的有效分离，且灵敏度较低，难以对产品中
21、微量的 Neu5Gc 进行准确定量。4,5-亚甲二氧基-1,2-苯二胺二盐酸盐（DMB）衍生-高效液相色谱法（DMB 衍生法）具有特异性强、灵敏度高等特点9，近年来被大量用于生物技术药物的唾液酸含量检测。本研究采用 DMB 衍生法研究建立了rhFSH原液中 Neu5Ac 和 Neu5Gc 的含量测定方法，可用于rhFSH 原液的常规放行检验。1 仪器与试药1.1 仪器高效液相色谱仪-荧光检测器（美国安捷伦公司，型号：1260 Infinity II）；高效液相色谱仪-荧中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.1912.1.2 色
22、谱条件 色谱柱为 Agilent ZORBAX 300SB-C18柱（250 mm4.6 mm，5 m），流动相 A为乙腈，流动相 B为含 0.77%甲醇的水溶液；流速0.5 mL min-1；洗脱梯度：91%流动相 B 保持 20 min，1 min 内流动相 B 降至0%，保持 9 min；进样器温度：6；进样量：5L；柱温：55；荧光检测器：激发波长为 373 nm，发射波长为 448 nm。2.1.3 测定法 精密量取标准曲线溶液、供试品溶液和空白对照溶液注入液相色谱仪，分别记录色谱图，采用标准曲线法以峰面积计算。2.2 邻苯二胺衍生法由于已上市产品采用的邻苯二胺法仅对产品中的 Neu
23、5Ac 进行定量，故首先尝试在原方法基础上增加 Neu5Gc 标准品，探索其同时定量 Neu5Ac 与Neu5Gc 的可行性。2.2.1 溶液制备 供试品溶液：精密吸取样品 50L，加入 0.5 molL-1硫酸氢钠溶液 50L，涡旋混匀，离心，80保温 20 min，冷至室温。精密加入邻苯二胺溶液（20 mgmL-1的 1 molL-1盐酸溶液）100L，涡旋混匀，离心，80保温 40 min，冷至室温。对照品溶液：精密称取 Neu5Ac 对照品适量，用水稀释制成每1 mL 中约含 Neu5Ac 100g 的溶液，精密吸取50L，按“2.1.1 溶液制备-供试品溶液”项下方法衍生化，即为 N
24、eu5Ac 对照品溶液。同法制备 Neu5Gc对照品溶液。空白溶液：制备不含 rhFSH 的原液缓冲液，按“2.1.1 溶液制备-供试品溶液”项下方法衍生化，即得。2.2.2 色谱条件 色谱柱Waters Symmetry C18柱（150 mm 4.6 mm，5 m），流动相 A 为含 0.15%1-氨基丁烷、0.5%磷酸、1%四氢呋喃的水溶液，流动相 B 为含 50%乙腈的水溶液；流速 1.0 mL min-1；洗脱梯度：13%流动相 B 保持 20 min，1 min 内流动相 B升至 100%，维持 8 min；进样器温度：6；进样量：20L；柱温：25；检测波长：214 nm。2.3
25、 方法学验证2.3.1 专属性 按“2.1.1”项下配制标准曲线溶液 3、供试品溶液和不含 rhFSH 的原液缓冲液，分别精密量取 5L 注入液相色谱仪。2.3.2 线性 按“2.1.1”项下方法配制系列标准曲线溶液，平行制备 3 份，分别以 Neu5Ac 和 Neu5Gc 浓度为横坐标，以峰面积的平均值为纵坐标进行线性回归。2.3.3 准确度 取“2.1.1”项下的混合对照品溶液700 L，加水 300 L，混匀，配置成 Neu5Ac 理论浓度为 75g mL-1，Neu5Gc理论浓度为1.5g mL-1的溶液，标记为标准曲线溶液 6。取 rhFSH 原液适量，等体积加入标准曲线溶液 2、3
26、、6，配制成高、中、低3 个浓度水平的加标供试品溶液，按照“2.1.2”项下的色谱条件进行测定，各浓度水平下独立测定 3 次。2.3.4 重复性 取 rhFSH 原液样品按“2.1.1”项下配制供试品溶液6 份，按“2.1.2”项下色谱条件进行测定。2.3.5 中间精密度 取与重复性项下同批次的 rhFSH原液样品采用不同的仪器（Waters e2695-2475）和色谱柱（Waters Symmetry C18柱，250 mm4.6 mm，5m），在不同时间按照“2.1.2”项下的色谱条件测定平行制备的 3 份供试品溶液。2.3.6 检测限与定量限 分别精密称取 Neu5Gc 和Neu5Ac
27、 对照品适量，加水溶解并稀释成一定浓度，分别测定检测限（以 3 倍信噪比计）和定量限（以10倍信噪比计）。2.3.7 溶液稳定性 由于衍生后样品的稳定性对测定结果影响较大，有必要对溶液稳定性进行考察。将“2.4.4”重复性项下制备的供试品溶液在12 h 后再次进样，计算测定结果相对于 0 h 测定结果的回收率。2.3.8 样品测定 采用 DMB 衍生-高效液相色谱法测定来自3 个国内企业的 7 批样品。3 实验结果 3.1 邻苯二胺衍生法在原邻苯二胺衍生法仅测定 Neu5Ac 的基础上，增加了Neu5Gc 的标准品，考察采用该方法同时测定Neu5Ac 和 Neu5Gc 的可行性。经衍生后分别进
28、样上述 2 种唾液酸对照品溶液、供试品溶液和空白溶液。结果如图1 所示，rhFSH 供试品溶液中含有 Neu5Ac和 Neu5Gc。观察 Neu5Ac 和 Neu5Gc 对照品溶液的色谱图可知，Neu5Gc 峰与 Neu5Ac 对照品溶液中主峰前的 1 个相关杂质峰保留时间重合，采用已获批的方法无法实现两者的分离，无法准确测定 rhFSH样品中 Neu5Gc 的含量。3.2 DMB 衍生法方法学验证3.2.1 专属性 分别测定标准曲线溶液 3、供试品溶液和不含 rhFSH 的原液缓冲液（图 2），可见原液缓冲液组分对Neu5Ac 和 Neu5Gc 均不干扰；混合对照品溶液中Neu5Gc与相邻峰
29、的分离较好（分离度为 2.3）；rhFSH 供试品和混合对照品溶液中Neu5Ac 的保留时间偏差为 0.12%，Neu5Gc的保留时间偏差为 0.21%，均小于 5%。上述结果表明，方法的专属性良好。中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.192注：A.Neu5Gc 对照品；B.Neu5Ac 对照品；C.rhFSH 样品；D.空白Note:A.Neu5Gc standard;B.Neu5Ac standard solution;C.rhFSH sample;D.blank图1 邻苯二胺衍生法典型色谱图Figure 1 Typic
30、al chromatograms of o-phenylenediamine derivatization method注：A.rhFSH 原液缓冲液；B.标准曲线溶液 3；C.rhFSH 样品Note:A.Drug substance buffer solution of rhFSH;B.Standard curve solution 3;C.rhFSH sample图 2 rhFSH 原液缓冲液、标准曲线溶液 3 和 rhFSH 样品的重叠色谱图Figure 2 Overlaid chromatograms of drug substance buffer solution of rhFS
31、H,Standard curve solution 3 and rhFSH sample3.2.4 重复性 6 份供试品溶液测得的 Neu5Gc 平均含量为 2.87 gmL-1，RSD 为 2.5%；Neu5Ac 的平均含量为 88.66 gmL-1，RSD 为 0.6%，重复性较好。3.2.5 中间精密度 采用不同的仪器和色谱柱在不同时间测定平行制备的3 份供试品溶液，与上述重复性试验结果一并计算，Neu5Gc的平均含量为2.87g mL-1，RSD 为 3.4%，Neu5Ac 的平均含量为 87.84g mL-1，RSD 为1.6%；RSD 均小于 5%，表明方法中间精密度良好。3.2.
32、6 检测限与定量限 分别制备一定浓度的 Neu5Gc和 Neu5Ac 对照品溶液，探索方法的检测限（以 3 倍信噪比计）和定量限（以 10 倍信噪比计）。Neu5Gc和 Neu5Ac 的检测限分别为11.07 和10.30 ng mL-1，定量限分别为 33.21 和 20.60 ngmL-1。3.2.7 溶液稳定性 为考察溶液稳定性，对放置12 h后的供试品溶液进行测定，计算测定结果相对于0 h 测定结果的回收率（表 2）。相对于 0 h，rhFSH 样品在自动进样器中暂存12 h 后Neu5Ac 的回收率均值为 99.3%，Neu5Gc 的回收率均值为 99.2%，均在90%110%。3.
33、2.8 样品测定 测定3个企业的7批样品的唾液酸含量（表 3），可见不同生产企业的rhFSH 原液中Neu5Gc存在差异，但均在2.05.0 g mL-1（0.100.40 mol mol-1）范围内。参考同为糖蛋白激素家族的重组人促甲状腺素，在其现行注册标准中对 Neu5Gc 进行了控制，且样品中测得的 Neu5Gc 均小于 0.05 mol mol-1。与之相比，rhFSH 样品中的 Neu5Gc 含量高出2 倍以上，可见控制 rhFSH 原液中 Neu5Gc 含量的必要性。表1 Neu5Ac 和 Neu5Gc 含量测定回收率试验结果Table 1 Results of Neu5Ac an
34、d Neu5Gc in sample recovery test唾液酸样品实测值/gmL-1加标量/gmL-1实测值/gmL-1回收率/%平均值/%RSD/%Neu5Gc1.8840.9322.74297.37 98.431.361.8840.9322.81499.93 1.8840.9322.75999.98 1.8841.2433.09298.88 99.660.701.8841.2433.12399.87 1.8841.2433.134100.22 1.8841.8653.764100.40 100.161.861.8841.8653.820101.89 1.8841.8653.6819
35、8.19 Neu5Ac54.73636.47789.41798.03 99.512.0454.73636.47792.879101.83 54.73636.47790.01098.68 54.73648.636102.97499.61 100.340.6754.73648.636103.875100.49 54.73648.636104.334100.93 54.73672.954129.003101.03 102.000.8354.73672.954130.855102.48 54.73672.954130.885102.503.2.2 线性 平行制备3份系列标准曲线溶液，以Neu5Ac和
36、Neu5Gc浓度对各自的峰面积作图。Neu5Ac和Neu5Gc的回归方程分别为 Y=7.126 1X-10.544，r=0.999 8；Y=5.441 4X+0.2614，r=0.999 9，即 Neu5Ac 和 Neu5Gc分别在 25250 g mL-1和 0.55.0 g mL-1范围内线性关系良好。3.2.3 准确度 分别测定高、中、低 3 个浓度水平的加标供试品溶液，各浓度水平测定 3 次（表 1）。Neu5Gc 和 Neu5Ac 回收率分别为（99.631.33）%和（100.621.58）%，各 3 个浓度水平测定结果的总RSD 分别为1.3%和 1.5%，均小于 5%，符合准确
37、度验证要求。中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.1934 讨论新兴治疗型生物制品为各种疾病提供了治疗方法，但其免疫原性和疗效仍然是许多产品的主要问题10。鉴于非人哺乳动物细胞具备完整的类人蛋白翻译后修饰的功能，已上市的治疗型蛋白生物制品多由 Sp2/0、NS0 和中国仓鼠卵巢（CHO）等哺乳动物细胞表达，导致表达产物中含有非人哺乳动物细胞产生的 Neu5Gc，而 Neu5Gc 存在潜在的免疫原性风险11。生物技术产品中的 Neu5Gc 水平与宿主细胞系的种类和细胞培养方法密切相关。研究表明，在 NS0 或 Sp2/0 细胞中
38、表达的蛋白，其 Neu5Gc 水平显著高于 CHO 细胞表达的蛋白，这是由 NS0 或Sp2/0 细胞中CMAH 基因的高表达水平决定的12-13。此外，在 CHO 细胞或人源细胞的培养基中添加诸如胎牛血清等动物来源的产品，由于产品中 Neu5Gc可被细胞摄取，也会导致表达产物中 Neu5Gc 的含量增高14。还有研究发现，在缺氧条件下，即使采用人源细胞系，添加无 Neu5Gc 的细胞培养基，也会产生 Neu5Gc15。由此可见，建立灵敏准确的 Neu5Gc含量测定方法，对哺乳动物细胞表达株系的选择以及生产工艺的优化也具有重要意义。由于 Neu5Ac 是rhFSH 中的主要唾液酸形式，其含量与
39、 rhFSH 的体内生物学活性及半衰期密切相关16，因此现有的质控方法仅对 Neu5Ac 进行控制。为进一步提高和完善 rhFSH 药物的质量评价方法，加强对 rhFSH 药物的监管，应开发能够同时控制 rhFSH 药物中 Neu5Ac和 Neu5Gc 的分析方法。Neu5Ac 和 Neu5Gc为含有相同的 9 碳核心结构表 2 rhFSH 供试品溶液稳定性试验结果Table 2 sample solution stability Results of sample solution stability of rhFSH供试品Neu5Ac/gmL-1Neu5Gc/gmL-10 h12 h回收率
40、/%0 h12 h回收率/%188.172 87.694 99.52.970 3.099 104.3288.949 88.690 99.72.912 2.826 97.0388.076 88.718 100.72.898 2.841 98.0489.386 87.544 97.92.783 2.912 104.6588.990 88.581 99.52.797 2.740 97.9688.445 86.821 98.22.841 2.640 92.9表 3 不同生产企业的 rhFSH 样品中 Neu5Ac 和 Neu5Gc含量测定结果Table 3 Results of Neu5Ac and
41、Neu5Gc in rhFSH sample from different manufacturers生产企业批号Neu5Ac/gmL-1Neu5Gc/gmL-1A188.25488.93687.162101.75899.71299.16685.6622.1522.1522.1523.0132.8692.7264.44723B456C7的神经氨酸衍生物，Neu5Gc 是在 Neu5Ac 的乙酰基位置上发生羟基化得到17。当前表征分析上述 2 种唾液酸的主要研究方法是色谱法和质谱法18-19，通常在蛋白样品的前处理过程中，需通过酸解或酶解将唾液酸解离，再通过衍生化以达到稳定唾液酸结构、提高检测灵
42、敏度、增强分离度等目的。邻苯二胺类试剂是最常见的唾液酸衍生方法，利用此类试剂的氨基能够与唾液酸中的-酮基-羧基发生反应形成喹喔啉衍生物。与采用邻苯二胺衍生后形成有强紫外吸收的衍生物相比，以 DMB 作为衍生化试剂生成的衍生物具有荧光信号强、灵敏度高等优势，更适用于有效检测 rhFSH 药物中微量的 Neu5Gc。但 DMB 衍生法也存在缺点20，DMB及其衍生物具有光敏感性，自然光室温下易氧化，因此配制衍生试剂中常会加入连二亚硫酸钠等还原剂使其稳定。研究建立了同时对 rhFSH 中 NeuAc 和 NeuGc进行定量的 DMB 衍生法，克服了现有邻苯二胺衍生法分离度差、灵敏度低等缺陷。方法学验
43、证结果表明，该方法专属性强，其精密度和准确度均符合中华人民共和国药典（2020 年版）四部通则 9101 的要求21。应用本研究建立的方法，对不同企业不同批次的 rhFSH 原液进行测定，结果表明不同厂家生产的rhFSH，其 Neu5Ac 和 Neu5Gc含量均存在差异。这种唾液酸修饰差异与生产工艺密切相关，主要是表达 rhFSH 的哺乳动物细胞株系、细胞培养条件（如培养天数和培养基成分等）以及纯化工艺（如离子交换等对电荷有一定选择性的步骤）等方面存在差异。综上所述，本研究建立了DMB 衍生-高效液相色谱法同时测定 rhFSH 产品中的Neu5Gc 和 Neu5Ac，较好地弥补了现有质控方法的
44、不足，可能应用于rhFSH 产品的工艺开发、放行检验及生物类似药可比性研究。参考文献1 SUN H,GONG TT,JIANG YT,et al.Global,regional,and national prevalence and disability-adjusted life-years for infertility in 195 countries and territories,1990-2017:results from a global burden of disease study,2017J.Aging(Albany NY),2019,11(23):10952-10991.
45、（下转第 97页）中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.197药物警戒活动，建立并不断完善信息收集途径，主动、全面、有效地收集疑似药品不良反应信息并充分利用这些信息，及时、主动完善说明书，更好地保障公众用药安全。参考文献1 State Food and Drug Administration.Provisions for Drug Insert Sheets and Labels(SFDA Decree No.24)EB/OL.(2006-03-15)2023-11-09.https:/ Standing Committee
46、of the National People s Congress.Drug Administration Law of the People s Republic of ChinaEB/OL.(2019-08-26)2023-11-09.https:/ State Administration for Market Regulation.Provisions for Drug Registration(SMAR Decree No.27)EB/OL.(2020-01-22)2023-11-09.https:/ Center for Drug Evaluation of the Nationa
47、l Medicinal Products Administration.CDE Announcement on Issuing the Guidance for Summarizing Adverse Reaction Data for the Preparation of Anti-cancer Drug Package Inserts EB/OL.(2022-04-21)2023-11-09.https:/ Center for Drug Evaluation of the National Medicinal Products Administration.CDE Announcemen
48、t on Issuing the Guidance for the Reference Safety Information in Investigator s BrochureEB/OL.(2022-01-04)2023-11-09.https:/ Center for Drug Evaluation of the National Medicinal Products Administration.Announcement on Issuing the Draft Guidance for the Safety Information in Package Inserts for Anti
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50、Products Administration.NMPA Announcement on the Revision of the Package Insert of Apatinib Mesylate TabletsEB/OL.(2020-01-21)2023-11-09.https:/ National Medicinal Products Administration.NMPA Announcement on the Revision of the Package Insert of Gefitinib TabletsEB/OL.(2021-01-25)2023-11-09.https:/
