1、第41卷第1期2024年1月D01:10.3969/j.issn.1005-202X.2024.01.014Ca2+在电磁场调控成骨细胞增殖与分化中的作用中国医学物理学杂志Chinese Journal of Medical PhysicsVol.41 No.1January 2024医学生物物理-95-张广伟1，梁卓文,杨治1.陕西中医药大学第二临床医学院，陕西咸阳7 12 0 46；2.空军军医大学西京医院骨科，陕西西安7 10 0 3 2；3.红会医院关节病医院关节翻修病区，陕西西安7 10 0 54【摘要】目的：从定性和定量的角度探究电磁场（EMF）对成骨细胞内Ca2+变化的影响，并试
2、图探明Ca2+在电磁场调控成骨细胞增殖与分化中的作用。方法：搭建频率为3 8.7 Hz，强度为1.5mT的正弦EMF发生平台，将MC3T3-E1成骨细胞随机分为对照组和实验（EMF）组。EMF组施加EMF干预，每天干预8 h。利用CCK8检测成骨细胞增殖，ALP染色检测成骨细胞分化，Ca2+荧光探针和流式细胞仪检测成骨细胞内Ca2+浓度。结果：CCK8细胞增殖结果显示，EMF干预48、7 2、9 6 及120h，可显著促进成骨细胞增殖。ALP染色结果显示EMF干预14d后，EMF组ALP表达显著高于对照组。Ca2+荧光探针及流式细胞仪检测Ca2浓度结果显示EMF干预可促进成骨细胞内Ca2+的增
3、多。结论：EMF上调成骨细胞内Ca2+信号可能与EMF促成骨细胞增殖和分化密切相关，但是哪些与Ca相关的生物信号通路参与了EMF促成骨细胞增殖和分化效应，有待进一步研究。【关键词】电磁场；成骨细胞；钙离子；细胞增值；细胞分化【中图分类号】R318Role of Ca2t in electromagnetic field regulation on osteoblast proliferation and differentiation【文献标志码】A【文章编号】10 0 5-2 0 2 X（2 0 2 4)0 1-0 0 9 5-0 6ZHANG Guangwei,LIANG Zhuowen,
4、YANG Zhi?1.The Second Clinical Medical College of Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712046,China;2.Department ofOrthopedics,Xijing Hospital,Air Force Medical University,Xian 710032,China;3.Joint Revision Unit,Arthritis Hospital,HonghuiHospital,Xian 710054,ChinaAbstract:Objective To exp
5、lore the effects of electromagnetic field(EMF)on thechange of Ca2+in osteolbast from thequalitative and quantitative perspectives,and try to identify the role of Ca2+in EMF regulation on osteoblast proliferation anddifferentiation.Methods A platform was established for generating sine EMF with a fre
6、quency of 38.7 Hz and a strength of1.5 mT.The MC3T3-El osteoblasts were randomly divided into control group and experimental group(EMF intervention for8 h per day).CCK8 was used to detect osteoblast proliferation,ALP staining to detect osteoblast differentiation,andCa2+fluorescence probes and flow c
7、ytometer to detect the Ca2*concentration in osteoblasts.Results CCK8 result showedthat EMF intervention for 48,72,96 and 120 h could significantly promote osteoblast proliferation.After 14 days of EMFintervention,the positive expression of ALP was significantly higher in EMF group than in control gr
8、oup.Ca?fluorescentstaining and flow cytometry results revealed that EMF intervention could increase the Cain osteoblasts.Conclusion TheEMF-induced upregulation of Ca2+signal in osteoblasts may be closely related to the promotions of osteoblast proliferationand differentiation by EMF,but which Ca-rel
9、ated biosignaling pathways are involved in the EMF promoting osteoblastproliferation and differentiation remains to be further investigated.Keywords:electromagnetic field;osteoblast;calcium ion;cell proliferation;cell differentiation前言【收稿日期】2 0 2 3-0 9-0 8【基金项目】国家自然科学基金（519 0 7 19 7）【作者简介】张广伟，硕士研究生，
10、主治医师，研究方向：关节修复，E-mail:【通信作者】杨治，博士，主任医师，研究方向：股骨头坏死，E-mail:电磁场(Electromagnetic Fields,EMF)作为一种非侵人性物理因子，自Bassett等首次报道EMF可加速骨折愈合以来,EMF成为研究热点，近年来EMF的积极生物效应在伤口修复2-3 、骨愈合4-5 和神经再生6-7 中得到证实。然而关于其机理却尚未阐明。Ca作为细胞内重要的第二信使,参与了许多生理功能的调节。诸多研究报道了EMF干预可改变细胞内游离的Ca+稳态。Bertagna等8 报道了EMF可促进人-96-胚胎肾细胞HEK293细胞Ca内流。Golbach
11、等9 研究认为低频EFM会影响体外培养细胞的Ca2稳态。Wei等10 发现EMF通过激活HSP70热休克蛋白来改善Ca2+的稳态，从而保护心脏，减轻缺氧心肌细胞的损伤。Liburdy等l也曾报道6 0 HzEMF可以增加胸腺淋巴细胞中丝裂原激活信号转导过程中的Ca*内流。Lindstrom等12 发现静止的JurkatE6.1细胞暴露于50 Hz的EMF下,诱导Ca振荡上调，认为其作用机制是存在靶蛋白可以上调细胞内Ca2+,并促进细胞增殖。虽然诸多文献报道了EMF与细胞内Ca2+稳态的相关性，但是这些研究侧重于神经内分泌系统和免疫系统的细胞，而对于EMF是否影响成骨细胞内Ca2+稳态的研究较少
12、。因而，本研究拟通过Ca2+荧光探针、成像型流式细胞技术，从定性和定量的角度探究EMF对成骨细胞内Ca2变化的影响。并试图探明Ca2+在EMF调控成骨细胞增殖与分化中的作用。材料和方法1.1细胞、试剂及设备小鼠成骨细胞系MC3T3-E1（中乔新舟，中国），中国医学物理学杂志MEM-培养基(Gbico,USA）,胎牛血清（中乔新舟，中国）,青霉素链霉素混合液（Gbico,USA）,碱性磷酸酶（ALP)染色试剂盒（Beyotime,中国）4%多聚甲醛固定液（Beyotime，中国），0.2 5%胰蛋白酶（Gbico,USA）,C C K 8（C e ll C o u n t i n g K i t
13、-8)细胞增殖检测试剂盒（Boster，中国），磷酸盐缓冲液（PBS,Boster,中国），Fluo-3/AM钙离子荧光探针试剂盒（Solarbio,中国），二氧化碳培养箱（Thermofishe,USA），成像型流式细胞仪（Luminex，U SA），荧光显微镜（Zessi,USA),酶标仪Gen5(BioTek,USA)。1.2EMF发生装置EMF发生装置由3 部分组成（图1a）：波形发生器（鼎阳SDG2082X，中国），高性能功率放大器（A i g t e k-A T A 3 0 9,中国）,亥姆霍兹线圈（上海天端磁电-HLY10-20,中国）。电磁场的信号发生器生成幅度为3 Vp-p，
14、频率为3 8.7 Hz的正弦波（图1b），通过功率放大器驱动放置于二氧化碳培养箱内的半径为100mm的亥姆霍兹线圈（匝数为153），产生强度为1.4mT(有效值)的电磁场（图1c）。EM F发生装置效果图如图1d所示。实物图如图1e所示。第41卷RRHighSignalCurrentGenerator0Amplifier1.5V38.7Hz图1EMF发生装置Figure1EMFgeneratora：EM F系统的原理框图，该设备由3 个主要部分组成：信号发生器、高性能功放和亥姆霍兹线圈；b：信号发生器开路电压信号；c:EMF强度测量结果d:EMF发生装置效果图;e:EMF发生装置实物图第1期1
15、.3分组设计将接种的细胞随机分为对照组和实验(EMF)组。EMF组施加3 8.7 Hz,场强1.4mT的正弦EMF干预,每天干预8 h。对照组在同等条件下未施加EMF干预。1.4细胞增殖检测CCK8检测细胞增殖。将细胞数以510 3 个/L的密度种植在9 6 孔板。两组细胞分别在培养2 4、48、7 2、96、12 0 h 后，弃去培养基，用PBS洗涤两次，加人含有10%CCK8的无血清培养基放人3 7 C的CO,孵箱进行孵育2 h后,用酶标仪测量各孔光密度(OD)值。1.5细胞分化检测ALP染色检测成骨细胞的分化成熟，成骨细胞接种于6 孔板,待细胞贴壁后EMF分别干预7 和14d,弃培养基，
16、PBS洗涤两次，每孔加人3 0 0 L的4%多聚甲醛固定15min,PBS洗涤3 次，加入配制好的ALP染色工作液，室温避光孵育3 0 min,PBS适当洗涤，保留适当PBS溶液，放置显微镜下观察拍照1.6Ca2+荧光探针检测成骨细胞接种于6 孔板,EMF干预3 d后,PBS洗涤,加人现配的浓度为0.5nmol/L，比例1:1的Fluo-3AM和PluronocesF-127混合工作液150 L,37C的条件下孵育2 0 min后,加人5倍体积的含1%胎牛血清的4-羟乙基哌秦乙硫磺酸(HEPES)再次孵育40 min(37C），用HEPES洗涤后，再次孵育10 min，加入4,6-二基-2 苯
17、基吲哚(DAPI)复染1min，吸弃DAPI染色液，加人PBS适当洗涤，保留适量PBS，在荧光显微镜下进行观察拍照1.7流式细胞仪检测Ca2浓度6孔板培养成骨细胞，EMF干预3 d后，0.2 5%胰酶消化分离细胞，细胞悬液离心10 0 0 r/min,5min，弃上清，加PBS重悬，离心后弃上清液，重复3 次。配制Fluo-3/AM荧光探针工作液，6 孔培养板每孔加入500L的工作液，3 7 孵育2 0 min，加入5倍体积的含有1%胎牛血清(FBS)的HBSS液(2.5mL）,继续孵育40 min，用HEPES液洗涤细胞3 次，再次用HEPES液重悬细胞制成110 的溶液。使用成像型流式细胞
18、仪检测两组成骨细胞内Ca2单色荧光强度，IDESA6.2分析软件分析两组细胞Ca2荧光强度。1.8统计学分析计量数据用均值标准差表示，采用GraphpadPrism9对数据进行非配对t检验,P0.05认为差异有统计学意义。2结果2.1 CCK8细胞增殖检测两组细胞OD值随干预时间的变化如图2 所示。干预2 4h后,EMF组OD值与对照组无统计学差异。张广伟，等.Ca2+在电磁场调控成骨细胞增殖与分化中的作用著促进成骨细胞增殖。1.00.8-0.60.4-0.20图2 对照组及EMF组光密度值随干预时间的变化（*P0.05)Figure 2 Variation of optical densit
19、y(OD)with intervention time incontrol and EMF groups(*P0.05)2.2ALP细胞分化检测两组细胞干预7 和14d后ALP染色结果如图3所示。蓝紫色表明ALP表达阳性。EMF干预7 d后，EMF组ALP表达稍高于对照组。EMF干预14d后，EMF组ALP表达显著高于对照组。ALP染色结果表明,EMF可促进成骨细胞分化。对照组7d14d图3 对照组及EMF组细胞在干预7 和14d后ALP染色结果（比Figure 3 Results of ALP staining in control and EMF groupsafter 7 and 14
20、days of intervention(scale bar:100 m)2.3.Ca2荧光探针检测两组细胞干预3 d后，Ca?+荧光染色结果如图4所示。绿色荧光指示细胞质内游离的Ca+。蓝色荧光指示DAPI复染的细胞核。染色结果显示EMF组Ca2绿色荧光强于对照组。表明EMF干预可促进成骨细胞内游离Ca2增多。-97-干预48、7 2、9 6 及12 0 h后,EMF组OD值高于对照组(P0.05）。表明EMF千预在48、7 2、9 6 及12 0 h，可显对照组*+EMF组2448例尺:10 0 m)72t/h96120EMF组-98-中国医学物理学杂志Fluo-3/AMDAPI第41卷M
21、erge对照组EMF组图4对照组及EMF组细胞在干预3 d后Ca2+荧光染色结果（比例尺：50 m）Figure 4 Results of Ca2+fluorescence staining in control and EMF groups after 3 days ofintervention(scale bar:50 um)Fluo-3/AM:Ca+荧光染色图,DAPI:细胞核染色图,Merge:Ca?+荧光染色和细胞核染色合成图2.4流式细胞仪检测Ca2+浓度两组细胞干预3 d后，经流式细胞仪采集3 0 0 0 个单细胞荧光强度,得到的Ca2*荧光强度图和Ca2*荧光强度统计结果如图5
22、所示。形态学结果显示，EMF组Ca2+荧光强度高于对照组（图5a）。经统计学分析两组细胞Ca2+荧光强度，结果显示EMF组Ca+荧光强度显著高于对照组(P0.05）。表明EMF干预可促进成骨细胞内游离Ca2+的增多。3讨论本研究选择频率为3 8.7 Hz的正弦EMF，根据离子回旋共振方程f。=q B/2 元m(f是离子回旋频率，q是离子电荷，B是地磁场强度，m是离子质量）,B为3070T,可计算出Ca2*的共振频率是3 8.7 Hz/13-15。本研究发现利用该参数的正弦EMF可促进成骨细胞的增殖和分化,这与Galli等16 报道的正弦EMF可促进成骨细胞的增殖和分化结果相一致。此外,本研究利
23、用Ca+荧光探针、成像型流式细胞技术，从定性和定量的两个角度均发现EMF(38.7Hz,1.5mT)可促进成骨细胞内游离Ca2的增多这一实验现象。Zhang等17 通过对成骨细胞实时加载EMF(50Hz,0.8mT)用荧光显微镜进行检测,通过对图像的光密度分析后，观察到实时加载EMF的成骨细胞内Ca2+明显上调,该研究结果与本文研究结果一致。此外,Chen等18 报道了16 Hz脉冲电磁场可促进人源间充质基质细胞（SCP-1)Ca2+内流，Spadaro等19 也发现脉冲电磁场(PEMF)可上调细胞内Ca2浓度。Tong等2 0 在研究中也报道了PEMF通过增强细胞内钙瞬变来影响成骨细胞的增殖
24、和分化。Raouf等2 1 报道在磁性纳米材料和EMF的干预下钙通道基因的mRNA表达增高，同时也从侧面验证了细胞内钙离子增多的现象。上述研究结果表明EMF促进成骨细胞增殖和分化与EMF上调细胞内Ca2密切相关。但是哪些Ca2+相关的生物信号通路参与了EMF促成骨细胞增殖和分化效应，尚有待进一步研究。细胞内游离的Ca+作为第二信使,是细胞功能和存活的基础，它与多条信号通路密切相关，部分研究者从信号通路方面对EMF的生物效应机理进行解释。例如非经典Wnt/Ca2通路中的非经典Wnt配体(Wnt-5a）可通过激活NLK,形成复合抑制体，通过组蛋白H3-K9的甲基化使PPAR-的功能失活,起到促成骨
25、作用2 2-2 3 ,Wnt/Ca2*信号通路被认为是发育过程中的一个重要介质。此外，Ras信号通路作为Ca2+依赖的信号通路，在成骨细胞增殖和分化中发挥作用2 42 5。Ca与这些通路相互交织,共同维持了细胞生存和功能,对Ca2相关信号通路的深人研究能更好地探明EMF生物效应机理。4结论本研究搭建了频率为3 8.7 Hz,强度为1.5mT的正弦EMF发生平台，利用该参数EMF干预MC3T3-E1成骨细胞，发现这一参数的EMF可促进成骨细胞的增殖和分化,同时也发现了EMF干预可促进成骨细胞内游离Ca+的增多。结果表明,EMF上调成骨细胞内Ca2信号可能与EMF促成骨细胞增殖和分化密切相关，但是
26、哪些Ca?+相关的生物信号通路参与了EMF促成骨细胞增殖和分化效应，尚有待进一步研究。第1期张广伟，等.Ca2+在电磁场调控成骨细胞增殖与分化中的作用对照组99EMF组福福*3x1052x1051x105.1.8-1.01.50.81.20.60.4-0.60.3001x1031x104荧光强度Figure 5 Results of Ca2+concentration detected by flow cytometer in control and EMF groups0对照组EMF组b:Ca2+荧光强度统计图(*P0.05)0.201x1051x106a:Ca2+荧光强度图图5对照组及EM
27、F组流式细胞仪检测Ca2浓度结果110701x1031104荧光强度1x1051x1061x107【参考文献】1 Bassett CA,Pawluk RJ,Pilla AA.Augmentation of bone repair byinductively coupled electromagnetic fields J.Science,1974,184(4136):575-577.2 ZZanotti F,Trentini M,Zanolla I,et al.Playing with biophysics:howa symphony of different electromagnetic
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