1、生物素生物素-亲和素标识技术亲和素标识技术食安食安05010501类春燕类春燕 孙隽孙隽 陈春艳陈春艳 孙晓丽孙晓丽 李臻佳李臻佳1/23是生物体内广泛分布一个羧化酶辅是生物体内广泛分布一个羧化酶辅酶，分子中有两个环状结构：酶，分子中有两个环状结构：环为咪唑酮环，是与亲和素结环为咪唑酮环，是与亲和素结合主要部位。合主要部位。环为噻唑环，上有一戊酸侧链，环为噻唑环，上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其它生物其末端羧基是结合抗体和其它生物大分子（如：酶、蛋白质、抗体、大分子（如：酶、蛋白质、抗体、DNA）唯一结构。）唯一结构。生物素生物素（Biotin）辅酶R、维生素H2/23 利用生物素羧基
2、加以化学修饰可制成各种活性利用生物素羧基加以化学修饰可制成各种活性生物素，以适合与各种生物大分子结合需要。生物素，以适合与各种生物大分子结合需要。主要有用于标识蛋白质氨基生物素主要有用于标识蛋白质氨基生物素N羟基丁羟基丁二酰亚胺酯（二酰亚胺酯（BNHS）和生物素对硝基酚酯）和生物素对硝基酚酯(pBNP),其中以其中以BNHS最为惯用。近年来，应最为惯用。近年来，应用长臂生物素（用长臂生物素（BCNHS）标识生物大分子，）标识生物大分子，能够降低位阻效应，增加检测灵敏度和特异性。能够降低位阻效应，增加检测灵敏度和特异性。用于标识蛋白质醛基、巯基和糖基衍生物有生用于标识蛋白质醛基、巯基和糖基衍生物
3、有生物素酰肼（物素酰肼（BHZ）及肼化生物素（）及肼化生物素（BCHZ）。）。3/234/23亲和素（亲和素（Avidin）抗生物素蛋白、抗生物素 是从鸡蛋清中提取一个糖蛋白，它是从鸡蛋清中提取一个糖蛋白，它由四个相同氨基酸亚基组成，亚基由四个相同氨基酸亚基组成，亚基之间经过二硫键连接，亲和素每一之间经过二硫键连接，亲和素每一个亚基含有一个与生物素结合位点，个亚基含有一个与生物素结合位点，并与生物素或其衍生物形成高度稳并与生物素或其衍生物形成高度稳定复合物。定复合物。5/23基本原理基本原理生物素与抗体共价交联方法简单，条件温生物素与抗体共价交联方法简单，条件温和，且普通不影响抗体活性。生物素
4、与亲和，且普通不影响抗体活性。生物素与亲和素能快速结合，而且反应不受外界干扰，和素能快速结合，而且反应不受外界干扰，含有高度特异性和稳定性，二者亲和常数含有高度特异性和稳定性，二者亲和常数比抗原抗体反应高比抗原抗体反应高10100万倍，结合快，万倍，结合快，呈不可逆反应，而且在呈不可逆反应，而且在pH，温度、有机溶，温度、有机溶剂或变性剂较大改变范围内均能稳定存在。剂或变性剂较大改变范围内均能稳定存在。6/237/23生物素亲和素系统（生物素亲和素系统（BASBAS）用于检测基本方法有三类：）用于检测基本方法有三类：I.标识亲和素连接生物素化大分子反应体系，标识亲和素连接生物素化大分子反应体系
5、，称称BA法，或标识亲和素生物素法法，或标识亲和素生物素法（LBA）。）。II.以亲和素两端分别连接生物素化大分子反以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标识生物素，称为应体系和标识生物素，称为BAB法法，或桥，或桥联亲和素生物素法（联亲和素生物素法（BRBA）。）。III.将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素生物素过氧化物酶复合物，再与生物素生物素过氧化物酶复合物，再与生物素化抗抗体接触时，将抗原抗体反应体系化抗抗体接触时，将抗原抗体反应体系与与ABC标识体系连成一体，称为标识体系连成一体，称为ABC法法，其中其中AAb为亲和素化抗体，为亲和素化抗体，B
6、-Ab为生物为生物素化抗体。素化抗体。8/231.BA-酶免疫技术原理亲和素可预包被在酶标板孔内，然后再亲和素可预包被在酶标板孔内，然后再将生物素化抗体将生物素化抗体Ab(Ab(或抗原或抗原Ag)Ag)包被于孔包被于孔内。经过内。经过BABA将免疫复合物与酶连接起来，将免疫复合物与酶连接起来，能有效地放大能有效地放大EIA法，使其灵敏性增强。法，使其灵敏性增强。9/23优点优点生物素反抗体和酶生物素反抗体和酶标识率高标识率高，又不影响其它，又不影响其它活性。活性。生物素亲和素结合生物素亲和素结合极为稳定极为稳定，不会在孵育和，不会在孵育和各种洗涤过程中脱落。各种洗涤过程中脱落。每个亲和素分子能
7、结合每个亲和素分子能结合4个生物素，能耦合个生物素，能耦合更多联结生物素酶分子，更多联结生物素酶分子，提升提升EIA敏感性。敏感性。10/23双抗体夹心生物素双抗体夹心生物素-亲和素亲和素ELISA法检测法检测 相思子毒素相思子毒素用亲和素用亲和素-生物素生物素ELISA检测检测GPV抗体抗体生物素亲和素放大酶联免疫吸附法测定双生物素亲和素放大酶联免疫吸附法测定双酚酚A11/232.BA-分子生物学技术 将引物生物素化，经过将引物生物素化，经过PCR反应后反应后,用用(链霉链霉)亲和素亲和素固定扩增产物，进行下一步显色或荧光等检测。固定扩增产物，进行下一步显色或荧光等检测。生物素化引生物素化引
8、物扩增目标物扩增目标基因基因微孔板内链霉微孔板内链霉亲和素捕捉亲和素捕捉PCR扩增产物扩增产物用地高辛标识用地高辛标识寡核苷酸探针寡核苷酸探针进行杂交进行杂交酶标抗体进酶标抗体进行显色反应行显色反应12/23 在分子生物学技术中较惯用技术还有：将核酸在分子生物学技术中较惯用技术还有：将核酸 探针结合上生物素，经过酶或其它示踪物标识亲和探针结合上生物素，经过酶或其它示踪物标识亲和 素进行显色等。素进行显色等。扩增扩增rRNA目标序列目标序列 与生物素化与生物素化 探针进行杂交探针进行杂交 经过微孔板内链霉亲经过微孔板内链霉亲 和素捕捉和素捕捉 被捕捉目标序列再次进被捕捉目标序列再次进 行碱性磷酸
9、酶标识探针杂交反应行碱性磷酸酶标识探针杂交反应 用化学发光微孔法检测用化学发光微孔法检测 13/233.BA-电化学免疫技术电化学免疫技术原理原理 将酶将酶1标识抗体结合在碳电极表面标识抗体结合在碳电极表面组成传感器，与液体中待检抗原和组成传感器，与液体中待检抗原和生物素化抗体及酶生物素化抗体及酶2标识亲和素免标识亲和素免疫反应后，碳电极表面形成酶疫反应后，碳电极表面形成酶1和和酶酶2免疫通道，结果电信号被放大。免疫通道，结果电信号被放大。14/23优点点灵敏灵敏快速快速可定量可定量15/23应用应用n临床诊疗临床诊疗n生物医学生物医学n生物化学生物化学n环境监测环境监测16/234.BA-免
10、疫印迹技术该技术将该技术将BA技术与免疫印迹技术相结合技术与免疫印迹技术相结合,进一进一步提升检测灵敏度。步提升检测灵敏度。免疫印迹技术是在蛋白凝胶电泳和固相免疫免疫印迹技术是在蛋白凝胶电泳和固相免疫测定基础上发展起来一个新免疫学技术。是测定基础上发展起来一个新免疫学技术。是凝胶电泳高分辨率和固相免疫测定特异性、凝胶电泳高分辨率和固相免疫测定特异性、敏感性、稳定性及可重复性有机结合。敏感性、稳定性及可重复性有机结合。17/23过碘酸钠偶联亲和素与辣根过氧化物酶生物素酯化（生物素+N-羟基琥珀亚胺N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯）生物素酯标识单克隆抗体样品经SDS-PAGE电泳对醋酸纤维素膜进行BA-
11、酶免疫染色光密度计扫描定量检测18/235.BA-组织化学技术利用利用BA 技术将染料浓聚于靶细胞表面，使技术将染料浓聚于靶细胞表面，使其更利于观察，其更利于观察，提升了检测灵敏度。提升了检测灵敏度。Xia Y1 等在生物素化黑皮质素与黑色素瘤等在生物素化黑皮质素与黑色素瘤细胞结合后，细胞结合后，加入碱性磷酸酶加入碱性磷酸酶-亲和素进行亲和素进行染色检测，染色检测，证实了黑皮质素结合受体位于证实了黑皮质素结合受体位于黑色素瘤细胞表面。黑色素瘤细胞表面。PereiraMM 等将等将ABC(生物素生物素-亲和素亲和素-过过氧化物酶氧化物酶)染色法用于钩端螺旋体组织细胞染色法用于钩端螺旋体组织细胞损
12、害进行定位检验，损害进行定位检验，结果简单易测，此法结果简单易测，此法经惯用于免疫组织化学检测中。经惯用于免疫组织化学检测中。19/236.BA-6.BA-分离提纯技术分离提纯技术待分离物生物素化，结合于亲和素包被固相载体上，待分离物生物素化，结合于亲和素包被固相载体上，洗脱后，到达分离提纯目标。洗脱后，到达分离提纯目标。Morag G.Morag G.等使用硝基等使用硝基-(-(链霉链霉)亲和素吸附于分离亲和素吸附于分离柱上柱上,分离提纯兔抗血清中免疫球蛋白、抗分离提纯兔抗血清中免疫球蛋白、抗-转移转移因子等因子等,每一例均可在解离生物素化探针后每一例均可在解离生物素化探针后,恢复恢复分离柱
13、生物学特征。分离柱生物学特征。在制备特异性破骨细胞在制备特异性破骨细胞cDNAcDNA库时库时,加入加入生物素化生物素化mRNA,mRNA,然后经过固相亲和素提取。然后经过固相亲和素提取。用斑点印迹法分析用斑点印迹法分析,发觉在此提取物中发觉在此提取物中,高度聚集了特异性破骨细胞高度聚集了特异性破骨细胞cDNAcDNA。20/237.BA-7.BA-时间分辨荧光免疫技术（时间分辨荧光免疫技术（BA-TR-BA-TR-FIAFIA）应用应用BA-TR-FIA检测肿瘤细胞和血清中肌酸转移检测肿瘤细胞和血清中肌酸转移 BB(CK-BB),BB(CK-BB),发觉发觉CK-BBCK-BB是乳腺癌一个敏
14、感指标是乳腺癌一个敏感指标,前列前列腺癌病人血中腺癌病人血中CK-BBCK-BB也显著提升也显著提升,所以认为该方法是研所以认为该方法是研究究CK-BBCK-BB与各种恶性肿瘤关系敏感特异方法。与各种恶性肿瘤关系敏感特异方法。该法中使用生物素化该法中使用生物素化AbAb和和Eu3+(Eu3+Eu3+(Eu3+是发光效率、涂敷是发光效率、涂敷稳定性、回收成本等最好荧光粉稳定性、回收成本等最好荧光粉)标识亲和素标识亲和素,经过经过BABA技术多级放大作用技术多级放大作用,使得使得Ag-AbAg-Ab复合物中螯合物复合物中螯合物Eu3+Eu3+信信号更强号更强,提升了检测灵敏度。提升了检测灵敏度。21/238.BA-预定位技术 这项研究近年来发展快速这项研究近年来发展快速,现已从动物试验阶段进现已从动物试验阶段进入临床应用研究。入临床应用研究。Yao Z.等利用植物血凝素能与肿瘤细胞表面糖蛋等利用植物血凝素能与肿瘤细胞表面糖蛋白和糖脂上糖分子结合白和糖脂上糖分子结合,亲和素末端亲和素末端N-乙酰葡萄乙酰葡萄糖胺和甘露糖残基能与植物血凝素结合特征糖胺和甘露糖残基能与植物血凝素结合特征,用放用放射性同位素标识生物素进行肿瘤定位。射性同位素标识生物素进行肿瘤定位。22/23Thank you!23/23
