1、09国贸社会实践调查论文当代大学生消费的现状及对策 目录前言：2一、当代大学生消费的基本情况的调查2二、当代大学生消费存在的问题分析3三、对当代大学生消费情况调查分析的对策4四、经验体会5五、结束语5附录：6当代大学生消费的现状及对策 实践时间：2012年6月 调查方式：网络问卷（问卷见附录） 调查对象：大学生前言：本次社会实践的主要目的是调查当代大学生消费的消费情况，发现其现存的问题，寻求解决的方案，加强大学生健康的消费观念的培养与塑造，引导当代大学生形成正确的消费观。大学生作为社会时代发展的新生代力量，这对于构建节约型社会具有非常重要的意义。为了了解当前我国大学生的消费状况，引导大学生消费
2、文化的健康发展，本小组五位成员在2012年6月份初开展调查研究，此次实践活动的相关情况报告于下：一、当代大学生消费的基本情况的调查本小组利用便捷的网络渠道对大学生进行在线问卷调查，总结大学生消费现状。网络问卷以单选的形式主要调查大学生消费结构，每月消费金额以及支出等各个方面，还涉及各方面的消费比重。此外，我们小组也对一些在校大学生进行实际访问以及网络资料间接经验的采纳，以更好判断分析大学生当前消费情况。本次问卷共有70份答卷回收，具体事项罗列如下：1、性别，2、每月消费总开支，3、生活费来源，4、每月娱乐消费，5、每月书籍文化消费，6、日用品和护肤品消费选择，7、出游频率，8、网购频率，9、服
3、装消费，10、每月网购消费，11、大学生活费超支情况，12、大学生活幸福感。二、当代大学生消费存在的问题分析对此次问卷调查各个问题总结分析得出结论。参加调查的大学生男女比例基本持平。但是从问卷上发现当代大学生消费的确存在许多的问题。以下是问卷分析的结果和大学生消费存在的问题：1、 大学生当中贫富差距大，在一个月消费总开支中，消费500元以下和1000元以上的比例共占34.28%，只有65.71%的学生消费在5001000元之间。按照当前的学生消费水平，有其他资料显示每月消费400元以下的也占到7.32%。学生中处于贫困与富裕的两端占了很大比重，贫富差距或消费水平差距大。大学生之中的贫富差距的扩
4、大，会引起消费者心里的变化，部分学生出现攀比等情况，使得消费水平呈不健康的增长趋势。2、 当代大学生依赖性强，从大学生消费资金来源看，61.43%的大学生都是完全由父母供给，只有3.33%全靠自己打工供给学费，也有部分自己出去兼职工作，减轻家庭负担。这与上世纪的大学生情况相反，当代大学生的敢于吃苦的精神下降。当代大学生的每月的生活费基本来自父母，在任意挥霍的同时无法了解父母背后的辛酸。3、 消费观念注重品牌，15.71%左右的大学生选择品牌用品，包括日用品、护肤品和服装。其他则以便宜和中等品质为主，47.14%的学生选择中等质量的服装，学生的消费观趋向中等品质到高等品质化发展。当代大学生中不乏
5、一些同学热衷于购买高档消费品，给自己的家庭带来更大的经济压力，当父母所给的生活费不足以支付时就会产生一些不良的想法，甚至会带来社会的不安定，给自己和家庭带来不利。4、 文化修养建设消费低。从问卷数据显示，70%的学生在书籍文化上消费很少，低于50元，有些甚至不会花费一分钱，可以看到当代大学生积累文化意识薄弱，在自己的价值观、奋斗观都不尽人意，对知识文化的缺乏积极意识。此外，每月消费书籍用品200元以上占到5.71%，可见喜欢读书的学生还有，但是不多，大学生活过于散漫，或学生追求知识以外的社会经验、娱乐等，缺乏正确和积极正确的引导和有效督促。这种情况长久以往将不利于大学生大学生活的充实，必要的文
6、化建设消费是必须的，这也需要高校的老师给学生提供正确的引导和建议。5、 大学生网购流行。随着网络信息技术的普及，网络营销也不断完善。大学生网购频繁，占了大量的消费比重，只有10%的学生从不网购，72.86%的学生偶尔网购，因此网购在学生当中相当普及，而且17.14%的学生经常网购，消费比重中看出大学生消费结构和价值取向。网上购物虽然一定程度上能够给大学生带来方便，但网购还是存在风险的，这正像投资股票一样，需要用理性的态度去对待，正所谓：“过犹不及”。6、 缺乏理财知识。从大学生生活费使用情况调查看，有30%的学生总是超支不够用，一半不到的学生才刚刚好够用，虽然是大学生，但如今大学生独立生活能力
7、却有所下降，在理财方面的只是很欠缺，但是又很少的同学意识到学校财务管理等相关理财知识的重要性，忽视学校的教学。不合理性消费确实在大学生当中较为普遍。很多同学到了月底不得不“省吃俭用”，因为一个月的生活费没有合理的安排，到了月底就捉襟见肘了。三、对当代大学生消费情况调查分析的对策1、缩小大学生生活的贫富差距。由于中国的现状是贫富悬殊，大学生当中存在贫富差距也是不可避免的，但是政府和校方应当在这方面做出相应的政策援助措施。在贫困生方面：补助贫困生的生活需要。在助学金上做到事实求是，公平公正，严厉打击虚假申请的行为。同时校方可以积极邀请校外成功人士资助贫困生或提供兼职机会，维持贫困大学生的基本生活，
8、使他们能够在保持正常生活水平的情况下更好地投入学习。在富裕生方面：引导学生建立正确的价值观、消费观，杜绝浪费、挥霍等行为，鼓励富足学生帮助贫困地区的孩子，献一份爱心。对于富足学生来说，因为生活条件的富足，可能会产生超越他人、歧视贫困生的想法，老师们应当多做引导工作。2、重视班主任等任课老师对学生的引导，增强大学生自强独立意识。中国经济社会的发展使人民生活水平不断提高，孩子们在家里也习惯养尊处优，在学校娱乐享受。学生高分低能，大学生未来啃老的批判在社会上愈发激烈。学校等一些社会机构可以鼓励学生创业，发掘他们的潜力，实现价值，发扬敢于吃苦、奋斗的精神。学生对自己没有汗水的金钱就会挥霍，而不懂得如何
9、健康消费，建立合理的消费结构，养成良好的消费习惯。大学中自觉能力非常重要，从教育管制很严的高中进入松散的大学，给大学生提供了散漫的土壤，因此，教师班主任也应当继续发挥健康引导和督促的作用，引导大学生健康消费。对于一些纨绔分子，班主任或校方可进行个别交流，使其明白健康消费的重要性。3、组织活动，培养文化氛围。注重品牌消费有保障，但是也不排除大学生品牌消费盲目跟风攀比的情况。甚至有些大学生在自己能有之外还节衣缩食坚持消费高档品，这就是错误的消费观念。在校园当中可以鼓励自己设计、制作衣服比赛等活动，倡导价廉物美的购物消费概念。让健康消费的概念深入人心，杜绝奢侈浪费的作为，那么即便家里富足或想要显摆的
10、学生就会有所收敛。4、限制网络购物。网购确实能够推动经济发展，并且方便便捷，学生也不用为一件商品东奔西跑，或花大代价跑到实体店购买，能够为大学生节省更多的时间。但是网络商场商品玲琅满目，网络市场逐渐完善，高效的购物效率，吸引了广大的学生群体浏览商品进行网络消费，形成经常网购浏览商品的习惯，当然也导致在网上商场消费了很多自己不需要的商品，浪费了大量的时间。对个体的调查中发现，经常网购的以女生为主，而且在她们无聊消磨时间的方法就是网购。万事相互效力，而且过犹不及，所以自控力比较弱的学生，应当真正把自己的钱花在刀刃上，真正让物有所值。5、重视财务管理等相关的理财课程的学习。学校都有开设财务方面的课程
11、，专业学生会认真学习，而非专业学生可能就不当回事，学校应当重视财务管理的课程，帮助学生掌握管理财务的方法，树立正确的金钱观，实现财务合理化科学化管理。消费结构也体现学生价值取向，学生在生活消费和学习消费应当有合理的比例，学生更应该在校认真学习课业，学会理财，正确消费。 6、多关心父母及家人，在富余的时间内有机会就去参与社会实习，在增强积累社会经验的同时还能适当地减轻家庭部分经济压力。四、经验体会在实践调查中，我们小组团队一起讨论定下题目，设计问卷具体事项，通过网络宣传，邀请大学生填写问卷。最后问卷汇总总结，列出数据比例分析。在利用网络设置问卷上也积累了经验。在宣传问卷时也团结了学生之间的关系，
12、锻炼了宣传能力。虽然起初的时候参加问卷的人不多，经过继续的努力宣传和邀请，达到了一定的问卷测验效果，得出较为满意的数据。实践中既有分工合作，又有各自能力展现机会，锻炼了小组的团队协作能力，调动了组员团队意识和积极性。通过团队亲自的调查分析，也看到我们自己作为大学生的消费状况和一些不合理的消费现象，值得自己反思，也希望寻找积极的途径帮助自己建立更好的理财观念。同时我们也深刻地认识到，作为当代的大学生我们不仅应该自身树立正确的价值观念，也应该在恰当的时候也应该去接触社会，积累工作经验，同时也能适当地缓解家庭经济压力，现在的我们也应该适当地独立，不宜完全地依靠父母。五、结束语改革开放以来，中国教育体
13、制也不断完善，当前在全国共有一千多所大学，大学生1500多万，占有了很大的比重。随着时代的进步，生活的提高，大学生们的求学环境也极大的改善，大学生的价值观，求学观，生存观被极大的批判，大学生在校园的消费状况成为社会关注的热点。在查找资料，并实践投入问卷调查后，总结当代大学生消费的现状，通过分析提出针对性的对策，也让我们自己反思消费情况和未来的价值取向，是团队合作的成果。通过此次社会实践调查生物信息网蛋白质组学及其研究方法与进展蛋白质是生命活动的体现者，基因的表达最后是通过蛋白质来体现的，在这个过程中，蛋白质起了连接基因与表现的功能。蛋白质是有氨基酸组成的，组成蛋白质的氨基酸的种类及排列顺序构成
14、了蛋白质的一级结构，而在一级机构基础上的多肽链本身的折叠和盘绕方式构成了蛋白质的二级结构，考虑到多肽链上原子在空间的分布，由二级结构进一步形成了蛋白质的三级结构，对于有多个亚基的蛋白质还存在四级结构。蛋白质的一级结构决定了高级结构，而高级结构则决定着蛋白质的生物学功能。如今对于蛋白质研究已经单独形成了一个活跃的生物学分支学科蛋白质组学，在蛋白质的研究中发挥着很重要的作用，下面将介绍蛋白质组学的一些基本内容及研究进展。一.产生背景1在20世纪中后期 随着DNA双螺旋结构的提出和蛋白质空间结构的解析，生命科学研究进入了分子生物学时代，对遗传信息载体DNA和生命功能的体现者蛋白质的研究，成为了其主要
15、内容。90年代初期启动的庞大的人类基因组计划在经过各国科学家多年的努力下，已经取得了巨大的成就。10多种低等模式生物的基因组序列测定L三完成；第一个多细胞生物一线虫基因组的DNA全序列测定也在1998年年底完成；人类所有基因的部分序列测定(EST)已经完成；人类基因组的全序列测定有可能提前到2003年完成。生命科学已跨入了后基因组时代。在后基因组时代，研究重心将从揭示生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对功能的研究。这种转向的第一个标志是产生了功能基因组学这一新学科，即从基因组整体水平上对基因的活动规律进行阐述。如在mRNA 水平上，通过DNA 芯片(DNA chips)和微阵列(Microa
16、rray)法等技术检测大量基因的表达模式，并取得了很好的进展。但是，mRNA的表达水平(包括mRNA的种类和含量)由于mRNA储存和翻译调控以及翻译后加工等的存在并不能直接反映蛋白质的表达水平蛋白质自身特有的活动规律，如蛋白质的修饰加工、转运定位结构形成、代谢、蛋白质与蛋白质及其他生物大分子的相互作用等均无法从在基因组水平上的研究获知。因此，对生物功能的主要体现者或执行者一蛋白质的表达模式和功能模式的研究就成为生命科学发展的必然。在此背景下80年代中期，国际上葫发了一门研究细胞内垒部蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科- 蛋白质组学(Proteomic)。蛋白质组(proteome)一词是马克.
17、威尔金斯(Marc Wilkins)最先提出来的, 最早见诸于1995年7月的“Electrophoresis”杂志上它是指一个有机体的全部蛋白质组成及其活动方式。 蛋白质组研究虽然尚处于初始阶段, 但已经取得了一些重要进展。 当前蛋白质组学的主要内容是, 在建立和发展蛋白质组研究的技术方法的同时, 进行蛋白质组分析。 对蛋白质组的分析工作大致有两个方面。 一方面, 通过二维凝胶电泳得到正常生理条件下的机体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱, 相关数据将作为待检测机体、组织或细胞的二维参考图谱和数据库。 一系列这样的二维参考图谱和数据库已经建立并且可通过联网检索。 二维参考图谱建立的意义在于为进一
18、步的分析工作提供基础。 蛋白质组分析的另一方面, 是比较分析在变化了的生理条件下蛋白质组所发生的变化。 如蛋白质表达量的变化, 翻译后修饰的变化, 或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上的定位的改变等。 细胞或组织的蛋白质不是杂乱无章的混合物, 蛋白质间的相互作用、相互协调是细胞进行一切代谢活动的基础。 蛋白质间的相互作用及作用方式同样也是蛋白质组研究所面临的问题。 研究蛋白质间的相互作用有多种方法, 常用的如酵母双杂交系统、亲和层析、免疫沉淀、蛋白质交联等。 其中, 酵母双杂交系统是当前发展迅速、应用广泛的主要方法。 二.发展趋势2国际上蛋白质组研究进展十分迅速，不论基础理论还是技术方法，
19、都在不断进步和完善。相当多种细胞的蛋白质组数据库已经建立，相应的国际互联网站也层出不穷。1996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心：Australia Proteome Analysis Facility ( APAF )。丹麦、加拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。在美国，各大药厂和公司在巨大财力的支持下，也纷纷加入蛋白质组的研究阵容。去年在瑞士成立的GeneProt公司，是由以蛋白质组数据库“SWISSPROT” 著称的蛋白质组研究人员成立的，以应用蛋白质组技术开发新药物靶标为目的，建立了配备有上百台质谱仪的高通量技术平台。而当年提出Human Protein Index
20、的美国科学家Normsn G. Anderson也成立了类似的蛋白质组学公司，继续其多年未实现的梦想。2001年4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织(Human Proteome Organization, HUPO),随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过合作的方式，融合各方面的力量，完成人类蛋白质组计划(Human Proteome Project)。三.研究技术7用于分离的双向电泳(2-DE)蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心. 双向电泳由OFarrells于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境
21、而变化. 双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离. 目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10 000个斑点(spot). 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行. 样品制备(sample prepareation)和溶解同样事关2-DE的成效，目标是尽可能扩大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白，两者联合有协同作用. 对IEF(isoelectric focusing)样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物质.
22、理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理. 近来， 在“变性剂鸡尾酒”中，含1416个碳的磺基甘氨酸三甲内盐(ASB1416)的裂解液效果最好. 而离液剂2 mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilized pH gradients)胶上的转换. 三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP )取代-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键，增强了蛋白的溶解度，并导致转至第二向的增加. 两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度，作为互补试剂会更有效. 在保持样品的完整性的前提下，可利用超离和核酸内切酶去除核酸(DNA). 除此之外，机械力被用
23、来对蛋白分子解聚，如超声破碎等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑制剂，可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的，可在其水化的过程中加样，覆盖整个IPG胶，避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失. 此外，低丰度蛋白(low abundance protein)在细胞内可能具有重要的调节功能，代表蛋白质组研究的“冰山之尖”，故分离低丰度蛋白是一种挑战. 亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量(已达到115 mg级的标准)、应用敏感性检测，可以提高其敏感性. 如一种多肽免疫2-DE印迹(MI-2DE)是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测. 提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白(basic prot
24、eins)的分离是另一难点. 由于碱性pH范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流(EOF)的产生，对PI(等电点)超过10的碱性蛋白，通过产生010%的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之. 亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性. 2-DE面临的挑战是高分辨率和重复性. 高分辨率确保蛋白最大程度的分离，高重复性允许进行凝胶间配比(match). 对2-DE而言，有3种方法分离蛋白：1)ISO-DALT(isoelectric focus)以OFarrells技术为基础. 第一向应用载体两性电解质(carrier ampholyte, CA)，在管胶内建立pH梯度. 随着聚焦时间的延长，pH梯度不稳
25、，易产生阴极漂移. 2) NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis)用于分离碱性蛋白(pH7.0). 如果聚焦达到平衡状态，碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失. 因此，在等电区域的迁移须在平衡状态之前完成，但很难控制. 3)IPG-DALT发展于80年代早期. 由于固相pH梯度(Immobilized pH gradient, IPG)的出现解决了pH梯度不稳的问题. IPG通过immobiline共价偶联于丙烯酰胺产生固定的pH梯度，克服了IEF的缺点，从而达到高度的重复性. 目前可以精确制作线性、渐进性和S型曲线，范围或宽或窄的pH梯度
26、. 新的酸性pH 35或碱性pH 611的IPG凝胶梯度联合商品化的pH 47的梯度可对蛋白质形成蛋白质组重叠群(proteomic contigs)从而有效分离. 分离后的斑点检测(spot detection)亦很重要. 所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外，还需考虑反应的线性、饱和阈/动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性. 目前，没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度和PI及分离后分析技术. 银染已成为一种检测2-DE的流行方法，可检测少到25ng的蛋白，因此较考马斯亮蓝R-250敏感. 多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色，一些有机染料不适于PVD
27、F膜. 放射性标记不依赖其代谢的活性，并仅适于对合成的蛋白质检测. 另有一种改良的2-DE(差异凝胶电泳)，即应用两种不同的染料荧光标记两个样品，使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个，避免了几种2-DE的比较，可在纳克级进行检测. 较早期相比，2-DE有两个主要的进步：首先，极高的重复性使有机体的参考图谱，可通过Internet获得，来比较不同组织类型、不同状态的基因表达；其次，高加样量使得2-DE成为一项真正的制备型技术. 鉴定技术(Identification)如果目前分离蛋白质组的最好技术是2-DE，那么随之而来的挑战是数百数千个蛋白如何被鉴定. 在这里，我们不考虑传统的蛋白鉴定方法，如
28、免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一个有机体中有意义的基因的过表达. 并不是因为这些方法无效，而是因为它们通常耗时、耗力，不适合高流通量的筛选. 目前，所选用的技术包括对于蛋白鉴定的图象分析、微量测序；进一步对肽片段进行鉴定的氨基酸组分分析和与质谱相关的技术. (1) 图象分析技术(Image analysis). “满天星”式的2-DE ，那么随之而来的挑战是数百数千个蛋白如何被鉴定. 在这里，我们不考虑传统的蛋白鉴定方法，如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一个有机体中有意义的基因的过表达. 并不是因为
29、这些方法无效，而是因为它们通常耗时、耗力，不适合高流通量的筛选. 目前，所选用的技术包括对于蛋白鉴定的图象分析、微量测序；进一步对肽片段进行鉴定的氨基酸组分分析和与质谱相关的技术. (1) 图象分析技术(Image analysis). “满天星”式的2-DE图谱分析不能依靠本能的直觉，每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定量分析. 在一系列高质量的2-DE凝胶产生(低背景染色，高度的重复性)的前提下，图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建. 首先，采集图象通常所用的系统是电荷耦合CCD(charge cou
30、pled device)照相机；激光密度仪(laser densitometers)和Phospho或Fluoroimagers，对图象进行数字化. 并成为以象素(pixels)为基础的空间和网格. 其次，在图象灰度水平上过滤和变形，进行图象加工，以进行斑点检测. 利用Laplacian，Gaussian，DOG(difference of Gaussians) opreator使有意义的区域与背景分离，精确限定斑点的强度、面积、周长和方向. 图象分析检测的斑点须与肉眼观测的斑点一致. 在这一原则下，多数系统以控制斑点的重心或最高峰来分析，边缘检测的软件可精确描述斑点外观，并进行边缘检测和邻近
31、分析，以增加精确度. 通过阈值分析、边缘检测、销蚀和扩大斑点检测的基本工具还可恢复共迁移的斑点边界. 以PC机为基础的软件Phoretix-2D正挑战古老的Unix为基础的2-D分析软件包. 第三，一旦2-DE图象上的斑点被检测，许多图象需要分析比较、增加、消减或均值化. 由于在2-DE中出现100%的重复性是很困难的，由此凝胶间的蛋白质的配比对于图象分析系统是一个挑战. IPG技术的出现已使斑点配比变得容易. 因此，较大程度的相似性可通过斑点配比向量算法在长度和平行度观测. 用来配比的著名软件系统包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，计算机方法如相似性、聚类分析、等级分类和
32、主要因素分析已被采用，而神经网络、子波变换和实用分析在未来可被采用. 配比通常由一个人操作，其手工设定大约50个突出的斑点作为“路标”，进行交叉配比. 之后，扩展至整个胶. 例如：精确的PI和MW(分子量)的估计通过参考图上20个或更多的已知蛋白所组成的标准曲线来计算未知蛋白的PI和MW. 在凝胶图象分析系统依据已知蛋白质的pI值产生PI网络，使得凝胶上其它蛋白的PI按此分配. 所估计的精确度大大依赖于所建网格的结构及标本的类型. 已知的未被修饰的大蛋白应该作为标志，变性的修饰的蛋白的PI估计约在0.25个单位. 同理，已知蛋白的理论分子量可以从数据库中计算，利用产生的表观分子量的网格来估计蛋
33、白的分子量. 未被修饰的小蛋白的错误率大约30%，而翻译后蛋白的出入更大. 故需联合其他的技术完成鉴定. (2) 微量测序(microsequencing). 蛋白质的微量测序已成为蛋白质分析和鉴定的基石，可以提供足够的信息. 尽管氨基酸组分分析和肽质指纹谱(PMF)可鉴定由2-DE分离的蛋白，但最普通的N-末端Edman降解仍然是进行鉴定的主要技术. 目前已实现蛋白质微量测序的自动化. 首先使经凝胶分离的蛋白质直接印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上，染色、切割，然后直接置于测序仪中，可用于subpicomole水平的蛋白质的鉴定. 但有几点需注意：Edman降解很缓慢，序列以每40 min 1个
34、氨基酸的速率产生；与质谱相比，Edman降解消耗大；试剂昂贵，每个氨基酸花费34$. 这都说明泛化的Edman降解蛋白质不适合分析成百上千的蛋白质. 然而，如果在一个凝胶上仅有几个有意义的蛋白质，或者如果其他技术无法测定而克隆其基因是必需的，则需要进行泛化的Edman降解测序. 近来，应用自动化的Edman降解可产生短的N-末端序列标签，这是将质谱的序列标签概念用于Edman降解，业已成为一种强有力的蛋白质鉴定. 当对Edman的硬件进行简单改进，以迅速产生N-末端序列标签达1020个/d，序列检签将适于在较小的蛋白质组中进行鉴定.若联合其他的蛋白质属性，如氨基酸组分分析、肽质质量、表现蛋白质
35、分子量、等电点，可以更加可信地鉴定蛋白质. 选择BLAST程序，可与数据库相配比. 目前，采用一种Tagldent的检索程序，还可以进行种间比较鉴定，又提高了其在蛋白质组研究中的作用. (3) 与质谱(mass spectrometry)相关的技术. 质谱已成为连接蛋白质与基因的重要技术，开启了大规模自动化的蛋白质鉴定之门. 用来分析蛋白质或多肽的质谱有两个主要的部分，1)样品入机的离子源，2)测量被介入离子的分子量的装置. 首先是基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)为一脉冲式的离子化技术. 它从固相标本中产生离子，并在飞行管中测其分子量. 其次是电喷雾质谱(ESI-MS)
36、，是一连续离子化的方法，从液相中产生离子,联合四极质谱或在飞行时间检测器中测其分子量. 近年来，质谱的装置和技术有了长足的进展. 在MALDI-TOF中，最重要的进步是离子反射器(ion reflectron)和延迟提取(delayed ion extraction)，可达相当精确的分子量. 在ESI-MS中，纳米级电雾源(nano-electrospray source)的出现使得微升级的样品在3040 min内分析成为可能. 将反相液相色谱和串联质谱(tandem MS)联用，可在数十个picomole的水平检测；若利用毛细管色谱与串联质谱联用，则可在低picomole到高femtomol
37、e水平检测；当利用毛细管电泳与串联质谱连用时，可在小于femtomole的水平检测25. 甚至可在attomole水平进行. 目前多为酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用鉴定蛋白质. 下面以肽质指纹术和肽片段的测序来说明怎样通过质谱来鉴定蛋白质. 1)肽质指纹术(peptide mass fingerprint, PMF)是由Henzel等人于1993年提出. 用酶(最常用的是胰酶)对由2-DE分离的蛋白在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的C-末端处进行断裂，断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测量(MALDI-TOF-MS，或为ESI-MS)，这一技术能够完成的肽质量可精确到0.1个
38、分子量单位. 所有的肽质量最后与数据库中理论肽质量相配比(理论肽是由实验所用的酶来“断裂”蛋白所产生的). 配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数目作一排行榜，“冠军”肽片段可能代表一个未知蛋白.若冠亚军之间的肽片段存在较大差异，且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好，则说明正确鉴定的可能性较大. 2)肽片段(peptide fragment)的部分测序. 肽质指纹术对其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白质. 为进一步鉴定蛋白质，出现了一系列的质谱方法用来描述肽片段. 用酶或化学方法从N-或C-末端按顺序除去氨基酸，形成梯形肽片段(ladder peptide). 首先以一
39、种可控制的化学模式从N-末端降解，可产生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定数目的肽质量由MALDI-TOF-MS测量. 另一种方法涉及羧基肽酶的应用，从C-末端除去不同数目的氨基酸形成肽片段. 化学法和酶法可产生相对较长的序列，其分子量精确至以区别赖氨酸(128.09)和谷氨酰胺(128.06). 或者，在质谱仪内应用源后衰变(post-source decay, PSD)和碰撞诱导解离(collision-induced dissociation, CID)，目的是产生包含有仅异于一个氨基酸残基质量的一系列肽峰的质谱. 因此，允许推断肽片段序列. 肽片段PSD的分析在MALDI反应器上能
40、产生部分序列信息. 首先进行肽质指纹鉴定. 之后，一个有意义的肽片段在质谱仪被选作“母离子”，在飞行至离子反应器的过程中降解为“子离子”. 在反应器中，用逐渐降低的电压可测量至检测器的不同大小的片段. 但经常产生不完全的片段. 现在用肽片段来测序的方法始于70年代末的CID，可以一个三联四极质谱ESI-MS或MALDI-TOF-MS联合碰撞器内来完成. 在ESI-MS中，由电雾源产生的肽离子在质谱仪的第一个四极质谱中测量，有意义的肽片段被送至第二个四极质谱中，惰性气体轰击使其成为碎片，所得产物在第三个四极质谱中测量. 与MALDI-PSD相比，CID稳定、强健、普遍，肽离子片段基本沿着酰胺键的
41、主架被轰击产生梯形序列. 连续的片段间差异决定此序列在那一点的氨基酸的质量. 由此，序列可被推测. 由CID图谱还可获得的几个序列的残基，叫做“肽序列标签”. 这样，联合肽片段母离子的分子量和肽片段距N-、C端的距离将足以鉴定一个蛋白质. (4) 氨基酸组分分析. 1977年首次作为鉴定蛋白质的一种工具，是一种独特的“脚印”技术. 利用蛋白质异质性的氨基酸组分特征，成为一种独立于序列的属性，不同于肽质量或序列标签. Latter首次表明氨基酸组分的数据能用于从2-DE凝胶上鉴定蛋白质. 通过放射标记的氨基酸来测定蛋白质的组分，或者将蛋白质印迹到PVDF膜上，在155进行酸性水解1 h，通过这一
42、简单步骤的氨基酸的提取，每一样品的氨基酸在40min内自动衍生并由色谱分离，常规分析为100个蛋白质/周. 依据代表两组分间数目差异的分数，对数据库中的蛋白质进行排榜，“冠军”蛋白质具有与未知蛋白质最相近的组分，考虑冠亚军蛋白质分数之间的差异，仅处于冠军的蛋白质的可信度大. Internet上存在多个程序可用于氨基酸组分分析，如AACompIdent，ASA，FINDER，AAC-PI，PROP-SEARCH等，其中，在PROP-SEARCH中，组分、序列和氨基酸的位置被用来检索同源蛋白质. 但仍存在一些缺点，如由于不足的酸性水解或者部分降解会产生氨基酸的变异. 故应联合其他的蛋白质属性进行鉴
43、定. 生物大分子NMR技术与X一光衍射不同，可在溶液中测定大分子三维结构的高场NMR仪，不要求提供晶体样品，仅需将很小体积高浓度蛋白溶液放置于强磁场中。因此，该技术已成为结构蛋白质组学研究的关键性技术。NMR法也可用于测定溶液中接近于生理状态的蛋白质构象， 如有人用”C，-5N，2H标记NMR，研究小于40kD的蛋白质小分子，蛋白质作用的动力学过程， 以及与蛋白质活性功能紧密相关的可变尾部构蒙。NMR法虽对样品无破坏作用，然而仍有一些1 足之处，如实验时间长，蛋白质标记过程复杂，无法鉴定较大蛋白质结构。四.研究新前沿定量蛋白质组学5定量蛋白质组学(quantitmlive proteomics
44、)，即对蛋白质的差异表达进行准确的定量分析。这一概念的提出，标志着蛋白质组技术的不断改进和完善，蛋白质组学研究已从对蛋白质简单的定性向精确的定量方向发展。定量蛋白质组学已逐渐成为了蛋白质组研究的新前沿。随着2DEMS途径自动化的不断完善，新的研究方案也不断提出，如多维LC-MSMS途径在对细胞的蛋白质组进行研究同时，对功能蛋白质组研究显得更为重要。因为体内发挥重要调节功能的往往是一一些低丰度的蛋白质，如何检测这些蛋白质，并对其准确定量，已成为定量蛋白质组学研究中必须解决的一大难题，也将成为今后蛋白质组技术方法学上研究重点之一。通过放射性同位素或 N代谢标记蛋白，而后经2DEMS途径，可以大范围
45、地对蛋白质表达定量分析。但由于2DE本身的局限性(一般说来，分析型2DE的上样量至多达到nag级)，使得想通过这一途径来分析定量低丰度蛋白质变得十分困难。相比而言，ICAT战略从理论上不受上样量的限制因此，ICAT方法对低丰度的蛋白质(密码子偏依值小于01)也能准确的鉴别与定量，这就为蛋白质组学的进一步的发展提供了广阔的空间。五.数据库介绍6随x晶体衍射分子结构测定技术的发展，蛋白质组数据库日益丰富完善起来。林木类第一个公开的数据库 海生松数据库以及拟南芥质膜蛋白质组数据库的公布，为植物蛋白组学的研究提供了丰富的信息和数据。PDB蛋白数据库(Protein Data Bank，http:/WW
46、Wrcsborgpdb)是国际上惟一的生物大分子结构数据档案库，由美国纽约Brookhaven国家实验室于1971年创建。PDB收集了很多X光晶体衍射和核磁共振(NMR)的数据，经过整理和确认后存档而成。20世纪90年代以来，随着多维核磁共振溶液构象测定方法的成熟，使那些难以结晶的蛋白质分子的结构测定成为可能，数据库的数据量呈直线上升。目前，PDB数据库中已经存放了22 611套原子坐标，其中大部分为蛋白质。Scop(Structural Classification of Proteins，http：scopmrcimbcamacukscop)蛋白质结构分类数据库由英国医学研究委员会(MRC
47、)分子生物学实验室和蛋白质工程中心开发，拥有蛋白质结构数据库分类、检索和分析系统，依据三维折叠模式和进化关系划分已知结构的蛋白质。另一个著名的蛋白质分类数据库CATH(http：，wwwbiochemuc1acukbsmcath_ newindexhtml)，其名称是由类型(c l ass)、构架(architecture)、拓扑结构(topology)和同源性(homology)的第一个字母缩写而来的，它由英国伦敦大学开发和维护。由欧洲分子生物学实验室提供的PHD的web服务(http：wwwemblheidelbergdepredictproteinpredictproteinhtm1)，
48、可对蛋白质序列和结构进行分析，当用户在此网页上提交序列后，可以获得此蛋白序列的许多相关信息，如功能位点、结构域、基序、主要的二级结构、二硫键等。SW ISS一3DIM AGEfDatabase of annotated 3D images，http：expasyhcugechpubgraphics)是注释的蛋白质三维图像数据库， 由欧洲分子生物学实验室提供的对蛋白质序列和结构进行分析的Web服务，(http：wwwemblheidelbergdepredictproteinpredictproteinhtm1)在此网页上提交序列后，可以获得与此序列相关的许多蛋白二级结构信息，如结构域、基序、功能位点等。通过瑞士生物信息学研究所网址(http：wwwexpasyorgswissmodSWlSSMODELhtm1)可根据提交的蛋白质序列搜索同源性
