1、.细胞工程实验报告专业：生物技术 班级：0801 姓名：励丹 学号：30804305一、实验目的1、了解动物细胞培养的相关实验器材以及实验前器材的清洗与消毒、无菌室灭菌与消毒等基本方法，以建立起无菌操作的概念。2、了解和掌握动物细胞原代培养的基本方法，熟悉组织块法和消化法培养的基本操作过程。初步掌握无菌操作技术。3、学习与了解细胞超低温冻存于复苏的基本原理，初步掌握培养细胞常规超低温冻存于复苏以及玻璃化超低温冻存于复苏的方法。4、掌握ELISA测定抗体效价的方法，细胞的超低温冻存和复苏，及MTT法测定细胞活性的方法。5、学习和掌握制备饲养层细胞的方法，为杂交瘤细胞的制备做准备。6、学习从脾脏组
2、织制备免疫细胞的方法，从免疫脾脏中制备免疫细胞悬液，用于杂交瘤细胞的融合。7、学习和掌握动物细胞融合的基本方法，通过免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，并进行选择。8、学会细胞形态的观察和分析，细胞技术等细胞培养中常见的问题。二、实验原理1、原代培养 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后直到第一次传代为止。原代培养首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织或器官，切成一定大小的组织块，直接或经消化分散成单个游离的细胞，在人工培养条件下，使其不断地生长、繁殖。2、细胞活性测定MTT法MTT法是利用细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶四氮唑蓝还原成难溶的蓝紫色结
3、晶甲瓒，经二甲基亚砜（DMSO）溶解后，在490nm处测吸收值，其吸收值可间接反映细胞的活性状态及活细胞数量。3、培养细胞的超低温冻存于复苏 为了保持细胞株（系）遗传的稳定性以及非连续使用细胞的长期保存，建立了细胞超低温冻存于复苏技术。目前细胞超低温冻存技术主要有两种方法，即常规超低温冻存和玻璃化超低温冻存。活细胞在超低温下克服了分子间的热运动，因而可长期保存而不影响活力。在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞
4、内水份在冻结前透出细胞。贮存在130以下的低温中能减少冰晶的形成。4、饲养层细胞的制备在体外培养细胞实验中，对于难养的细胞或者数量较少的细胞，常常需要预先在培养瓶或培养板底部加入一些活的原代细胞或者静息的肿瘤细胞以辅助目的细胞的生长，这就是饲养层细胞。它可能在饲养细胞的生长过程中会释放一些细胞生长刺激因子或提供细胞接触的信号。5、免疫脾细胞的制备小鼠经抗原多次免疫后，可从脾脏组织细胞分裂和分化出较多能分泌相应抗体的B淋巴细胞，脾脏内细胞连接不紧密可通过机械分离和过滤网筛选，将这些细胞制备成游离的单个细胞悬液。6、杂交瘤细胞的制备（细胞融合） 通过对免疫动物B细胞和某一个永久细胞系进行融合，杂交
5、后代称之为杂交瘤。杂交瘤细胞可以将分泌特异性抗体B细胞的遗传特性和骨髓瘤细胞系体外增殖的遗传特性合二为一。一种淋巴细胞克隆只产生一种特异性抗体；细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持亲代双方的特性；杂交瘤细胞的筛选，体外培养大量增殖，获得所需抗体。7、ELISA检测使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的
6、酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 三、实验内容1、动物细胞培养技术2、杂交瘤技术与单克隆抗体制备3、细胞工程相关技术1）动物细胞培养实验器材的准备无菌室：首次启用的无菌室一般可采用福尔马林熏蒸（56m2无菌室用KMnO4 50g，倒入100ml甲醛（用搪瓷盘），冒浓烟，24hr，氨水中和至无甲醛味），经常使用的无菌室在每次实验前必须开启紫外灯照射0.5至l小时，然后避光0.5至l小时后
7、方可进入操作。培养器材的消毒：干热灭菌法：玻璃器皿、金属器具等的消毒方法，140150，23小时；湿热灭菌法：橡胶制品、无菌衣、帽和口罩以及除菌过滤器的清毒，高压蒸汽灭菌15磅2030分钟；紫外线照射灭菌：多孔培养板的灭菌30分钟。抽滤除菌：培养基等（培养基通过0.22过滤装置除菌）2）杂交瘤技术与单克隆抗体制备1、小鼠的免疫 方法：脾脏直接注射：一般免疫后34天即可制备抗体。l 其它途径注射：一般采用间隔免疫的方法，分3次，间隔23周进行免疫。 步骤：取绵羊静脉血0.2mL（加肝素或枸橼酸钠抗凝）l 用0.9NaCl或PBS 1000 1500rpm离心5分钟涤洗3次，收集血细胞。l 血球计
8、数板计数，用0.9NaCl或PBS调整细胞浓度至4107个/ml（10个/小格）。l 向小鼠腹腔注射血细胞悬液0.5ml 。每隔15天重复注射作加强免疫，共重复2次，第2次加强免疫后10天，检测血清效价，若血清效价低则要继续免疫。l小鼠处死前23天加强免疫1次，以活化B淋巴细胞。注：细胞计数：一个大方格被分成16个中方格。每一个大方格边长为1mm，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。一个大方格被分成16个中方格。每一个大方格边长为1mm，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。细胞浓度（个/ml）=细胞
9、数/体积即：细胞浓度（个/ml）= 一个大格的细胞数104。打入的免疫红细胞数要在一定范围内，细胞数量太多会免疫耐受；太少得到的免疫细胞数少。2、小鼠血清的制备取五只没有免疫过的小鼠-每只小鼠眼球取血0.5mL以上于1mLEP管中-小鼠短颈处死后，放于装有75%酒精的烧杯中消毒灭菌，带入无菌室备用取出血清放于37水浴保温30min2000转离心10min取上清于干净的离心管中，作为ELISA的阴性对照取五只免疫过的小鼠同上操作取血清作为ELISA的阳性对照3、单克隆抗体的制备流程4、骨髓瘤细胞的培养1、选择生长旺盛，形态良好的细胞l2、将上清倒入离心管内，剩余贴壁的细胞用0.02EDTA消化液
10、消化细胞5分钟后倒入同一离心管，10001500rpm离心5分钟，收集细胞。l3、加6mL含10小牛血清的DMEM培养液悬浮细胞，分装于两个细胞培养瓶，5CO2培养箱37培养。5、饲养层细胞的制备1、每组1只小鼠，断颈处死后浸泡在75乙醇消毒5分钟。 2、在无菌室内小心剪开小鼠腹部皮肤，暴露腹腔，用注射器腹腔注射34ml 1640培养液，按摩片刻。 3、左手用镊子夹起腹腔肌肉，右手用剪刀剪开一个小口，小心用吸管吸出腹腔液体于离心管。 4、低速离心洗涤细胞一次后，用1215ml 1640培养液悬浮细胞（5104），取100200 ml滴96孔板（一般用吸管滴23滴）。5、免疫脾细胞的制备1.将免疫过并取完血清后的浸泡在75乙醇中的小鼠带入无菌室。2.小心剪开腹腔，取出脾脏。3.用一次性注射器将脾脏刺几个洞，再吸34mLPBS液
